Tetracyklinem indukovatelné systémy byly u kvasinek hojně využívány ke studiu řízení genové transkripce v jednotlivých buňkách15,16,17,18,19,20,21,22. Pro využití rtTA v tomto kontextu jsme vytvořili dva silné promotory reagující na doxycyklin se třemi (PTET3) nebo čtyřmi (PTET4) vazebnými místy pro rtTA a použili optimalizovanou variantu rtTA-M27 k řízení exprese zeleného fluorescenčního proteinu (yeGFP)23 z těchto promotorů (obr. 1a). Expresní kazeta rtTA/PTET-yeGFP byla integrována v jediné kopii do genomu kvasinek. Varianta M2 je totožná s variantou nalezenou v expresních systémech Tet-ON Advanced společnosti ClonTech.
rtTA-M2 má významnou aktivitu v nepřítomnosti indukce doxycyklinem.
(a) Schéma experimentálního uspořádání, kde je rtTA-M2 exprimován z konstitutivních promotorů PMYO2 nebo PTDH3 a yeGFP je exprimován z promotoru reagujícího na tet. (b) Aktivace rtTA-M2 exprimovaného z PMYO2 nebo PTDH3 v závislosti na dávce doxycyklinu (průměr +/- s.e.m tří technických opakování). AutoFL jsou kvasinkové buňky divokého typu BY4742. (c) Distribuce fluorescence jednotlivých buněk získané z buněk nesoucích systém PMYO2-rtTA při různých koncentracích doxycyklinu. Postupně tmavší odstíny šedé odpovídají 0,25, 1, 5 a 100 μg/ml doxycyklinu. AutoFL jsou kvasinkové buňky divokého typu BY4742. d) Sloučené snímky světlého pole a fluorescence kvasinkových buněk divokého typu BY4742 nebo neindukovaných buněk nesoucích systém PMYO2-rtTA.
Problém děravé transkripce cílových genů je obzvláště hluboký, pokud je rtTA exprimován ve vysokých hladinách. To je znázorněno na obr. 1b, který ukazuje křivky odezvy na dávku doxycyklinu PTET3, když je rtTA-M2 exprimován ze silného promotoru PTDH3. Fluorescence byla velmi vysoká, když byly buňky vystaveny nasycujícímu množství doxycyklinu. Nicméně kvůli netěsné transkripci z promotoru PTET3 byl dynamický rozsah systému poměrně chudý, přičemž maximální exprese byla ~17krát vyšší při plné indukci ve srovnání s nepřítomností doxycyklinu.
V souladu s modelem, kdy má transaktivátor značný aktivační potenciál v neindukovaném stavu, exprese rtTA-M2 ze slabého promotoru PMYO2 podstatně snížila fluorescenci v nepřítomnosti doxycyklinu. Ačkoli u tohoto systému nebylo pozorováno plné nasycení, snížení netěsné exprese vedlo k výraznému zlepšení dynamického rozsahu a indukce doxycyklinem vedla k ~200násobnému zvýšení fluorescence. I přes toto zlepšení však data z průtokové cytometrie (obr. 1c) i fluorescenční mikroskopie (obr. 1d) ukázala, že neindukovaný rtTA-M2 způsobuje významnou expresi reportérového genu, i když je transaktivátor exprimován ze slabého promotoru.
Při počátečním testování dvanácti klonů nesoucích systém PTDH3-rtTA-M2 jsme náhodou zjistili, že jeden z nich vyzařuje nečekaně nízkou fluorescenci v nepřítomnosti doxycyklinu, ale téměř normální fluorescenci při plné indukci (obr. 2a). Následné sekvenování identifikovalo mutaci jednoho nukleotidu, guaninu na thymin, která mění glycin (GGG) na valin (GTG) na zbytku 72 v proteinu transaktivátoru. Western blot analýza ukázala, že tato záměna nemá vliv na množství proteinu (obr. 2a, vložka, podrobnosti viz doplňkový obr. S1), a rekonstrukce expresního systému potvrdila, že jediná mutace guaninu na thymin je zodpovědná za změny pozorované v odpovědi na dávku doxycyklinu (údaje nejsou uvedeny).
