Design do gene, A tecnologia de fusão e as condições de clivagem TEV influenciam a purificação dos peptídeos venenosos ricos em bissulfetos oxidados na Escherichia coli

p>a produção de 24 proteínas recombinantes purificadas de fusão originadas de 3 diferentes desenhos genéticos. a Gel virtual mostrando os níveis de expressão de 24 peptídeos recombinantes obtidos a partir dos desenhos de genes A, B e C que foram purificados através do IMAC e avaliados usando o Labchip GXII (Caliper, EUA). b Comparação dos níveis de expressão da variante A (azul), variante B (laranja) e variante C (cinza) dos 24 peptídeos recombinantes. À direita estão representações das médias das variantes de expressão alta, média e baixa calculadas para os 16 peptídeos de fusão produzidos com rendimentos mais elevados. As médias sem uma letra comum diferem em P < 0.01

Foi analisada a correlação entre a seqüência primária das variantes gênicas e as propriedades que foram sugeridas para afetar a expressão. Os motivos deletérios, tais como 5′ mRNA estruturas secundárias não poderiam ter afetado os níveis de expressão, uma vez que os genes do veneno foram todos fundidos na mesma seqüência 5′-prime, que codifica o tag de fusão de proteínas. Não houve correlação entre expressão proteica e número de pontes de dissulfeto, tamanho do peptídeo, valor de CAI e conteúdo de GC (dados não mostrados). Isto sugere que as diferenças na expressão gênica foram determinadas por outras propriedades relacionadas à seqüência, em particular pelo uso do códon. A fim de investigar como as mudanças no uso do códon afetaram os níveis de peptídeos recombinantes, foi comparada a relação entre os rendimentos protéicos das variantes de expressão baixa, média e alta dentro dos 24 conjuntos de dados. As proteínas de fusão expressas em níveis mais baixos, que dizem respeito aos peptídeos 6, 7, 11, 13 e 14 (Fig. 1), foram excluídas da análise. Os dados revelaram que os rendimentos protéicos das variantes de expressão alta, média e baixa dos peptídeos analisados foram significativamente diferentes. Assim, os expressores inferiores produzidos em média 65,1 mg/L de proteína de fusão recombinante, enquanto os rendimentos protéicos de fusão dos expressores superiores foram, em média, de 87,55 mg/L (Fig. 1b). Estas diferenças são significativamente diferentes (p = 0,01).

Para avaliar quais diferenças no uso do códon poderiam explicar as diferenças observadas na expressão das proteínas, comparou-se o uso do códon de variantes de expressão baixa e alta. As tabelas de uso de códão incluindo genes contendo a etiqueta de fusão são apresentadas na Tabela S6. As principais diferenças no uso do códão dizem respeito em particular a um aminoácido, a cisteína, embora também tenham sido observadas pequenas alterações para outros resíduos, em particular arginina, asparagina, glutamato, histidina, isoleucina, fenilalanina e serina. A Tabela 1 mostra os dados resumidos de uso de códon para estes 8 aminoácidos. O viés de códão observado para genes de baixa expressão revelou uma preferência pelo códão Cys-TGC, enquanto que nos genes de alta expressão a Cys-TGT é favorecida. Além disso, nos genes de baixa expressão o Cys-TGC é usado 1,38 vezes mais frequentemente que o Cys-TGT, enquanto nos genes de alta expressão o Cys-TGT é usado apenas 1,04 vezes mais frequentemente que o Cys-TGC. Embora outros fatores possam eventualmente estar operando, esta observação sugere que a alta expressão dos genes codificadores de peptídeos requer uma contribuição similar dos códons Cys-TGC e Cys-TGT, sugerindo que uma porcentagem maior de um códon em comparação com o outro afetará a expressão. O uso de códão cisteína na E. coli também aponta para uma utilização mais equilibrada dos dois códões (Tabela 1). Para investigar fatores que possam explicar esta observação, foram comparadas a freqüência de aminoácidos nos genes de E. coli e nos 24 peptídeos venenosos selecionados para este estudo e suas proteínas de fusão associadas. Os dados, apresentados na Fig. 2, revelaram que a cisteína é ~12,5 e 3,5 vezes mais frequente nos peptídeos venenosos (14,3%) e nas proteínas de fusão recombinante (4,1%), respectivamente, do que na E. coli (1,16%). Assim, os dados sugerem que a expressão dos peptídeos venenosos em níveis elevados é favorecida pela presença dos dois códons cisteína em frequência semelhante nos genes sintéticos. Isto deve evitar o esgotamento de um códão quando os genes são expressos em níveis muito altos.

