Anwendung von Mikrosatelliten-Loci zur molekularen Identifizierung von Elite-Genotypen, zur Analyse der Klonalität und der genetischen Vielfalt der Espe Populus tremula L. (Salicaceae)

Abstract

Testsysteme zur molekularen Identifizierung von mikrovermehrten Elite-Genotypen der Espe (Populus tremula L.) wurden auf der Grundlage von Mikrosatelliten-Loci (SSR) entwickelt. Von den 33 getesteten Mikrosatelliten-Loci wurden 14 ausgewählt, da sie sich durch eine nachhaltige PCR-Amplifikation auszeichnen und eine erhebliche Variabilität in den Eliteklonen der Espe aufweisen, die für die Anlage von Schnellumtriebsplantagen bestimmt sind. Alle acht getesteten Klone wiesen unterschiedliche Multilocus-Genotypen auf. Unter 114 Bäumen aus drei einheimischen Referenzbeständen, die sich in der Nähe der angelegten Plantagen befanden, wurden 80 Haplotypen identifiziert, während einige wiederholte Genotypen auf natürliche Klone zurückgeführt wurden, die als Ergebnis des Austriebs entstanden waren. Der ausgewählte Satz von SSR-Markern zeigte eine zuverlässige Identifizierung von Individuen mit einer geringen Wahrscheinlichkeit des Auftretens identischer Espen-Genotypen (mindestens 1 × 10-4 für nicht verwandte bzw. verwandte Individuen). Es werden Fallstudien beschrieben, die die praktische Anwendung des Testsystems demonstrieren, einschließlich der Analyse der klonalen Struktur und des Niveaus der genetischen Vielfalt in drei natürlichen Espenbeständen, die in den Regionen wachsen, in denen Plantagen aus Eliteklonen angelegt wurden.

1. Einleitung

Die fortschreitende Degradierung der einheimischen Wälder weltweit durch Übernutzung erfordert die Einführung intensiver Formen der Forstwirtschaft, die nicht nur den wirtschaftlichen Effekt, sondern auch die Erhaltung der genetischen Ressourcen der Gehölze fördern. Diese Aufgabe besteht in der Gewinnung und Erhaltung von Elite-Genotypen von Waldbäumen, die für schnell umlaufende Forstplantagen bestimmt sind. Neue hochproduktive und gegenüber abiotischen Faktoren, Schädlingen und Krankheitserregern widerstandsfähige Züchtungen und Sorten entstehen durch Züchtung, Mutationsselektion und/oder Gentechnik. Die klonale Vermehrung dieser herausragenden Individuen gewährleistet die Fixierung ihrer nützlichen Eigenschaften sowohl für weitere Züchtungsversuche als auch für die Anlage gezielter Forstplantagen. Insbesondere die mikroklonale Vermehrung über In-vitro-Kulturen ermöglicht ein schnelles, großflächiges und kostengünstiges Klonen von Individuen mit gewünschten Merkmalen, vor allem dann, wenn die herkömmliche Knospung oder Pfropfung nicht möglich ist oder einen besonderen Aufwand erfordert.

Da morphologisch und anatomisch unterschiedliche Pflanzenklone ähnlich aussehen können, ist es von entscheidender Bedeutung, diese zuverlässig zu identifizieren und voneinander sowie von Artgenossen oder Vertretern anderer nahe verwandter Arten zu unterscheiden. In der Forstwirtschaft ist das Problem der Identifizierung von Individuen besonders wichtig, da das äußere Erscheinungsbild von Bäumen stark von Umweltparametern abhängt. In bestimmten Stadien der natürlichen Ontogenese von Waldbäumen, z. B. bei Sämlingen und Schösslingen, und insbesondere als Kallus oder Explantat in der vitro-Zellkultur, können Individuen nicht nur individuell, sondern auch im Hinblick auf die Artdiagnose ununterscheidbar sein. Die lange Generationszeit und die ontogenetisch späte Reifung machen die Aufgabe der genetischen Passportierung von Eliteklonen bei Gehölzen zu einer echten Herausforderung. Der komplexe mehrstufige Prozess der Gewinnung, Vermehrung und Einführung von Elitesorten durch Züchtung oder Gentechnik erhöht die Wahrscheinlichkeit verschiedener Fehler.

