Zahlreiche alternative Ansätze zur PCR-Klonierung (1) wurden entwickelt, darunter TA-Klonierung (2), ligationsunabhängige Klonierung (LIC) (3-4), rekombinaseabhängige Klonierung (5-7) und PCR-vermittelte Klonierung (8-10). Der praktische Nutzen einer Klonierungsmethode hängt von ihrer Zuverlässigkeit ab und nicht von ihrer Bequemlichkeit, ihrem Preis oder ihrer Effizienz unter optimalen Bedingungen. Die Methoden, die am einfachsten zu überwachen und zu optimieren sind, erweisen sich letztlich als am zuverlässigsten. TA-Klonierung und LIC erfordern Endmodifikationen, die nicht durch Gelelektrophorese überwacht werden können. Rekombinasen werden in der Regel als proprietäre Bestandteile von Klonierungskits verkauft, so dass nur wenige Verbraucher die In-vitro-Rekombinationsreaktionen optimieren. Die hier beschriebene Overlap-Extension-PCR-Klonierung ist nicht die erste Form der PCR-vermittelten Klonierung (8-10). Sie ist jedoch relativ einfach, effizient und zuverlässig.
Die erste von zwei PCRs (Abbildung 1A) erzeugt eine lineare Insertion mit Plasmidsequenzen an beiden Enden (siehe ergänzende Materialien für Methoden und Anweisungen zum Primerdesign). Diese Verlängerungen ermöglichen es den Strängen des PCR-Produkts (Abbildung 1A), als ein Paar übergroßer Primer auf dem Vektorfragment zu wirken (Abbildung 1B). Nach Denaturierung und Annealing hybridisieren die Insertionsstränge mit dem Vektor und verlängern sich zu einem neuen doppelsträngigen Plasmid. Die Phusion-DNA-Polymerase (Kat.-Nr. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, USA), die für die Durchführung der Technik entscheidend ist, besitzt keine Strangverdrängungsaktivität. Daher ist das Endprodukt der Reaktion ein doppelsträngiges Fusionsplasmid mit zwei Kerben (eine an jedem Strang). Dieses entspannte doppelsträngige Plasmid wird dann in kompetente Escherichia coli-Zellen transformiert, die die Einschnitte mit DNA-Reparaturenzymen verschließen (Abbildung 1C). Wir verwenden für beide PCRs dieselbe thermostabile Polymerase, so dass auch unerfahrene Anwender effizient klonen können, ohne sich mit den Eigenheiten mehrerer Restriktionsenzyme, Polymerasen, Glykosylasen, Rekombinasen und Ligasen auseinandersetzen zu müssen.
(A) Zunächst wird das Insert mit den chimären Primern PCR-amplifiziert, so dass das endgültige PCR-Produkt mit dem Vektor überlappende Regionen aufweist. (B) Dann werden Vektor und Insert gemischt, denaturiert und annealed; das hybridisierte Insert wird dann von der Phusion-DNA-Polymerase unter Verwendung des Vektors als Vorlage verlängert, bis die Polymerase das 5′-Ende des Inserts erreicht. Nach mehreren PCR-Zyklen wird das neue Plasmid mit zwei Kerben (eine auf jedem Strang) als Produkt angehäuft. (C) Das neue Plasmid kann in E. coli transformiert werden, nachdem das elterliche Plasmid durch DpnI-Verdau zerstört wurde.