figure2

Comparação da frequência de aminoácidos na Escherichia coli com a frequência de cada aminoácido em peptídeos recombinantes analisados neste estudo. A porcentagem de abundância de cada aminoácido em E. coli é exibida em azul. Em vermelho, a frequência do mesmo aminoácido nos genes codificadores de peptídeos venenosos analisados neste estudo excluindo a sequência que codifica o tag de fusão. Um aumento dramático na porcentagem do aminoácido cisteína é observado nos peptídeos venenosos e isto é realçado por uma seta vermelha

Níveis de expressão dos peptídeos venenosos são afetados pelo tag de fusão

Cinco novos vetores para expressão de proteína recombinante em E. coli foram construídos pela inserção de diferentes tags de fusão na espinha dorsal pHTP1. Todas as etiquetas de fusão devem ser inseridas no termino N dos peptídeos recombinantes (Fig. 3). Dois dos vetores codificam parceiros de fusão que contêm um peptídeo de sinal para a expressão do peptídeo de veneno no periplasma (pHTP4, pHTP6). As demais marcas de fusão levarão à expressão da proteína recombinante citoplasmática (Fig. 3). Em todos os casos foi introduzido um tag 6HIS para permitir a purificação a jusante das proteínas de fusão usando a cromatografia de afinidade imobilizada de níquel. Foi introduzido um sítio de clivagem protease TEV (Vírus do etch do tabaco) (ENLYFQ/G) em todos os genes sintéticos para permitir a remoção do parceiro de fusão. Além da marca de afinidade 6HIS (pHTP1), os 5 novos vetores incluem a DsbC isomerase dissulfeto ou proteína de ligação de maltose (MBP). Um derivado mutante inativo da DsbC foi produzido para tentar discriminar os papéis da DsbC na solubilização passiva (relacionada ao rendimento da proteína de fusão) e na atividade redox (relacionada ao rendimento do peptídeo alvo corretamente dobrado). A representação esquemática de todos os vetores utilizados neste estudo é apresentada na Fig. 3.

representação esquemática dos vetores de expressão que contêm tags de fusão com e sem propriedades redox, que foram utilizados para expressão citoplasmática e periplasmática de peptídeos venenosos em Escherichia coli. Todos os vetores incluem um promotor T7, um local de ligação de ribossomos (rbs), um operador de laceração, um tag 6HIS para purificação de afinidade de níquel e um local de clivagem protease do Vírus do Tabaco Etch (TEV). A etiqueta 6HIS é N-terminal para o vector pHTP1 (a) e interna para os vectores de expressão incluindo etiquetas de fusão (b). As etiquetas pHTP4 (DsbC) e pHTP6 (MBP) transportam etiquetas de fusão contendo um peptídeo de sinal (representado em linhas verdes cruzadas) para direccionar a exportação da proteína de fusão para o periplasma das células de E. coli. O parceiro inativo de fusão DsbC, que contém duas mutações no local catalítico (C100A e C103A), foi inserido no pHTP3 (LLmutDsbC)

Sixteen well characterized venom peptides (including 7 that were part of the codon use experiment described above) with different origins and representing different folds and cysteine bond patterns were selected for this study (see Table S3). Os 16 genes sintéticos foram inseridos nos seis diferentes vetores de expressão (ver Tabela S2 e Fig. 3) gerando um total de 96 plasmídeos recombinantes. Os 96 construtos foram transformados em BL21 (DE3) pLysS. As cepas recombinantes de E. coli foram cultivadas em meios de auto-indução para obter altas densidades celulares. Após a purificação por afinidade de níquel, foi realizada análise sistemática dos eletroferogramas Labchip GXII para determinar a concentração das proteínas purificadas e comparar o peso molecular aparente das proteínas de fusão purificadas com o seu peso molecular teórico esperado. Os dados, apresentados na Fig. 4, revelaram que os 16 peptídeos podem de fato ser produzidos utilizando uma etiqueta de fusão. Dependendo do peptídeo e da fusão utilizada, os níveis de proteínas de fusão purificadas variaram de zero (principalmente quando os peptídeos foram clonados em pHTP1) a mais de 300 mg de proteína de fusão purificada por litro de cultura. Em geral, os peptídeos menores pareciam ser mais fáceis de produzir do que os maiores, mas existem vários contra-exemplos (como o T16 que é o maior peptídeo do estudo). Para os peptídeos 2, 4, 7, 8, 9, 14 e 15, diferentes vetores pareciam ser apropriados para a expressão da proteína de fusão, mas na maioria dos casos (13 de 16) o vetor pHTP4 (DsbC) superou todos os outros vetores. Em contraste, sem exceção, a expressão solúvel com 6HIS tag sozinho sempre foi muito baixa. A presença do peptídeo sinal leva a níveis mais altos de expressão para DsbC em todos os casos (pHTP4 versus pHTP2) duplicando em média a quantidade de proteína de fusão expressa. Para MBP (pHTP6 versus pHTP5) a sua presença dá uma tendência semelhante (10/16). Para os outros seis peptídeos, ou o nível citoplasmático foi semelhante (1, 5, 11) ou até significativamente melhor (2, 7, 14). No total de 16 peptídeos, quando a DsbC periplásmica não era a melhor opção, eram os citoplasmáticos (para os peptídeos 2 e 14) ou periplásmicos (peptídeo 4) MBP que eram as melhores opções. Finalmente, a inativação da função biológica da DsbC não teve efeito nos níveis de expressão das proteínas de fusão do peptídeo veneno, pois a expressão de pHTP2 e pHTP3 foram, em geral, muito semelhantes.