Molekulargenetische Marker (MGM) erwiesen sich als sehr effiziente Werkzeuge zur individuellen Identifizierung. Unter den verschiedenen MGM-Klassen entsprechen Mikrosatelliten oder einfache Sequenzwiederholungen (SSR) aufgrund ihrer Spezifität, Kodominanz, Selektionsneutralität, ausreichenden Allelvielfalt und Heterozygotie durch hohe Mutationsrate am besten den Anforderungen von Prüfsystemen zur Identifizierung. Darüber hinaus können SSR-Marker und PCR-Primer für ihre Amplifikation aufgrund der relativen Genomkonservativität innerhalb von Pflanzengattungen und -familien von einem Taxon auf ein anderes übertragen werden.

Bei mehreren Pappelarten wurde der erfolgreiche DNA-Fingerabdruck und die Differenzierung von Klonen, Sorten und Varietäten durch molekulare Marker, einschließlich SSR-Loci, nachgewiesen.

In diesem Beitrag berichten wir über die Entwicklung eines SSR-basierten Testsystems für die molekulargenetische Identifizierung von mikrovermehrten Elite-Genotypen der Espe, Populus tremula L., für die Einrichtung schnell wachsender Zielwaldplantagen in mehreren Regionen der Russischen Föderation und stellen die Ergebnisse seiner Anwendung für die Unterscheidung einzelner Genotypen, Studien der klonalen Struktur in natürlichen Espenbeständen und die Schätzung der genetischen Variabilität in Populationen vor.

2. Material und Methoden

Die Entwicklung des Testsystems zur Identifizierung von Elite-Genotypen umfasste die Auswahl eines spezifischen Markersatzes, der den Anforderungen einer hochauflösenden Unterscheidung von Klonen entspricht, und die Prüfung seiner Zuverlässigkeit und Identifizierungskraft an einem Satz von Elite-Genotypen und einer ausreichenden Anzahl von Vertretern einer untersuchten Art.

2.1. Pflanzenmaterial

Die für die Entwicklung der Testsysteme für die molekulare Identifizierung verwendeten Elite-Espen- und Hybridklone wurden aus mikrovermehrten Zellkulturen gewonnen, die in der Zweigstelle Pushchino des Shemyakin- und Ovchinnikov-Instituts für Bioorganische Chemie der Russischen Akademie der Wissenschaften (Pushchino, Russland) gepflegt werden. Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.

Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.

Abbildung 1

Karte der Lage der Plantagen aus Eliteklonen und entsprechenden einheimischen Espenbeständen, die als Referenzpopulationen verwendet wurden. (1) Prisady, (2) Voronezh, und (3) Yoshkar-Ola.

Prisady. Versuchsfläche 1 km westlich der Siedlung Prisady im Serpukhovsky Raion (Bezirk) der Moskauer Oblast‘ (Russland). Die Blätter von 52 jungen oder mittelalten (ca. 10-25 Jahre) Espen aus einem natürlichen, mehrjährigen Bestand in unmittelbarer Nähe (1 km) zu dieser Parzelle wurden als Referenzpopulation verwendet.

Voronezh. Siebzehn Bäume wurden in einem an die Versuchsfläche angrenzenden Bestand in der Oblast Woronesch beprobt. Weitere 13 Bäume wurden entlang des Ufers des Voronezh-Flusses innerhalb der Stadt Voronezh in der Nähe der Plantage gesammelt.

Yoshkar-Ola. Ein junger einheimischer Espenbestand diente als Referenzpopulation für eine Versuchsfläche in der Nähe der Stadt Yoshkar-Ola, Republik Mari-El. Es wurden Blätter von 32 Bäumen gesammelt.

Um die gelegentliche Beprobung von Individuen mit vegetativem Ursprung (durch Austrieb) zu minimieren, sammelten wir Blätter von Bäumen in einem Abstand von mindestens 15-20 m voneinander. Dieser Ansatz wurde gewählt, um Referenzproben von überwiegend offen bestäubten Sämlingen mit maximaler genetischer Vielfalt zu erhalten. Ausschließlich aufgrund des äußeren Aussehens der Bäume und des Abstands zwischen den Bäumen ließ sich die Entnahme von Zweigsprossen nicht vermeiden, was durch die anschließende genetische Analyse bestätigt wurde.

