Použití mikrosatelitních lokusů pro molekulární identifikaci elitních genotypů, analýzu klonality a genetické diverzity topolu osiky (Populus tremula L., Salicaceae)

Abstrakt

Na základě mikrosatelitních (SSR) lokusů byly vyvinuty testovací systémy pro molekulární identifikaci elitních genotypů mikropropagované osiky (Populus tremula L.). Z 33 testovaných mikrosatelitních lokusů bylo vybráno 14 z důvodu udržitelné PCR amplifikace a značné variability u elitních klonů osiky určené pro zakládání rychle rostoucích lesních plantáží. Všech osm testovaných klonů mělo různé multilokusové genotypy. Mezi 114 stromy ze tří referenčních původních porostů nacházejících se v blízkosti založených plantáží bylo identifikováno 80 haplotypů, přičemž některé opakující se genotypy byly přisuzovány přirozeným klonům, které se objevily v důsledku klíčení. Vybraná sada SSR markerů vykazovala spolehlivou individuální identifikaci s nízkou pravděpodobností výskytu identických genotypů osiky (minimálně a 1 × 10-4 pro nepříbuzné a příbuzné jedince, resp.). Jsou popsány případové studie demonstrující praktické využití testovacího systému včetně analýzy klonové struktury a úrovně genetické diverzity ve třech přirozených porostech osiky rostoucích v oblastech, kde byly založeny plantáže z elitních klonů.

1. Úvod

Pokračující degradace původních lesů na celém světě v důsledku nadměrného využívání vyžaduje zavádění intenzivních forem lesního hospodářství, které by upřednostňovaly nejen hospodářský efekt, ale také zachování genetických zdrojů dřevin. Tento úkol deklaruje získávání a udržování elitních genotypů lesních dřevin určených pro rychlerostoucí lesní výsadby. Nové vysoce produktivní a vůči abiotickým faktorům, škůdcům a patogenům odolné kultivary a odrůdy se objevují jako výsledek šlechtění, výběru mutací a/nebo genového inženýrství. Klonové množení těchto vynikajících jedinců zajišťuje fixaci jejich užitných vlastností jak pro další šlechtitelské pokusy, tak pro zakládání cílových lesních výsadeb. Zejména mikroklonální množení pomocí kultur in vitro umožňuje rychlé, rozsáhlé a nákladově efektivní klonování jedinců s požadovanými vlastnostmi, zejména v případech, kdy tradiční roubování nebo roubování není možné nebo vyžaduje zvláštní úsilí .

Protože morfologicky a anatomicky odlišné rostlinné klony mohou vypadat podobně, je nezbytné tyto klony spolehlivě identifikovat včetně rozlišení mezi sebou a od konspecifických jedinců nebo zástupců jiných blízce příbuzných druhů. V lesnictví je problém identifikace jedinců obzvláště důležitý, protože vnější vzhled stromů je velmi závislý na parametrech prostředí . V určitých stadiích přirozené ontogeneze lesních dřevin, například semenáčků a sazenic, a zejména jako kalusy nebo explantáty v buněčných kulturách in vitro, mohou být jedinci nerozlišitelní nejen individuálně, ale i z hlediska druhové diagnostiky. Dlouhá generační doba a ontogeneticky pozdní zrání činí úkol genetické pasportizace elitních klonů u dřevin reálným. Složitý vícestupňový proces získávání, množení a zavádění elitních kultivarů šlechtěním nebo genovým inženýrstvím zvyšuje pravděpodobnost různých chyb.

Molekulárně genetické markery (MGM) se ukázaly jako velmi účinné nástroje pro individuální identifikaci. Z různých tříd MGM mikrosatelity nebo jednoduché sekvenční repetice (SSR) nejlépe vyhovují požadavkům testovacích systémů pro identifikaci díky své specifičnosti, kodominanci, selekční neutralitě, dostatečné alelické bohatosti a heterozygotnosti způsobené vysokou mírou mutací. Navíc vzhledem k relativní konzervativnosti genomu v rámci rodů a čeledí rostlin mohou být SSR markery a PCR primery pro jejich amplifikaci přenosné z jednoho taxonu na druhý.