Mutace glycinu 72 v rtTA-M2 snižuje bazální aktivitu na nedetekovatelnou úroveň.
(a) Aktivace variant rtTA-M2 v závislosti na dávce doxycyklinu vyjádřená z PTDH3 (průměr +/- s.e.m tří technických opakování). AutoFL jsou kvasinkové buňky divokého typu BY4742. Vložený western blot (oříznutý) porovnávající množství proteinů rtTA-M2 i mutanta G72V. Všechny vzorky byly připraveny a provedeny za identických experimentálních podmínek. (b) Distribuce fluorescence jednotlivých buněk získané z buněk nesoucích systém PTDH3-rtTA(G72V) při různých koncentracích doxycyklinu. AutoFL jsou kvasinkové buňky divokého typu BY4742. Postupně tmavší odstíny šedé odpovídají 1, 2,5, 5 a 100 μg/ml doxycyklinu. (c) Sloučené snímky světlého pole a fluorescence neindukovaných buněk nesoucích systémy PTDH3-rtTA-M2 nebo PTDH3-rtTA(G72V). (d) Kreslené znázornění dimeru TetR, ve kterém je každý protomer zbarven jinak (žlutě a tyrkysově). Sekundární struktura je označena a G72 je znázorněn jako koule.
Systém PTDH3-rtTA-M2(G72V) má pozoruhodný dynamický rozsah a vykazoval ~500násobné zvýšení intenzity fluorescence, když byly buňky indukovány vysokou dávkou doxycyklinu ve srovnání s žádnou indukcí (obr. 2b). Emise fluorescence detekovaná průtokovou cytometrií je navíc nerozlišitelná od buněčné autofluorescence v nepřítomnosti doxycyklinu a varianta si zachovává odstupňovanou indukční odpověď původního transaktivátoru. Exprese reportéru z neindukovaného kmene rtTA-M2(G72V) byla navíc nedetekovatelná pomocí fluorescenční mikroskopie i při nastavení přístroje, kdy neindukovaný kmen rtTA-M2 dával silný sytící se signál (obr. 2c).
Abychom získali představu o tom, jak může mít jediná mutace tak drastický dopad na dynamický rozsah rtTA-M2(G72V), zkoumali jsme, kde se daný zbytek nachází v kontextu trojrozměrné struktury proteinu. Struktura rtTA-M2 ani jiných variant rtTA nebyla dosud vyřešena. Nicméně vzhledem k tomu, že 203 z 207 aminokyselin v doméně TetR rtTA zůstalo zachováno7 , struktura TetR24 s vysokým rozlišením umožňuje nahlédnout do struktury DNA vazebné domény rtTA. Ve struktuře TetR mapuje glycinový zbytek 72 flexibilní smyčku umístěnou mezi α-šroubovicemi α4 a α5, což je oblast přemosťující DNA vazebnou doménu represoru (α1-α3) a jeho tetracyklinovou vazebnou oblast (α5-α9)24,25 (obr. 2d). To naznačuje, že substituce, která zavádí nepolární postranní řetězec, vyvolává konformační změny dlouhého dosahu, které v konečném důsledku ovlivňují aktivitu transaktivátoru, pravděpodobně rigidizací jeho terciární struktury.