Triebe mit Blättern wurden mit einer mechanischen Schere mit einem Aluminium-Teleskopmast abgeschnitten. Die gesammelten Triebe mit Blättern wurden bis zur Verarbeitung in Plastikbeuteln für maximal 6 Tage bei +4°С gelagert. Die Probenvorbereitung umfasste die DNA-Extraktion und die Aufbewahrung der Blattgewebefragmente in beschrifteten Zip-Beuteln mit Kieselgel für die Langzeitlagerung. Außerhalb der aktiven Vegetationsperiode können schlafende vegetative Knospen erfolgreich für die DNA-Extraktion verwendet werden.

2.2. DNA-Extraktion

Zur DNA-Extraktion wurden ca. 350-500 mg Blattfragmente von in vitro auf einem speziellen Medium (REF) in Petrischalen wachsenden Explantaten verwendet.

Bei Bäumen aus einheimischen Populationen extrahierten wir DNA aus 350-500 mg Fragmenten von frischem oder 200-300 mg von auf Kieselgel getrocknetem Blattgewebe mit einer modifizierten Cethyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Methode.

2.3. Mikrosatelliten-Analyse

Mikrosatelliten oder SSR stellen eine Klasse von tandemartig wiederholten DNA-Sequenzen mit kurzen (1-6 Nukleotidpaare, bp) Motiven dar, die sich aufgrund einer hohen Mutationsrate in der Kopienzahl zwischen Individuen unterscheiden. Mehrere Allele, die in der Regel in kodominanten Mikrosatelliten-Loci zu finden sind, schaffen eine große Vielfalt einzigartiger genotypischer Kombinationen, was ihre zuverlässige Identifizierung gewährleistet, insbesondere wenn eine ausreichende Anzahl von Loci verwendet wird. Technisch gesehen erfordert die Analyse des SSR-Polymorphismus lediglich eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und eine anschließende Elektrophorese (Gel oder Kapillar) zur Fragmentanalyse. Für die Entwicklung des Testsystems wählten wir die Variante der Methode, die nur eine Grundausstattung und einfache Reagenzien benötigt. Dies gewährleistet eine bessere Reproduzierbarkeit der Verfahren in jedem PCR-Labor und ermöglicht eine hohe Kosteneffizienz der Analyse, die für die praktische Klonidentifizierung in großem Maßstab entscheidend ist.

Da in der Literatur und in Primer-Datenbanken eine beträchtliche Anzahl nuklearer SSR-Loci für Pappeln gefunden wurde, beschlossen wir, aus mehreren Veröffentlichungen Primer auszuwählen und zu testen, die für die routinemäßige Genotypidentifizierung auf der Grundlage einer sehr einfachen Ausrüstung ohne Verwendung von DNA-Analysatoren verwendet werden können. Ein erster Satz von SSR-Primern für ihre potentielle Verwendung als Elemente des Testsystems für die molekulare Identifizierung bei Espe war das Ergebnis einer Suche in bibliographischen Datenbanken (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) und in der Molecular Ecology Resources Primer Database (http://tomato.bio.trinity.edu/).

Die DNA-Amplifikation wurde mit PCRCore-Kits (Isogen Laboratories, Ltd, Moskau, Russland) in BioRad Inc. (USA) Dyad Thermo Cycler durchgeführt. Mikrosatelliten-Loci (siehe Tabelle 2) aus den Serien ORPM und WPMS wurden mit spezifischen Primern in einer Konzentration von 1 mmol/mL und 5-10 ng Ziel-DNA unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils amplifiziert: (1) anfängliche Denaturierung bei 94°С für 3 min; (2) 30 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden Denaturierung bei 94°С, Primer-Annealing bei variabler Temperatur und Zeit (siehe Tabelle 3 für die nach der Verfahrensanpassung empfohlene endgültige Annealing-Temperatur) und Elongation bei 72°С für 1,5 min, gefolgt von (3) endgültiger Elongation bei 72°С für 10 min und (4) Abkühlen der PCR-Mischung auf 4°С.

Die PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese in 6%igen Polyacrylamid-Gelblöcken unter Verwendung des Tris-EDTA-Borat-Puffersystems unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in Ethidiumbromidlösung angefärbt und unter UV-Licht visualisiert. Die graphischen Bilder wurden mit dem Doc-Print II Vilber Lourmat-Geldokumentationssystem aufgenommen und gespeichert und in graphischen Editoren bearbeitet. Die Fragmentgröße wurde mit Hilfe einer speziellen Software (Photo-Capt) geschätzt. DNA des E. coli-Plasmids pBR322, das durch die Endonuklease HpaII restringiert wurde, diente als Molekulargewichtsmarker.