U několika druhů topolů bylo pomocí molekulárních markerů včetně lokusů SSR prokázáno úspěšné určení otisků DNA a rozlišení klonů, kultivarů a odrůd .

V tomto článku referujeme o vývoji testovacího systému založeného na SSR pro molekulárně genetickou identifikaci elitních mikropropagovaných genotypů osiky, Populus tremula L., zaměřeného na zakládání rychle rostoucích cílových lesních plantáží v několika regionech Ruské federace a prezentujeme výsledky jeho použití pro rozlišení jednotlivých genotypů, studium klonální struktury v přirozených porostech osiky a odhad genetické variability v populacích.

2. Které genotypy osiky se v současnosti používají? Materiál a metody

Vývoj testovacího systému pro identifikaci elitních genotypů spočíval ve výběru specifické sady markerů vyhovující požadavkům na diskriminaci klonů s vysokým rozlišením a v testování její spolehlivosti a identifikační schopnosti na souboru elitních genotypů a dostatečném počtu zástupců studovaného druhu.

2.1. Rostlinný materiál

Elitní osikové a hybridní klony použité pro vývoj testovacích systémů pro molekulární identifikaci byly získány z mikropropagovaných buněčných kultur udržovaných v Puščinské pobočce Šemjakinova a Ovčinnikovova ústavu bioorganické chemie Ruské akademie věd (Puščino, Rusko). Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.

Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.

Obrázek 1

Mapa umístění výsadeb z elitních klonů a odpovídajících původních porostů osiky použitých jako referenční populace. (1) Prisady, (2) Voroněž a (3) Joškar-Ola.

Prisady. Experimentální plocha se nachází 1 km západně od osady Prisady v Serpuchovském rajónu Moskevské oblasti (Rusko). Jako referenční populace byly použity listy 52 mladých nebo středně starých (přibližně 10-25 let) osik z přirozeného víceetážového porostu nacházejícího se v těsné blízkosti (1 km) této plochy.

Voroněž. V porostu sousedícím s experimentální plochou založenou ve Voroněžské oblasti bylo odebráno sedmnáct stromů. Dalších 13 stromů bylo odebráno podél břehu řeky Voroněž na území města Voroněž v blízkosti plantáže.

Yoshkar-Ola. Mladý původní porost osiky byl zdrojem stromů použitých jako referenční populace pro experimentální plochu umístěnou poblíž města Yoshkar-Ola v republice Mari-El. Byly odebrány listy z 32 stromů.

Aby se minimalizoval příležitostný odběr vzorků jedinců, kteří mají vegetativní původ (prostřednictvím výhonů), odebírali jsme listy ze stromů ve vzdálenosti ne menší než 15-20 m od sebe. Tento přístup byl použit pro zařazení do referenčních vzorků převážně volně opylovaných semenáčků, které mají maximální genetickou rozmanitost. Výhradně na základě vnějšího vzhledu stromů a vzdálenosti mezi nimi se však nebylo možné vyhnout odběru vzorků ramet objevujících se v důsledku klíčení, což potvrdila i následná genetická analýza.

Výhonky s listy byly odříznuty pomocí mechanické řezačky s hliníkovým teleskopickým stožárem. Sebrané výhony s listy byly uloženy do plastových sáčků na dobu maximálně 6 dnů při teplotě +4 °C až do zpracování. Příprava vzorků zahrnovala extrakci DNA a umístění rezervních fragmentů listové tkáně do označených zipových sáčků se silikagelem pro dlouhodobé skladování. Mimo období aktivní vegetace lze k extrakci DNA s úspěchem použít i dormantní vegetativní pupeny.

2.2. Extrakce DNA

Pro extrakci DNA byly použity fragmenty listů o hmotnosti přibližně 350-500 mg odebrané z explantátů rostoucích in vitro na speciálním médiu (REF) v Petriho miskách.

U stromů z původních populací jsme extrahovali DNA z 350-500 mg fragmentů čerstvých nebo 200-300 mg silikaglem vysušených listových pletiv modifikovanou metodou s cetyltrimethylamonium bromidem (CTAB) .