Wir haben gfp zunächst für Proof-of-Principle-Experimente verwendet. Das gfp-Gen wurde mit den chimären Primern (5′-Enden komplementär zum pQE30-Plasmid; 3′-Ende komplementär zu gfp) PCR-amplifiziert (Abbildung 1A). Die Overlap-Extension-PCR (Abbildung 1B) wurde mit fünf verschiedenen DNA-Polymerasen durchgeführt (ergänzende Tabelle S1). Hohe Konzentrationen des Inserts und relativ niedrige Annealing-Temperaturen in der Reaktion (5-10 °C unter der berechneten Schmelztemperatur des Primer/Plasmid-Komplexes) sind für eine effiziente Overlap-Extension wichtig. Einige der PCR-Produkte entsprechen der entspannten Form des gewünschten Vektors, wie die Agarosegelanalyse zeigt (Abbildung 2A). Der ursprüngliche pQE30-Vektor wurde in Reaktionen mit der Restriktionsendonuklease DpnI zerstört (Abbildung 1C). Ein kleines Aliquot aus jeder Reaktion wurde zur Transformation von E. coli-Zellen verwendet.
(A) Produkte der Overlap-Extension-PCR-Klonierungsreaktion nach 0, 5, 10, 15, 20, 25 und 30 Zyklen durch Agarose-Gelelektrophorese. Drei Nanogramm pQE30-Vektor wurden mit 175 ng Insert (250 molarer Überschuss) in 10 μL Gesamtvolumen gemischt; ein 4-μL-Aliquot der Reaktion wurde auf einem 0,8%igen Agarosegel getrennt. M2, 1 kb DNA-Leiter; M1, assembliertes Plasmid in geschlossener und entspannter zirkulärer Form. (B) Overlap-Extension-PCR-Klonierungseffizienz eines gfp-Gens in Abhängigkeit von der Anzahl der PCR-Zyklen. Zwanzig Mikroliter kompetente E. coli-Zellen wurden mit 1 μL pQE30/insert Overlap Extension PCR transformiert. Die Anzahl der grünen Kolonien wurde für jede Platte gegen die Anzahl der PCR-Zyklen aufgetragen. (C) Overlap-Extension-PCR-Klonierungseffizienz in Abhängigkeit von der Insertlänge. Für die PCR-Amplifikation von Produkten unterschiedlicher Größe wurde die Phusion-DNA-Polymerase verwendet: GFP (gfp)-Gen, β-D-Glucuronidase (gusA)-Gen, β-Galactosidase (lacZ)-Gen und das luxABCDE-Operon aus dem Trägerplasmid pIMBB. Diese Produkte wurden gelgereinigt und in der Überlappungsextensions-PCR-Reaktion mit dem pQE30-Vektor verwendet. Drei Nanogramm pQE30-Vektor wurden mit 175-500 ng Insert in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl gemischt und 18 PCR-Zyklen unterzogen. Nach der DpnI-Behandlung wurden die PCR-Produkte der Überlappungsextension zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen verwendet. Die Anzahl der Kolonien pro Platte wurde gegen die Größe des Inserts aufgetragen.
Die Phusion-DNA-Polymerase war für die Overlap-Extension-PCR-Klonierung besser geeignet als die von uns getesteten Konkurrenten (ergänzende Tabelle S1), was möglicherweise auf ihre überlegene Prozessivität und Zuverlässigkeit zurückzuführen ist (11-12). Die Phusion-DNA-Polymerase ist 10× prozessiver als die native Pfu-Polymerase (Kat.-Nr. 600135; Stratagene, La Jolla, CA, USA) und produzierte 46× mehr Kolonien (siehe Tabelle S1). Sie produzierte auch 35-mal mehr Kolonien als die Expand Long Template DNA-Polymerase-Mischung (Kat. Nr. 11681834001; Roche, Basel, Schweiz), die hauptsächlich aus Taq-DNA-Polymerase besteht. Zuo und Rabie entwickelten eine ähnliche Methode mit Taq-DNA-Polymerase allein und berichteten über ähnlich bescheidene Klonierungseffizienzen (8). Die Taq-DNA-Polymerase ist relativ prozessiv (60 % im Vergleich zu Phusion), aber die Gesamttreue der Mischung beträgt nur 3,8 % derjenigen von Phusion. Mehr als 98 % der Kolonien, die mit der von der Phusion-DNA-Polymerase produzierten DNA transformiert wurden, waren sichtbar grün, was auf einen minimalen Klonierungsfehler oder eine Verschleppung des ursprünglichen Vektors hindeutet.