2.4. Statistische Analyse

Die Identität der Klone wurde mit Hilfe der Multilocus-Matches-Analyse für kodominante Daten bestimmt. Die Genotypwahrscheinlichkeit (GP), d.h. die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer bestimmten Multilokuskombination in der Population, und die Identitätswahrscheinlichkeit, die die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Übereinstimmung zweier nicht verwandter (PI) oder verwandter (PIsib) Individuen durch einen bestimmten Satz von Loci schätzt, wurden auf der Grundlage der Verteilung der Allelhäufigkeiten in den Populationsproben berechnet.

Die Übereinstimmung der beobachteten Genotypverteilungen für jeden SSR-Locus mit der erwarteten Verteilung gemäß dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht wurde anhand des Chi-Quadrat-Kriteriums getestet. Die Allelzahl sowie die beobachteten und erwarteten Heterozygotien wurden für jede einheimische Probe berechnet. Zur Bewertung der genetischen Unterteilung der untersuchten Bevölkerungsproben wurde die F-Statistik von Wright verwendet. Alle oben erwähnten Berechnungen wurden mit dem Add-in für MS Excel, GenAlEx 6.5, durchgeführt.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Entwicklung von SSR-basierten Testsystemen für die Genotyp-Identifizierung bei Espe

Für erste Tests wurden 33 heterologische Tri-, Tetra-, Penta- und Hexanukleotid-Mikrosatelliten-Loci aus zwei Serien ausgewählt; die Serie ORPM wurde zuerst für Populus trichocarpa und die Serie WPMS für Populus nigra entwickelt. Die Merkmale dieser Loci sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die ersten Tests wurden an DNA-Proben von drei Klonen (47-1, PtV22 и С-Kontrolle) aus einer In-vitro-Sammlung durchgeführt, die in der Zweigstelle Puschtschino des Shemyakin- und Ovchinnikov-Instituts für Bioorganische Chemie der Russischen Akademie der Wissenschaften (Puschtschino, Oblast Moskau, Russland) gelagert und vermehrt wurden. In dieser Phase wurde ihre Variabilität auch an 20-24 Exemplaren von Wildespen aus dem Gebiet Novosibirsk (Westsibirien, Russland) und der Region Krasnojarsk (Mittelsibirien, Russland) getestet.

Als Ergebnis der ersten Testphase wurden 24 Loci erfolgreich amplifiziert, während neun andere Loci keine PCR-Produkte erzeugten. Von den 24 Loci, die PCR-Fragmente produzierten, erwiesen sich 20 Loci als variabel mit einer Anzahl von Allelen von zwei bis neun, während vier Loci, die erfolgreich amplifiziert wurden, monomorph waren (Tabelle 3). Nach zusätzlichen Tests mit variablen PCR-Regimen wählten wir schließlich 14 Loci mit zuverlässiger Amplifikation und beträchtlichem Polymorphismusniveau zur Aufnahme in das Testsystem für die molekulargenetische Identifizierung aus. Beispiele für die Variabilität der ausgewählten Mikrosatellitenloci in Espe sind in den Abbildungen 2(a) und 2(b) dargestellt.

(a)

(b)

(a)

(a)
(b)

Abbildung 2

(a) Elektrophoretische Muster von PCR-amplifizierten SSR-Loci ORPM202, ORPM206, ORPM220, ORPM296, und ORPM312 in Espe. Loci: Lanes 1-4: ORPM202; Lanes 6-9: ORPM206; Lanes 10-13: ORPM220; Proben: 1, 6, 10, 15 und 19, Espe aus einheimischer Population; 2, 7, 11, 16 und 20, Klon С-Kontrolle; 3, 8, 12, 18 und 21, Klon 47-1; 4, 9, 13, 18 und 22, Klon PtV22. Spuren 5, 14 und 23: DNA-Molekulargewichtsmarker (DNA des E. coli-Plasmids pBR322, verdaut mit Restriktionsendonuklease HpaII). (b) Elektrophoretische Muster der PCR-amplifizierten SSR-Loci WPMS15, WPMS17, WPMS18, WPMS19, WPMS21 und WPMS22 in Espe. Loci: Lanes 1-4: WPMS15, Lanes 6-9: WPMS17, Lanes 10-13: WPMS18, Lanes 15-18: WPMS19, Lanes 19-22: WPMS21 und Lanes 24-27: WPMS22 Stichproben: 1, 6, 10, 15, 19 und 24, Espe aus der natürlichen Population; 2, 7, 11, 16, 20 und 25, Klon С-Kontrolle; 3, 8, 12, 16, 21 und 26, Klon 47-1; 4, 9, 13, 18, 22 und 27, Klon PtV22. Spuren 5, 14 und 23, DNA-Molekulargewichtsmarker (DNA des E. coli-Plasmids pBR322, verdaut mit der Restriktionsendonuklease HpaII).