2.3. Analýza mikrosatelitů

Mikrosatelity neboli SSR představují třídu tandemově se opakujících sekvencí DNA s krátkými (1-6 párů nukleotidů, bp) motivy lišícími se počtem kopií mezi jedinci v důsledku vysoké míry mutací. Vícenásobné alely, které se obvykle vyskytují v kodominantních mikrosatelitních lokusech, vytvářejí velké množství jedinečných genotypových kombinací, což zajišťuje jejich spolehlivou identifikaci, zejména pokud je použit dostatečný počet lokusů. Z technického hlediska vyžaduje analýza polymorfismu SSR pouze polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a následnou elektroforézu (gelovou nebo kapilární) pro analýzu fragmentů. Pro vývoj testovacího systému jsme zvolili variantu metody, která využívá pouze základní vybavení a jednoduchá činidla. To zajistilo zvýšenou reprodukovatelnost postupů v jakékoliv PCR laboratoři a umožnilo dosáhnout vysoké ekonomické efektivity analýzy, která je pro rozsáhlou praktickou identifikaci klonů klíčová.

Protože v literatuře a databázích primerů byl nalezen značný počet jaderných SSR lokusů pro topoly, rozhodli jsme se vybrat z několika publikací a otestovat primery, které lze použít pro rutinní identifikaci genotypu na základě velmi jednoduchého vybavení bez použití DNA-analyzátorů. Počáteční sada SSR primerů pro jejich potenciální využití jako prvků testovacího systému molekulární identifikace u topolů byla výsledkem vyhledávání v bibliografických databázích (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) a v Molecular Ecology Resources Primer Database (http://tomato.bio.trinity.edu/).

Amplifikace DNA byla provedena pomocí souprav PCRCore (Isogen Laboratories, Ltd.), Moskva, Rusko) v laboratořích BioRad Inc. (USA) Dyad Thermo cycler. Mikrosatelitní lokusy (uvedené v tabulce 2) ze sérií ORPM a WPMS byly amplifikovány pomocí specifických primerů o koncentraci 1 mmol/ml a 5-10 ng cílové DNA za použití následujícího teplotního profilu: (1) počáteční denaturace při 94 °C po dobu 3 min; (2) 30 cyklů sestávajících z 30 s denaturace při 94 °C, žíhání primerů při proměnlivé teplotě a čase (viz tabulka 3 pro konečnou teplotu žíhání doporučenou po úpravě postupu) a elongace při 72 °C po dobu 1,5 min, následované (3) konečnou elongací při 72 °C po dobu 10 min a (4) ochlazením směsi PCR na 4 °C.

Produkty PCR byly podrobeny elektroforéze v 6 % polyakrylamidových gelových blocích za použití Tris-EDTA-borátového pufrovacího systému. Po obarvení elektroforetických gelů v roztoku ethidium bromidu a jejich vizualizaci v UV světle byly pořízeny a uloženy grafické snímky pomocí dokumentačního systému Doc-Print II Vilber Lourmat Gel a zpracovány v grafických editorech. Velikost fragmentů byla odhadnuta pomocí specializovaného softwaru (Photo-Capt). Jako marker molekulové hmotnosti byla použita DNA plazmidu E. coli pBR322, omezená endonukleázou HpaII.

2.4. Statistická analýza

Totožnost klonů byla určena pomocí analýzy multilokusových shod pro kodominantní data. Na základě rozložení frekvencí alel ve vzorcích populace byla vypočtena genotypová pravděpodobnost (GP), která znamená pravděpodobnost výskytu konkrétní multilokusové kombinace v populaci, a pravděpodobnost identity, která odhaduje pravděpodobnost náhodné shody dvou nepříbuzných (PI) nebo příbuzných (PIsib) jedinců podle konkrétní sady lokusů.

