B. Epitopos de células B
Restringimos nossa discussão a epitopos de células B em proteínas e peptídeos; epitopos em outros biopolímeros e grupos hápteis não são cobertos. A primeira generalização importante sobre os epitopos das células B é que eles são dirigidos contra características tridimensionais da superfície molecular das proteínas e dos polipeptídeos. Uma topologia tridimensional particular é uma marca registrada dos epitopos de células B em oposição aos epitopos de células T. É provável que qualquer resíduo de aminoácidos acessível da superfície de uma proteína possa fazer parte de um ou outro epitopo de célula B (Benjamin et al., 1984). Assim, as proteínas podem conter muitos epitopos diferentes embora, por razões estéreis, apenas um número limitado de anticorpos possa ligar-se ao antígeno em qualquer altura. A resposta das células B é estereoespecífica, sendo muito mais fraca contra os enantiómeros dos peptídeos (Gill et al., 1963) e proteínas (Dintzis et al., 1993), possivelmente porque as proteínas d-enantioméricas não são processadas eficientemente para produzir peptídeos para a ajuda das células T.
Earlier, acreditava-se que as proteínas tinham uma estrutura antigénica bem definida, caracterizada por um número limitado de epitopos. O conhecimento da natureza complexa da resposta imunológica da célula B e sua regulação, e da especificidade dos anticorpos monoclonais às proteínas, deixou claro que uma proteína não possui uma estrutura antigênica definida. Não é possível definir a “estrutura antigênica completa” de uma proteína, ao contrário do que tem sido afirmado por alguns investigadores (Atassi e Lee, 1978; Atassi, 1984). A antigenicidade de uma proteína é tanto uma propriedade da topografia proteica como dos mecanismos reguladores do sistema imunológico do hospedeiro, incluindo a tolerância a estruturas que se assemelham às próprias proteínas do hospedeiro, a especificidade da ajuda das células T e as redes idiotípicas (Benjamin et al., 1984; Berzofsky, 1985). Os sítios imunodominantes, ou seja, sítios para os quais a maioria, mas não todos, os anticorpos da resposta imunológica são dirigidos, não são uma propriedade intrínseca per se da proteína. Como já foi dito por outros, os epitopos não existem por direito próprio, mas apenas em virtude de uma ligação com o sítio de ligação de anticorpos complementares, o chamado paratope (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Assim, um epitopo é um conceito relacional, e a definição de um epitopo é necessariamente operacional (Van Regenmortel, 1986). Em outras palavras, a definição de um epitópo particular depende em grande parte da geometria molecular e da natureza química do paratope correspondente e, talvez mais importante, da abordagem experimental escolhida para mapear o epitópo.
Este estado de coisas pode ser ilustrado pelo exemplo do primeiro complexo proteína-anticorpo cuja estrutura foi resolvida pela cristalografia de raios X (Amit et al., 1986). Neste complexo, 16 resíduos de lisozima contactam 17 resíduos de um Fab monoclonal (fragmento de anticorpo) a lisozima. O epitópo estende-se por 750 Å2 da superfície da lisozima. Em contraste, o mapeamento do epitopo com uma série de lisozimas aviárias relacionadas com a sequência indica que apenas alguns resíduos são importantes para a ligação da lisozima aos anticorpos monoclonais anti-lisozima. A mutação de muito poucos resíduos pode reduzir radicalmente a constante de associação do complexo lisozima-anticorpo (Harper et al., 1987). Em um caso, uma única substituição de Arg por Lys reduziu em duas ordens de magnitude a afinidade da lisozima por um anticorpo monoclonal (Smith-Gill et al., 1982). Cálculos teóricos baseados nas estruturas cristalinas de dois complexos de lisozima com fragmentos de Fab demonstraram que, dos muitos resíduos que definem o epitópo no cristal, apenas alguns contribuem efetivamente para a estabilidade do complexo (Novotny et al., 1989). Com base em seus cálculos, Novotny et al. distinguiram entre um epitopo energético e um epitopo passivo. O epitópo energético engloba aqueles resíduos que contribuem para a energia de ligação. O epitopo passivo fornece apenas complementaridade superficial em torno dos resíduos que formam o epitopo energético. Que apenas algumas das interacções vistas na estrutura cristalina desempenham um papel importante na estabilização do complexo antigénio-anticorpo foi confirmado para a ligação do vírus da gripe neuraminidase a um anticorpo monoclonal. Dezenove resíduos da neuraminidase contatam 17 resíduos do anticorpo no cristal, mas a mutação de apenas 3 resíduos específicos do local aboliu totalmente a ligação (Air et al., 1990; Nuss et al., 1993).