Die erhaltenen Multilocus-Genotypen von acht Eliteklonen und Referenzgenotypen von Wildbäumen aus einheimischen Beständen sind in Tabelle S1 im ergänzenden Material aufgeführt, das online verfügbar ist unter http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. Wir analysierten bis zu 8 Rameten, die in verschiedenen Phasen der mikroklonalen Vermehrung entnommen wurden. Innerhalb der Klone waren die Genotypen stabil und reproduzierten sich eindeutig zwischen den Ramets, unabhängig vom Stadium der Vermehrung. Nach dem Ausschluss von Rameten desselben Genoms unterschieden sich sowohl die Eliteklone als auch die Espengenotypen der einheimischen Populationen, die in den Referenzproben enthalten waren, zu 100 %. Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Genotypen (GP: Genotyp-Wahrscheinlichkeit) schwankte bei den Elite-Klonen zwischen 2,4 – 10-21 und 1,7 – 10-11, bei den Bäumen der Referenzproben zwischen 4,0 – 10-24 und 5,8 – 10-9. Die Wahrscheinlichkeit des gelegentlichen Zusammentreffens zweier nicht verwandter Genotypen (PI: probability of identity) schwankte zwischen 4,8 – 10-10 in Yoshkar-Ola und 4,3 – 10-13 in Prisady. Angepasst an die theoretische Wahrscheinlichkeit der Abstammung der verglichenen Individuen von denselben Vorfahren lag die konservativere Schätzung (PIsibs) im Bereich von 1,0 – 10-4 in Yoshkar-Ola bis 9,3 – 10-6 in Voronezh. Alle Werte sind recht niedrig, so dass die theoretische Häufigkeit des Auftretens von wiederholbaren Genotypen aufgrund der Rekombination verschiedener Gameten im Laufe der Samenvermehrung etwa 1 zufällig gefundene identische Allelkombination aus 10000 Vergleichen nicht übersteigt. Die Beziehung zwischen PI und PIsibs in Abhängigkeit von der Anzahl der verwendeten Loci ist in Abbildung 3 dargestellt und zeigt, dass die Wahrscheinlichkeit des Auftretens identischer Genotypen bei Verwendung der ersten 7 bis 8 Loci, die für die Aufnahme in das Testsystem ausgewählt wurden, praktisch vernachlässigbar ist. Die Verwendung aller 14 Loci gewährleistet zusätzliche Zuverlässigkeit und Robustheit des Verfahrens.

Die Entwicklung von Mikrosatelliten-Loci für Arten der Gattung Populus begann Ende des 20. Jahrhunderts zusammen mit Technologien für molekulargenetische Marker. Im Jahr 1998 wurde einer der ersten Primer-Sätze für die Amplifikation von Dinukleotid-SSR-Loci für die Amerikanische Zitterpappel, Populus tremuloides, entwickelt. In dieser Arbeit wurde eine erfolgreiche Kreuzamplifikation der gleichen Marker für mehrere andere Pappelarten, P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis und P. maximowiczii, nachgewiesen. Die Autoren postulierten auch das breite Spektrum der Anwendungsmöglichkeiten von SSR-Loci für verschiedene Zwecke, einschließlich der Identifizierung von Klonen, der Analyse von kontrollierten Paarungen, der Genomkartierung, der markergestützten Selektion, der Untersuchung der genetischen Vielfalt und der Unterstützung von Programmen zur Erhaltung und nachhaltigen Bewirtschaftung forstlicher Genressourcen. Spätere Studien ergaben acht weitere Dinukleotid-SSR-Loci für Populus tremuloides . Seitdem wurden Mikrosatelliten-Loci für andere Arten, einschließlich P. nigra, entwickelt. Einige dieser Loci wurden auch bei P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans und P. lasiocarpa amplifiziert. Für Populus euphratica wurden spezifische SSR-Loci-Primer entwickelt. Später wurde dieser Satz für die Entwicklung von Multiplex-Panels verwendet, die für die Schätzung der genetischen Vielfalt dieser Art eingesetzt werden.