produções de 96 proteínas recombinantes purificadas de fusão originárias de 16 diferentes peptídeos de veneno animal em 6 fusões. Os peptídeos são organizados por massa crescente. Cada fusão é representada por um código de cor. O rendimento é expresso em miligrama de fusão por litro de cultura. As proteínas de fusão foram purificadas através do IMAC e avaliadas usando o Labchip GXII (Caliper, EUA). Peptídeos representados em caixas foram selecionados para o experimento de clivagem TEV (ver Fig. 5)

Clivagem de fusão, produção de peptídeos e estado de oxidação correto é afetado principalmente pelo parceiro de fusão e concentração de TDT em tampão de clivagem TEV

As condições ideais de clivagem TEV para liberação dos peptídeos alvo das etiquetas de fusão são afetadas por vários parâmetros, incluindo a relação enzima/substrato, composição do tampão, período de incubação e temperatura. Para investigar quais condições levariam ao melhor rendimento dos peptídeos venenosos dobrados, oito peptídeos foram selecionados da lista de 16 produzidos no experimento anterior (Ver arquivo adicional 3: Tabela S3, peptídeos em itálico, e Fig. 4, peptídeos em caixas). Como o parceiro de fusão da DsbC superou outras marcas em termos de rendimento de proteína de fusão e aplicabilidade geral, essas construções foram selecionadas para o estudo de otimização da clivagem do TEV. O único parâmetro que se revelou crítico e, portanto, foi afinado neste experimento foi a concentração de TDT (0, 0.1, 0.5 e 2 mM TDT) presente no tampão de clivagem. De fato, enquanto a protease TEV requer condições de redução para uma clivagem ótima, uma concentração excessiva de TDT poderia levar à redução das pontes intra-dissulfeto dos peptídeos e perda de dobra e atividade biológica.

Após um período de incubação de 18 h, uma alíquota da mistura peptídeo de fusão TEV foi acidificada. Uma fração (“antes” versus “depois” da clivagem do TEV) foi carregada no Caliper para determinar a eficiência da clivagem e uma amostra foi analisada no LC-MS para quantificar a toxina e confirmar o seu correto estado de oxidação. A eficiência da clivagem, análise de massa e rendimentos do peptídeo estão resumidos na Fig. 5. A clivagem ocorreu nas 32 condições testadas no ensaio (variando de 30 a 100% de eficiência). Como esperado, a clivagem não foi completa na ausência do TDT e completa com a maior concentração de TDT. Dos oito peptídeos, sete puderam ser detectados oxidados em quantidades de mg por litro de cultura. Das 32 amostras, 19 deram a massa oxidada correta sobre o LC-MS com vários rendimentos dependendo da concentração do TDT durante a clivagem. Para as 13 amostras restantes, não foram detectados picos no LC-MS. Dos sete peptídeos corretamente detectados em várias concentrações de TDT, quatro deram a maior recuperação em TDT 0,1 mM, enquanto dois não precisaram de TDT e um precisou de TDT 0,5 mM para uma recuperação ótima (Fig. 5, em negrito). Uma concentração de TDT de 0,1 mM parecia ser o melhor compromisso a ser mantido para os seguintes experimentos e para o pipeline de produção do Projeto VENOMICS. Alíquotas dos 7 peptídeos foram concentradas a 2 e 4 mg/mL e submetidas ao mesmo experimento com TDT de 0,1 mM para confirmar que seria possível a clivagem nestas condições. Em média, a eficiência caiu 20%, mas ocorreu em todos os casos (dados não mostrados).