Wir haben die Effizienz der Überlappungsextensions-PCR-Klonierung als Funktion der Temperaturzyklen gemessen; die Zahl der rekombinanten Klone stieg während der ersten 15 Zyklen geometrisch an und erreichte bei 17-18 Zyklen ihren Höhepunkt (Abbildung 2B). Weitere Zyklen führten zu einem leichten (~30 %) Rückgang der Menge der erzeugten Klone, der mit der Anhäufung von DNA-Produkten mit hohem Molekulargewicht in Agarosegelen zusammenhing (Abbildung 2A). Auch das Verhältnis zwischen Insert und Plasmid kann einen deutlichen Einfluss auf das Ergebnis der Reaktion haben. Wir verglichen drei verschiedene Vektor:Insert-Verhältnisse (1:5; 1:50 und 1:250) in einer Overlap-Extension-PCR-Klonierungsreaktion mit Phusion-DNA-Polymerase. Alle drei Verhältnisse führten zum Auftreten der eingekerbten Form des Plasmids (beurteilt durch Agarosegel-Elektrophorese, nicht gezeigt) und rekombinanter Klone (beurteilt durch Transformation und Wachstum grüner Kolonien). Das Verhältnis 1:250 ergab die meisten rekombinanten Klone.
Dann klonierten wir mittels Overlap-Extension-PCR die Gene für GFP (gfp, 1 kb), β-D-Glucuronidase (gusA, 1,9 kb) und β-Galactosidase (lacZ, 3,2 kb) sowie das gesamte luxABCDE-Operon (6 kb). Die korrekte Struktur aller rekombinanten Vektoren wurde durch Restriktionsanalyse und Reporterproteinfunktion bestätigt. Die offensichtliche Fehlerquote unserer Methode, gemessen am Anteil der Kolonien, die keine volle Reporteraktivität aufwiesen, betrug <3 %, unabhängig von der Größe des Inserts (Daten nicht gezeigt). Gleichzeitig nahm die Zahl der Kolonien, die wir nach der Transformation auf den Platten beobachteten, mit zunehmender Insertlänge erheblich ab (Abbildung 2C). Das Diagramm ist fast linear, was darauf hindeutet, dass 6,7 kb die Obergrenze für Inserts mit dieser Technik ist.
Das Ergebnis eines Klonierungsprojekts hängt weitgehend von den Bemühungen und der Aufmerksamkeit des Arbeiters ab. Die hier beschriebene PCR-Klonierungsreaktion mit Überlappungsextension ist so einfach zu überwachen und zu optimieren wie jedes andere lange PCR-Protokoll (13). Im Allgemeinen ist die PCR-Ausbeute schlecht, wenn die Reaktionsbedingungen zu streng (Primer annealen nicht) oder zu locker (unspezifisches Priming) sind. Beides äußert sich durch leere Spuren in Agarosegelen, wobei letzteres auch zu Schlieren oder unerwünschten Banden führen kann (Einzelheiten zum Primerdesign und zur Optimierung der PCR-Reaktion siehe ergänzende Materialien). Die Stringenz der PCR kann durch Änderung der Konzentrationen der Reagenzien (Primer, Template), der Annealing-Temperatur, der Pufferbestandteile (Magnesium, pH-Wert, DMSO) oder der Anzahl der Temperaturzyklen gesteuert werden. Insgesamt erwies sich dieser Klonierungsansatz als unempfindlich gegenüber dem Vorhandensein der internen Wiederholungselemente (Einzelheiten siehe ergänzende Materialien). Die Phusion-DNA-Polymerase kann sowohl für die PCR-Amplifikation des Inserts als auch für die Overlap-Extension-Reaktionen verwendet werden, so dass sich der Praktiker nur mit den Eigenheiten eines einzigen Enzyms vertraut machen muss.