Die Sequenzierung der nächsten Generation war der effizienteste Weg zum Nachweis von Tandem-Wiederholungen im Pappelgenom und zum Entwurf von auf ihre Basen übertragbaren SSR-Primern, wie dies im Fall der Balsam-Pappel, Populus trichocarpa, nachgewiesen wurde. Solche universellen kreuzamplifizierten Loci werden für die Identifizierung von Arten und Hybriden und für die Abschätzung der genetischen Differenzierung zwischen Gattungen verwendet.

Mikrosatelliten sind auch nützlich für die Überprüfung der somaklonalen Diversität innerhalb eines Pools von Rameten, die durch mikroklonale Vermehrung von einem einzigen Spenderbaum gewonnen wurden, für die Identifizierung einzelner Klone unter dem Aspekt ihrer Toleranz gegenüber Umweltfaktoren. Wir konnten keine Unterschiede in den SSR-Mustern zwischen den Ramets der gleichen klonalen Elite-Linie feststellen. Nukleare Mikrosatelliten werden zusammen mit anderen Klassen molekularer Marker auch zur Bestimmung des Ploidiegrads bei Pappeln eingesetzt, und wir fanden bei mehreren Genotypen Hinweise auf Triploidie. Triploide Espenhybriden weisen häufig eine erhöhte Wuchsleistung und Resistenz gegen Krankheitserreger auf, so dass diese Frage mittels karyologischer und schwimmzytometrischer Analysen weiter untersucht werden sollte.

3.2. Analyse der klonalen Struktur in einheimischen Espenbeständen

Bereits bei der Probenahme von Material in Wildbeständen wurde versucht, die für Espen übliche Einbeziehung von klonalen Verzweigungen, die als Sprossen entstanden sind, zu vermeiden. In allen untersuchten Beständen wurde das gleiche Probenahmeschema angewandt, wobei ein Mindestabstand von 15-20 m zwischen den Bäumen eingehalten wurde. Dennoch wurden in allen untersuchten natürlichen Populationen Verzweigungen desselben Klons gefunden, was auf ein gemeinsames Vorkommen vegetativer Vermehrung hinweist (Tabelle S1).

Prisady. Unter den 52 untersuchten Bäumen fanden wir 41 verschiedene Haplotypen; ein Multilocus-Genotyp wurde neunmal und einer dreimal gefunden. Wir kamen zu dem Schluss, dass diese wiederholten Multilocus-Kombinationen darauf zurückzuführen sind, dass es sich bei den beprobten Sprossen um Rameten desselben Klons handelt.

Voronezh. Unter 17 Bäumen, die in unmittelbarer Nähe des Versuchsgeländes gesammelt wurden, wurden keine klonalen Individuen gefunden. Dreizehn am Ufer des Voronezh-Flusses gesammelte Bäume wurden durch acht Genotypen repräsentiert: vier davon befanden sich in einem Replikat, drei wurden als zwei Rameten desselben Klons gefunden und ein Genotyp wurde in drei Exemplaren gefunden, die offensichtlich aus dem Austrieb von bereits existierenden Vorläufern stammen. Insgesamt identifizierten wir 25 verschiedene Haplotypen in dieser Referenzpopulation.

Yoshkar-Ola. Zweiunddreißig analysierte Bäume wurden zu 13 verschiedenen Haplotypen zusammengefasst, die durch Multilocus-Matches-Analyse identifiziert wurden; ein Genotyp trat zweimal auf, ein Genotyp trat fünfmal auf, ein Genotyp trat siebenmal auf und ein Genotyp trat neunmal auf. Wiederholte Genotypen entsprachen offensichtlich Rameten, die aus dem Austrieb resultierten.

Wir kamen zu dem Schluss, dass Austrieb und ein hohes Maß an Klonalität ein weit verbreitetes Phänomen in heimischen Espenbeständen sind. Bei der Espe, wie auch bei vielen anderen Pappeln, können vegetative Klone große Flächen einnehmen. Daher sollten die Abstände zwischen den Bäumen auf mindestens 40-50 m vergrößert werden, um eine Probe zu erhalten, die frei von sich wiederholenden klonalen Genotypen ist. Eine genauere Schätzung der maximalen Ausbreitung eines einzelnen Klons über das Bestandesgebiet erfordert jedoch auch spezielle Untersuchungen.