eficácia da clivagem TDT em várias concentrações de TDT. A eficiência da clivagem representa a porcentagem de clivagem por fusão para cada concentração de TDT (0-2 mM) quantificada pelo Labchip GXII (Caliper, EUA) e representada em porcentagens. O correto estado de oxidação do peptídeo purificado foi confirmado pelo LC-MS (massa verde corresponde ao peptídeo oxidado, vermelho sem peptídeo detectado). Quando uma massa correta é detectada, o rendimento do peptídeo por litro de cultura quantificado pela integração dos picos de LC é indicado no poço

Seguir a otimização das condições de clivagem, as 96 proteínas de fusão purificadas (16 em 6 vetores, ver Fig. 4) foram clivadas na presença de TDT 0,1 mM na concentração das piscinas purificadas (variando principalmente de 0,2 a 2 mg/mL) seguindo o protocolo descrito acima. Após clivagem e acidificação, uma alíquota das 96 amostras foi analisada por LC-MS para confirmar a massa molecular correta, o rendimento e o estado de oxidação do peptídeo recombinante final do veneno. Quando detectados, os 96 peptídeos recombinantes tinham massas moleculares de acordo com as massas esperadas dadas os resíduos de cisteína totalmente oxidada (ver artigo anexo para mais detalhes sobre a análise de espectrometria de massa); as formas reduzidas das proteínas nunca foram detectadas (dados não mostrados), provavelmente devido à precipitação de peptídeos incorretamente oxidados durante as etapas de clivagem e acidificação. O rendimento final para as 96 construções, apresentado na Fig. 6, foi expresso como rendimento final absoluto do peptídeo em cultura mg/L ou normalizado a 100% para cada peptídeo em relação ao vetor utilizado para expressão. Os dados (Fig. 6) revelaram que todos os 16 peptídeos em estudo poderiam ser produzidos de forma recombinante, mas em níveis diferentes. Semelhante ao rendimento obtido para as variantes de fusão (Fig. 4), uma tendência geral sugere que os peptídeos mais curtos são mais fáceis de produzir do que os mais longos. O rendimento final do peptídeo veneno variou muito, com uma diferença de 50 vezes entre o pior caso (0,3 mg/L, T10 em pHTP6) e o melhor caso (17,6 mg/L, T1 em pHTP4). O conjunto de dados também revelou que houve uma queda significativa na produção após a clivagem da etiqueta de fusão. Isto é provavelmente devido à dura condição de recuperação após a clivagem (acidificação em acetonitrilo a 5%, ácido fórmico a 0,1%) onde no topo da protease TEV, qualquer peptídeo clivado se precipita. Como esperado da fusão, mesmo que a recuperação seja alta, os peptídeos produzidos com pHTP1 deram as menores quantidades de peptídeos em geral (0,4 mg/L em média, com um máximo de 1,9 mg/L para o T8). Em contraste, os peptídeos produzidos com pHTP4 (DsbC) alcançaram os melhores rendimentos finais de peptídeos para 11 de 16 peptídeos, e destes (com exceção do T11) os rendimentos foram superiores a 2 mg/L para cada peptídeo (4,6 mg/L em média). No total, as fusões DsbC (para expressão periplásmica ou citoplasmática) produziram 14 dos 16 peptídeos venenosos com sucesso. Além disso, um peptídeo (T7) só poderia ser produzido no periplasma, usando o parceiro de fusão DsbC, a partir do vetor pHTP4. Para peptídeos produzidos preferencialmente a partir de outros vetores (T10, 12, 13, 14, 16), os rendimentos não ultrapassam 2 mg/L, destacando-se a expressão robusta do vetor pHTP4. Para esses cinco peptídeos, os maiores rendimentos foram alcançados com expressão citoplasmática e um parceiro de fusão DsbC em três casos, seguido pela expressão periplasmática com o parceiro de fusão MBP em dois casos. Na maioria dos casos (exceto T13,T14 e T16), a fusão exportada para o periplasma (tanto para DsbC quanto para MBP) superou seu equivalente citoplasmático, indicando que pelo menos parte da dobra poderia ocorrer no periplasma e parte poderia ocorrer ex vivo durante a purificação. Uma demonstração surpreendente de que a DsbC (e provavelmente MBP) age, em parte, como um agente solubilizante passivo dentro da bactéria é o fato de que enquanto os rendimentos da fusão entre a DsbC e as construções mutantes de DsbC foram muito semelhantes para a maioria dos peptídeos (Fig. 4), após a clivagem e recuperação, o rendimento global do peptídeo ativo é em média três vezes maior no caso da fusão da DsbC redox-ativa do que com a sua contraparte mutante de DsbC. O detalhe dos valores quantitativos foi resumido no arquivo adicional 7: Tabela S7.