Soulad pozorovaných rozložení genotypů pro jednotlivé SSR lokusy s očekávanými podle Hardyho-Weinbergovy rovnováhy byl testován pomocí chí-kvadrát kritéria. Pro každý nativní vzorek byl vypočten počet alel a pozorovaná a očekávaná heterozygotnost. Pro posouzení genetického dělení mezi studovanými vzorky populací jsme použili Wrightovu F-statistiku. Všechny výše uvedené výpočty byly provedeny v nadstavbě pro MS Excel, GenAlEx 6.5 .

3. Výsledky a diskuse

3.1. Výsledky a diskuse Vývoj testovacích systémů založených na SSR pro identifikaci genotypu u topolu osiky

Pro počáteční testování jsme vybrali 33 heterologických tri-, tetra-, penta- a hexanukleotidových mikrosatelitových lokusů ze dvou sad; série ORPM byla navržena nejprve pro Populus trichocarpa a série WPMS byla navržena pro Populus nigra . Charakteristiky těchto lokusů jsou uvedeny v tabulce 2. Počáteční testování bylo provedeno na vzorcích DNA ze tří klonů (47-1, PtV22 и С-control) ze sbírky in vitro uložené a rozmnožené v Puščinské pobočce Šemjakinova a Ovčinnikovova ústavu bioorganické chemie Ruské akademie věd (Puščino, Moskevská oblast, Rusko). V této fázi byla jejich variabilita testována také na 20-24 vzorcích divokých osik z Novosibirské oblasti (Západní Sibiř, Rusko) a Krasnojarského kraje (Střední Sibiř, Rusko).

Výsledkem první fáze testování bylo 24 lokusů úspěšně amplifikovaných a devět dalších lokusů nevytvořilo produkty PCR. Z 24 lokusů, které vytvořily fragmenty PCR, se 20 lokusů ukázalo jako variabilní s počtem alel od dvou do devíti, zatímco čtyři lokusy, které byly úspěšně amplifikovány, byly monomorfní (tabulka 3). Po dalším testování při variabilních režimech PCR jsme nakonec vybrali 14 lokusů se spolehlivou amplifikací a značnou úrovní polymorfismu pro zařazení do testovacího systému pro molekulárně genetickou identifikaci. Příklady variability vybraných mikrosatelitových lokusů u osiky jsou uvedeny na obrázcích 2(a) a 2(b).

(a)

(b)

(a)

(a)
(b)

Obrázek 2

(a) Elektroforetické vzory PCR-amplifikovaných SSR lokusů ORPM202, ORPM206, ORPM220, ORPM296 a ORPM312 u osiky. Loci: dráhy 1-4: ORPM202; dráhy 6-9: ORPM206; dráhy 10-13: ORPM220; vzorky: 1, 6, 10, 15 a 19, osika z původní populace; 2, 7, 11, 16 a 20, klon S-control; 3, 8, 12, 18 a 21, klon 47-1; 4, 9, 13, 18 a 22, klon PtV22. Dráhy 5, 14 a 23: marker molekulové hmotnosti DNA (DNA plazmidu E. coli pBR322, natrávená restrikční endonukleázou HpaII). (b) Elektroforetické vzory PCR-amplifikovaných SSR lokusů WPMS15, WPMS17, WPMS18, WPMS19, WPMS21 a WPMS22 u osiky. Loci: dráhy 1-4: WPMS15, dráhy 6-9: WPMS17, dráhy 10-13: WPMS18, dráhy 15-18: WPMS19, dráhy 19-22: WPMS21 a dráhy 24-27: WPMS22. Vzorky: 1, 6, 10, 15, 19 a 24, osika z přírodní populace; 2, 7, 11, 16, 20 a 25, klon C-control; 3, 8, 12, 16, 21 a 26, klon 47-1; 4, 9, 13, 18, 22 a 27, klon PtV22. Dráhy 5, 14 a 23, marker molekulové hmotnosti DNA (DNA plazmidu E. coli pBR322, štěpená restrikční endonukleázou HpaII).