Pro ověření této hypotézy jsme vytvořili další dvě varianty, ve kterých byl glycinový zbytek mutován na alanin nebo prolin. Tyto mutace zachovávají nepolární povahu valinového zbytku, ale zavádějí postranní řetězce různé velikosti. Předpokládali jsme, že jediný methylový postranní řetězec alaninu bude méně účinný při prevenci neindukované aktivity než velký cyklický postranní řetězec prolinu. Vytvořili jsme také β-estradiolem indukovatelný expresní systém26 , abychom získali přímou kontrolu nad expresí rtTA-M2, a použili jsme promotor s dodatečným vazebným místem TetR, PTET4, abychom zvýšili schopnost rtTA vázat DNA. Expresní systém je schematicky znázorněn na (obr. 3a). Analýzou western blotu jsme potvrdili, že čtyři varianty rtTA jsou při plné indukci β-estradiolem exprimovány v podobných hladinách (obr. 3b, podrobnosti viz doplňkový obr. S2) a že fluorescence kmene bez rtTA má expresi reportéru nerozeznatelnou od divokého typu kmene kvasinek BY4742, což dokazuje, že neexistuje žádná exprese reportéru na pozadí z PTET4 (doplňkový obr. 3b). S3).
Nepolární postranní řetězce na zbytku 72 jsou klíčovým faktorem určujícím bazální aktivitu.
(a) Schéma genové sítě, kde jsou varianty rtTA-M2 exprimovány z promotoru indukovatelného β-estradiolem a yeGFP je exprimován z promotoru reagujícího na tet. (b) Western blot (oříznutý) porovnávající množství proteinů všech čtyř variant rtTA při indukci 1000 nM β-estradiolu nebo bez indukce. Všechny vzorky byly připraveny a provedeny za stejných experimentálních podmínek. (c) Sloučené snímky světlého pole a fluorescence všech čtyř variant rtTA indukovaných 1000 nM β-estradiolu bez indukce doxycyklinem. (d) Základní aktivita variant rtTA v závislosti na úrovni jejich exprese závislé na β-estradiolu (průměr +/- s.e.m tří technických opakování). Ve vložce jsou histogramy exprese reportérů pro různé varianty rtTA. (e) Na dávce doxycyklinu závislá aktivace variant rtTA-M2 exprimovaných všudypřítomně v 1000 nM β-estradiolu (průměr +/- s.e.m ze tří technických opakování).
Podle očekávání vykazovala alaninová varianta vyšší únikovou expresi než valinová varianta a prolinová varianta měla fluorescenci, která byla nerozlišitelná od buněčné autofluorescence měřené průtokovou cytometrií. To je patrné ze snímků fluorescenční mikroskopie získaných při nastavení přístroje, kdy kmen nesoucí původní variantu M2 dává silný fluorescenční signál při plné indukci β-estradiolem (obr. 3c), a z měření fluorescence průtokovou cytometrií při různé indukci β-estradiolem (obr. 3d).
Pozoruhodné je, že aminokyselinové záměny, které výrazně snižují bazální expresi reportérového genu, mají minimální vliv na aktivaci transkripce rtTA při plné indukci β-estradiolem a doxycyklinem. To je znázorněno na obr. 3E, který zobrazuje křivky závislosti dávky na odpovědi pro čtyři varianty G72-M2 měřené při různém množství doxycyklinu při plné indukci β-estradiolem. Aminokyselinové záměny však ovlivňují citlivost na doxycyklin. V našich experimentech (obr. 3e) měla varianta M2 nejvyšší citlivost s poloviční maximální účinnou koncentrací (EC50) ~0,06 μg/ml, zatímco alaninová varianta (EC50 ~0,2 μg/ml), valinová varianta (EC50 ~1,0 μg/ml) a prolinová varianta (EC50 ~1.5 μg/ml) vyžadovaly k dosažení maximální expresní kapacity postupně vyšší koncentrace doxycyklinu.
Pro potlačení vlivu mutace G72 na citlivost k doxycyklinu jsme zavedli další mutace v doméně TetR, u nichž bylo nedávno prokázáno, že zvyšují citlivost k doxycyklinu10,11,27. Vliv mutace G72 na citlivost k doxycyklinu se projevuje i v případě, že se v doméně TetR objeví další mutace. Konkrétně jsme zkoumali vliv zavedení mutací zvyšujících citlivost (SE) V9I, F67S, F86Y a R171K.