Neben anderen Anwendungen waren nukleare SSR-Loci nützlich für die Untersuchung der klonalen Struktur und der genetischen Beziehungen zwischen Klon-Genotypen in einheimischen Beständen oder zwischen einheimischen und künstlichen Beständen. Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.

3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability

All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).

The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.

Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . Die von uns in einheimischen Espenbeständen beobachteten Werte der genetischen Vielfalt innerhalb der Populationen lagen im Bereich der Werte, die üblicherweise bei Pappeln beobachtet und durch SSR-Loci-Analysen geschätzt werden (und Verweise darin).

Eine beträchtliche Anzahl von Studien, in denen die Mikrosatellitentechnik eingesetzt wurde, konzentrierte sich auf den Nachweis von Hybridisierung in natürlichen oder künstlichen Pappelbeständen. SSR-Loci helfen dabei, Mechanismen der interspezifischen Kreuzung und der reproduktiven Isolation aufzudecken. In dieser Studie konzentrierten wir uns eher auf die Variation zwischen Individuen und zwischen Populationen als auf interspezifische Unterschiede, aber bei einigen der untersuchten Eliteklone sollte ihr hybrider Ursprung mit Hilfe eines komplexen Satzes von Markern mit nuklearer und zytoplasmatischer Lokalisierung genetisch getestet werden. Über die Identifizierung von interspezifischen Hybriden und industriellen Klonen wurde in zahlreichen Veröffentlichungen berichtet. Eine bemerkenswerte Veröffentlichung berichtet über die genetische Identität einiger industrieller Klone von Pappeln, die zuvor als unterschiedlich behandelt wurden.

Die praktische Aufgabe der Identitätsüberwachung kommerzieller Klone in In-vitro-Sammlungen ähnelte derjenigen, die in der vorliegenden Untersuchung verwendet wurde. Bei allen Anwendungen, bei denen eine zuverlässige individuelle Identifizierung erforderlich war, zeigten SSRs eine hohe Effektivität.

4. Schlussfolgerung

Die Anwendung nuklearer Mikrosatelliten-Loci zur genetischen Identifizierung und Bewertung der genetischen Variabilität bei Espen-Eliteklonen und einheimischen Beständen zeigte eine hohe Effektivität des entwickelten, kostengünstigen SSR-basierten Testsystems. Die zuverlässige Authentifizierung von Klonen gewährleistet die genetische Überwachung der mikroklonalen Vermehrung und ermöglicht die Aufdeckung der Klonalität in einheimischen Beständen. Wir haben gezeigt, dass dieselbe Gruppe von Mikrosatelliten-Loci erfolgreich zur Abschätzung der genetischen Variabilität innerhalb und zwischen Populationen bei Espe eingesetzt werden kann. Die Rekonstruktion der Verwandtschaft zwischen einzelnen Eliteklonen oder der genetischen Beziehungen zwischen sich natürlich fortpflanzenden Populationen sind perspektivische Aufgaben, die in Zukunft mit denselben Markern realisiert werden können.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt in Bezug auf die Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Dankesworte

Diese Forschung wird vom Ministerium für Bildung und Wissenschaft der Russischen Föderation unterstützt (Projekt Nr. 14.607.21.0044 vom 22.08.2014; eindeutige Kennung RFMEFI60714X0044). Die Autoren danken auch E. M. Romanov, A. I. Shurgin, R. V. Sergeev (Volga State University of Technology, Yoshkar-Ola, Republic of Mari El, Russia), M. V. Drapaluk, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikov, E. O. Kolesnikova (Voronezh State Forestry Engineering University, Voronezh, Russland) und G. B. Kolganikhina (Institute of Forest Science RAS, Uspenskoe, Moscow Region, Russland) für ihre Hilfe bei der Probenerhebung in heimischen Beständen. Die Autoren danken auch M. Zeps, D. Auzenbaha und A. Gailis (Lettisches Staatliches Forstforschungsinstitut „Silava“, Salaspils, Lettland) für die Bereitstellung von biologischem Material und Informationen über Espen-Eliteklone.

Ergänzende Materialien