Získané multilokusové genotypy osmi elitních klonů a referenční genotypy divokých stromů z původních porostů jsou uvedeny v tabulce S1 v doplňkovém materiálu dostupném online na http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. Analyzovali jsme až 8 ramet odebraných v různých fázích mikroklonálního množení. V rámci klonů byly genotypy stabilní a jednoznačně se reprodukovaly mezi rametami nezávisle na fázi množení. Po vyloučení ramet stejného genu se jak elitní klony, tak genotypy osik z původních populací zařazených do referenčních vzorků lišily o 100 %. Pravděpodobnost výskytu genotypů (GP: genotype probability) mezi elitními klony se pohybovala v rozmezí od 2,4 – 10-21 do 1,7 – 10-11, mezi stromy v referenčních vzorcích od 4,0 – 10-24 do 5,8 – 10-9. Zjištěná pravděpodobnost výskytu genotypů se pohybovala v rozmezí od 2,4 – 10-21 do 1,7 – 10-11. Pravděpodobnost občasné shody dvou nepříbuzných genotypů (PI: probability of identity) se pohybovala od 4,8 – 10-10 u Yoshkar-Ola do 4,3 – 10-13 u Prisady. Po úpravě na teoretickou pravděpodobnost potomstva srovnávaných jedinců od stejných předků se konzervativnější odhad (PIsibs) pohyboval v rozmezí 1,0 – 10-4 v Joškar-Ole až 9,3 – 10-6 ve Voroněži. Všechny hodnoty jsou poměrně nízké, takže teoretická frekvence výskytu opakovatelných genotypů v důsledku rekombinace různých gamet v průběhu reprodukce semen nepřesáhla asi 1 náhodně nalezenou identickou kombinaci alel z 10000 porovnání. Vztah PI a PIsibs od počtu použitých lokusů je uveden na obrázku 3 a ukazuje prakticky zanedbatelnou pravděpodobnost výskytu identických genotypů při použití prvních 7 až 8 lokusů vybraných pro zařazení do testovacího systému. Použití všech 14 lokusů zajišťuje další spolehlivost a robustnost postupu.

Obrázek 3

Závislost PI a PIsibs od počtu použitých lokusů. 1 představuje lokus 1, 2 představuje lokus 1 + 2 atd.

Vývoj mikrosatelitních lokusů pro druhy rodu Populus začal koncem 20. století spolu s technologiemi molekulárně genetických markerů. V roce 1998 byla navržena jedna z prvních sad primerů pro amplifikaci dinukleotidových SSR lokusů pro americký topol třeslicovitý, Populus tremuloides . V této práci byla prokázána úspěšná křížová amplifikace stejných markerů pro několik dalších druhů topolů, P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis a P. maximowiczii. Autoři také postulovali široké spektrum využití SSR lokusů pro různé účely, včetně identifikace klonů, analýzy řízeného páření, mapování genomu, selekce s pomocí markerů, testů genetické diverzity a podpory programů ochrany a udržitelného hospodaření s lesními genetickými zdroji. Následné studie poskytly osm dalších dinukleotidových SSR lokusů pro Populus tremuloides . Od té doby byly vyvinuty mikrosatelitní lokusy pro další druhy včetně P. nigra . Některé z těchto lokusů byly amplifikovány také u P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans a P. lasiocarpa. Specifické SSR lokusy byly navrženy pro Populus euphratica . Později byla tato sada použita pro vývoj multiplexních panelů používaných pro odhad genetické diverzity u tohoto druhu .

Sekvenování nové generace bylo nejefektivnějším způsobem detekce tandemových repetic v genomu topolu a návrhu na jejich bázi přenosných SSR primerů, jak bylo prokázáno v případě topolu balzámového, Populus trichocarpa . Takové univerzální křížově amplifikované lokusy se používají pro druhovou a hybridní identifikaci a pro odhad genetické diferenciace mezi příbuznými druhy .