Obrázek 4A,B ukazuje, že SE mutace zlepšují citlivost variant rtTA M2 SE-G72P a SE-G72A k doxycyklinu. Pokud jsou varianty rtTA exprimovány ve vysokých hladinách z plně aktivovaného promotoru indukovatelného β-estradiolem (obr. 3a), zavedení SE mutací snižuje EC50 doxycyklinu z ~1,5 μg/ml na ~0,1 μg/ml u varianty G72P (obr. 4a) a z ~0,2 μg/ml na ~0,02 μg/ml u varianty G72A (obr. 4b). Tento účinek se projevil bez znatelné změny exprese reportéru při plné indukci doxycyklinem a neohrozil dynamický rozsah varianty SE-G72P. Zajímavé však je, že mutace SE způsobily významnou ztrátu dynamického rozsahu pro variantu SE-G72A zvýšením exprese reportérového genu v nepřítomnosti doxycyklinu.
Citlivost nových variant rtTA na doxycyklin lze zlepšit přidáním mutací zvyšujících citlivost.
(a,b) Aktivace variant rtTA exprimovaných všudypřítomně v 1000 nM β-estradiolu v závislosti na dávce doxycyklinu (průměr +/- s.e.m tří technických opakování). (c-f) Heatmapy zobrazující expresi reportérů (arbitrární jednotky) v závislosti na expresi β-estradiol-dependentního transaktivátoru a indukci doxycyklinu.
Pro další zkoumání vztahu mezi úrovní exprese rtTA, EC50 doxycyklinu a základní aktivitou jsme zkoumali vliv současného střídání β-estradiolu a indukce doxycyklinu na expresi reportérových genů. Zkoumali jsme čtyři různé varianty M2: původní variantu, orginální variantu s mutacemi SE, variantu G72P a variantu SE-G72P.
Dvourozměrný povrch dávka-odpověď pro původní variantu M2 obsahuje tři odlišné oblasti exprese reportérového genu odpovídající nízké, střední a vysoké expresi reportérového genu. Tyto oblasti jsou na obr. 4c-f označeny jako I, II a III. V oblasti III je exprese reportéru maximální, což závisí jak na úrovni exprese rtTA, tak na úrovni indukce doxycyklinu. V oblasti II je exprese reportéru relativně vysoká, i když je indukce doxycyklinem nízká. Oblast I je oblast, kde je exprese reportéru nízká v důsledku nízké hladiny β-estradiolu nebo nízké indukce doxycyklinu.
Samotné mutace SE (obr. 4d) dramaticky zvyšují expresi reportéru v části oblasti I a v celé oblasti II. To potvrzuje, že tyto mutace mohou zvýšit citlivost v úzkém rozmezí hladin exprese rtTA, ale také způsobují významné zvýšení aktivity rtTA v neindukovaném stavu. V kontrastu s tím samotná mutace G72P (obr. 4e) dramaticky snižuje expresi reportéru v celé oblasti II a v části oblasti III. To potvrzuje, že hluboký účinek této mutace na aktivitu rtTA v neindukovaném stavu souvisí s celkovou ztrátou citlivosti na doxycyklin.
Obrázek 4f ukazuje účinek kombinace mutací SE a G72P. Ve srovnání s variantou SE (obr. 4d) přidání mutace G72P působí proti zvýšení exprese reportéru způsobené mutacemi SE v oblasti I a snižuje expresi reportéru v této oblasti na nedetekovatelnou úroveň. V porovnání s variantou G72P (obr. 4e) navíc přidání mutací SE téměř zcela obnoví ztrátu exprese reportéru v oblasti III. Jinými slovy, citlivost je zlepšena, aniž by došlo k zavedení netěsné exprese cílového genu na jakékoliv úrovni exprese transaktivátoru.