Yields of 96 purified recombinant peptidees after tag removal. Os peptídeos são organizados por massa crescente. Cada etiqueta de fusão original usada para expressar cada peptídeo é representada por um código de cor (idêntico ao da Fig. 4). O rendimento é em miligrama de peptídeo oxidado por litro de cultura. O correto estado de oxidação do peptídeo purificado foi confirmado pelo LC-MS e o rendimento do peptídeo por litro de cultura quantificado pela integração dos picos do LC. a Concentração em mg/L de cultura. b O rendimento do peptídeo é apresentado em porcentagem em relação à melhor condição para melhor visualizar os peptídeos de baixa expressão. Os peptídeos descritos em caixas foram selecionados para o experimento de clivagem TEV (Fig. 5)

A natureza do resíduo C-terminal (P1′) do sítio de clivagem TEV não afeta significativamente a eficácia da clivagem

O N-terminus de alguns peptídeos venenosos pode contribuir para seus sítios de ligação dos receptores. Assim, é possível que a introdução de um único resíduo extra no N-terminal do peptídeo possa afetar sua atividade biológica. O site de reconhecimento canônico da protease TEV requer um resíduo Gly ou Ser no seu terminal C (P1′), deixando um resíduo Ser ou Gly não nativo no terminal N do peptídeo alvo após a remoção da etiqueta. Um estudo anterior sugeriu que, com exceção da prolina, todas as cadeias laterais de aminoácidos poderiam ser acomodadas na posição P1′ de um site de reconhecimento da protease TEV com pouco impacto na eficiência do processamento. A análise foi, no entanto, realizada em condições ideais de tampão TEV. Para ser eficiente no tempo, a tubulação de produção do peptídeo venenoso não pode acomodar etapas adicionais, como a troca do tampão em condições ideais de TEV. Assim, foi investigada a capacidade da protease TEV de atuar no tampão de eluição IMAC (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazole 250 mM, DTT 0,1 mM, pH8), um tampão não óptimo para proteólise TEV. A protease TEVSH utilizada neste estudo foi seleccionada porque é fácil de produzir em excesso e purificar em E. coli em quantidades muito elevadas (até 100 mg/L de cultura). No entanto, a especificidade da clivagem deste derivado recombinante da protease TEV permanece desconhecida, em particular quando vários aminoácidos ocupam a posição P1′ do seu site de reconhecimento (Dr. H. Berglund, comunicação pessoal). Assim, para explorar a actividade desta protease TEVSH em condições não óptimas e quando a posição do sítio de reconhecimento da protease P1′ é variada, foram produzidas 20 sequências de proteína de fusão de teste de clivagem. Cada proteína de fusão continha uma etiqueta N-terminal 6HIS, uma sequência interna de reconhecimento TEV, cada uma contendo um aminoácido diferente na posição P1′, fundido C-terminalmente a uma forma truncada da proteína Kin17 de ligação DNA/RNA do Homo sapiens. As proteínas foram purificadas e submetidas à clivagem protease TEV nas mesmas condições que as utilizadas para clivar as 96 marcas de fusão (ver acima). Os dados, apresentados na Fig. 7, confirmam dados anteriores coletados e sugerem que, com exceção da prolina (a probabilidade de ter uma prolina na posição 1 de peptídeos venenosos de origem natural é baixa), todos os outros resíduos podem ser acomodados na posição P1′ do local de reconhecimento da protease TEV, mantendo alguma atividade de clivagem. No entanto, deve-se considerar os peptídeos com N-terminal Trp, Thr, Leu, Glu, Arg, Asp, Val ou Ile, onde a eficiência da clivagem cai para 60% ou menos. Nestes casos, pode ser necessário alcançar um compromisso entre eficiência de clivagem/produção, dependendo de quão bem o peptídeo se expressa.

eficiência da clivagem protease de Kin17 com 20 aminoácidos diferentes localizados na posição P1′. Os aminoácidos são organizados desde os mais fáceis até os mais difíceis de clivar. Os valores estão em porcentagem

Nota que, ao contrário dos peptídeos venenosos, Kin17 não contém resíduos de cisteína. Assim, o sucesso da clivagem quando um resíduo de cisteína está na posição 1 (86%) obtido com Kin17 precisa ser confirmado para os casos de peptídeos com uma cisteína na posição 1 que provavelmente estaria envolvida em uma ponte de bissulfeto na proteína nativa.