Mikrosatelity jsou také užitečné pro kontrolu somaklonální diverzity v rámci fondu ramet získaných mikroklonálním množením z jednoho donorového stromu , pro identifikaci jednotlivých klonů z hlediska jejich tolerance k faktorům prostředí . Nepozorovali jsme žádné rozdíly ve vzorcích SSR mezi rametami stejné elitní klonální linie. Jaderné mikrosatelity spolu s dalšími třídami molekulárních markerů jsou využívány také pro stanovení úrovně ploidie u topolů , přičemž náznaky triploidie jsme zjistili u několika genotypů. Triploidní kříženci osik často vykazují zvýšenou vitalitu a odolnost vůči patogenům, proto by tato záležitost měla být dále studována pomocí karyologické analýzy a analýzy plovoucí cytometrie.

3.2. Analýza klonální struktury v původních porostech osiky

Od samého okamžiku terénního odběru materiálu ve volně rostoucích porostech jsme se snažili vyhnout zařazení klonálních ramet vzniklých jako výhony, což je u osiky běžné. Ve všech studovaných porostech bylo použito stejné schéma odběru vzorků s dodržením vzdálenosti mezi stromy alespoň 15-20 m. Přesto byly ve všech studovaných přírodních populacích nalezeny ramety stejného klonu naznačující společný výskyt vegetativního množení (tab. S1).

Prisady. Mezi studovanými 52 stromy jsme nalezli 41 různých haplotypů; jeden multilokusový genotyp byl nalezen devětkrát a jeden třikrát. Došli jsme k závěru, že tyto opakované multilokusové kombinace jsou důsledkem toho, že odběrové výhonky jsou rametami téhož klonu.

Voroněž. Mezi 17 stromy odebranými v těsné blízkosti místa experimentální výsadby nebyl nalezen žádný klonový jedinec. Třináct stromů odebraných na břehu řeky Voroněž bylo zastoupeno osmi genotypy: čtyři z nich byly v jednom opakování, u tří bylo zjištěno, že se jedná o dva ramety téhož klonu, a jeden genotyp byl nalezen ve třech exemplářích zjevně pocházejících z výhonů stále existujících potomků. Celkem jsme v tomto vzorku referenční populace identifikovali 25 různých haplotypů.

Yoshkar-Ola. Třicet dva analyzovaných stromů se spojilo do 13 různých haplotypů identifikovaných pomocí analýzy multilokusových shod; jeden genotyp se objevil dvakrát, jeden genotyp se objevil pětkrát, jeden genotyp se objevil sedmkrát a jeden genotyp se objevil devětkrát. Opakované genotypy zřejmě odpovídaly rametám vzniklým klíčením.

Dospěli jsme k závěru, že klíčení a vysoká míra klonality jsou v původních osikových porostech rozšířeným jevem. U osiky, stejně jako u mnoha jiných topolů, jsou vegetativní klony schopny obsadit velké plochy. Proto by pro sběr vzorku bez opakujících se klonálních genotypů měly být vzdálenosti mezi stromy zvětšeny alespoň na 40-50 m. Přesnější odhad maximálního rozšíření jednoho klonu na území porostu však také vyžaduje speciální průzkum.

Mimo jiné byly jaderné SSR lokusy užitečné pro studium klonální struktury a genetických vztahů mezi klonálními genotypy v původních porostech nebo mezi původními a umělými porosty . Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.

3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability

All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).

Population Prisady Mean 41 6.429 3.921 0.631 0.661 0.669 0.047 s.e. 0.850 0.602 0.059 0.044 0.045 0.065 Voronezh Mean 25 7.429 3.970 0.580 0.687 0.701 0.188 s.e. 1.274 0.584 0.068 0.035 0.036 0.076 Yoshkar-Ola Mean 13 4.643 2.738 0.522 0.567 0.590 0.109 s.e. 0.541 0.343 0.072 0.043 0.045 0.087 Total mean Mean 26.333 6.167 3.543 0.578 0.639 0.654 0.115 s.e. 1.791 0.558 0.308 0.038 0.024 0.025 0.044

s.e.: standard error. : sample size. : mean number of alleles. : effective number of alleles. : observed heterozygosity. : expected heterozygosity. : unbiased expected heterozygosity. : fixation index (intrapopulation coefficient of inbreeding).

Table 4

Parameters of genetic variability in aspen populations.

The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.

Locus ORPM193 0.158 0.230 0.086 ORPM202 0.514 0.593 0.164 ORPM206 0.276 0.363 0.120 ORPM220 0.066 0.096 0.032 ORPM296 0.046 0.067 0.023 WPMS14 0.074 0.224 0.162 WPMS15 −0.187 −0.144 0.036 WPMS16 −0.105 −0.083 0.019 WPMS17 −0.066 −0.028 0.036 WPMS18 0.305 0.322 0.025 WPMS19 −0.034 −0.003 0.029 WPMS20 0.111 0.131 0.023 WPMS21 −0.057 −0.027 0.028 WPMS22 0.563 0.578 0.035 Mean 0.119 0.166 0.058 s.e. 0.060 0.062 0.014

s.e.: standard error.

Table 5

-statistics for three natural aspen populations.

Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . Námi zjištěné úrovně vnitropopulační genetické diverzity v přirozených porostech osik se pohybovaly v rozmezí hodnot běžně pozorovaných u topolů a odhadovaných pomocí analýzy SSR lokusů ( a odkazy na ně).

Značné množství studií využívajících mikrosatelitní techniku bylo zaměřeno na detekci hybridizace v přirozených nebo umělých porostech topolů. SSR lokusy pomáhají odhalit mechanismy mezidruhového křížení a reprodukční izolace . V této studii jsme se zaměřili spíše na variabilitu mezi jednotlivci a mezi populacemi než na mezidruhové rozdíly, ale s ohledem na některé studované elitní klony by měl být jejich hybridní původ geneticky testován pomocí komplexního souboru markerů, ale jaderné a cytoplazmatické lokalizace. Hi-fidelity identifikace mezidruhových hybridů a průmyslových klonů byla uvedena ve značném počtu publikací . Pozoruhodná publikace informuje o genetické identitě některých průmyslových klonů topolů, které byly dříve považovány za odlišné .

Praktický úkol sledování identity komerčních klonů ve sbírkách in vitro byl podobný tomu, který byl použit v tomto výzkumu. Ve všech aplikacích, kde byla vyžadována spolehlivá individuální identifikace, vykazovaly SSR vysokou účinnost.

4. Závěr

Použití jaderných mikrosatelitových lokusů pro genetickou identifikaci a hodnocení genetické variability u elitních klonů osiky a původních porostů ukázalo vysokou účinnost vyvinutého nízkonákladového testovacího systému založeného na SSR. Spolehlivá autentizace klonů zajišťuje genetický monitoring mikroklonálního šíření a umožňuje odhalit klonalitu v původních porostech. Prokázali jsme, že stejný soubor mikrosatelitních lokusů lze úspěšně použít pro odhad úrovně vnitropopulační a mezipopulační genetické variability osiky. Rekonstrukce příbuznosti mezi jednotlivými elitními klony nebo genetických vztahů přirozeně se pářících populací jsou perspektivní úkoly, které lze v budoucnu realizovat s využitím stejných markerů.

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke konfliktu zájmů.

Poděkování

Tento výzkum je podporován Ministerstvem školství a vědy Ruské federace (projekt č. 14.607.21.0044 ze dne 22. 8. 2014; jedinečný identifikátor RFMEFI60714X0044). Autoři rovněž děkují E. M. Romanovovi, A. I. Šurginovi, R. V. Sergejevovi (Volžská státní technická univerzita, Joškar-Ola, Republika Mari El, Rusko), M. V. Drápalukovi, A. V. Tzaralungovi, A. A. Rešetnikovovi, E. O. Kolesnikova (Voroněžská státní lesnická inženýrská univerzita, Voroněž, Rusko) a G. B. Kolganikhina (Ústav lesnických věd RAS, Uspenskoe, Moskevská oblast, Rusko) za pomoc při sběru vzorků v původních porostech. Autoři jsou také vděčni M. Zepsovi, D. Auzenbahovi a A. Gailisovi (Lotyšský státní lesnický výzkumný ústav „Silava“, Salaspils, Lotyšsko) za poskytnutí biologického materiálu a informací o elitních klonech osiky.

Doplňkové materiály