Uma distinção operacional de epitopos mais geralmente aplicável é aquela entre um epitópo de contato e um epitópo funcional. O epitopo de contato refere-se a informações obtidas a partir da estrutura tridimensional do complexo antígeno-anticorpo; o epitopo funcional refere-se a informações de procedimentos de mapeamento não cristalográfico, incluindo mapeamento de epitopos com peptídeos. Um epitopo de contato é representado por um ajuste correspondente entre grandes áreas de superfície complementares de antígeno e anticorpo, como visto em várias estruturas de raios X de complexos proteína-anticorpo (Davies e Padlan, 1990; Wilson e Stanfield, 1994; Braden e Poljak, 1995). Epitopos de contato cobrem várias centenas de angstroms quadrados de superfície molecular. O epitopo funcional define resíduos que parecem significativos para a ligação de anticorpos e cuja mutação pode reduzir ou abolir totalmente a ligação. O epitópo funcional pode compreender tão pouco quanto 2 a 3 resíduos, como nos exemplos de lisozima e neuraminidase mencionados acima. Não é possível deduzir o epitópo de contato a partir do epitópo funcional. Da mesma forma, o epitópo de contato por si só não revela o epitópo funcional. Por parte do anticorpo, também se pode diferenciar dois tipos de parátopos: um parátopo funcional e um parátopo de contato. Isto decorre da análise termodinâmica da complementaridade que determina as regiões de um anticorpo monoclonal (Kelley e O’Connell, 1993).
A natureza dual de um epitópo revelada por técnicas de cristalografia e mapeamento não cristalografico reflete dois modelos diferentes de reconhecimento molecular. Vista desta forma, a dificuldade em definir a natureza dos epitopos é deslocada para o nível de uma dificuldade epistemológica: como devemos modelar a realidade pelos meios experimentais restritos à nossa disposição? Estes limites serão tidos em conta na discussão do mapeamento de epitopos por peptídeos.
Aqui devemos mencionar a classificação conceptual há muito conhecida dos epitopos de células B em sequencial e conformacional (Sela et al., 1967; Sela, 1969; Atassi e Smith, 1978). Um epitopo é chamado sequencial ou contínuo se puder ser representado por uma série de resíduos contíguos de uma cadeia de polipeptídeos. Diz-se que um anticorpo reconhece um epitópo sequencial se ele reagir com um peptídeo curto e flexível ou com a cadeia de polipeptídeos desnaturada e desdobrada. Um epitópo conformacional, também chamado descontínuo ou topográfico ou montado, é construído a partir de partes não contíguas da seqüência de aminoácidos através da dobra da cadeia de polipeptídeos na proteína nativa. Diz-se que um anticorpo reconhece um epitopo conformacional se reagir com uma proteína nativa e não com a cadeia de polipeptídeos desdobrada, ou se reagir com um peptídeo de conformação única, por exemplo, uma hélice, mas não com um peptídeo de bobina aleatória.
A distinção entre epítopos seqüenciais e conformacionais é um tanto arbitrária e pode ser enganosa. Como cada paratope tem uma estrutura tridimensional bem definida, a interação entre paratope e epitopo é sempre um ajuste de estruturas no espaço tridimensional. Isto aplica-se a um epitopo numa proteína globular bem ordenada, bem como a um epitopo num peptídio curto e flexível. Neste último caso, o peptídeo também deve adoptar uma conformação única quando se liga ao anticorpo; portanto, um epitópo contínuo também é “conformacional”. A conformação de ligação ou pré-existe ou é induzida pelo paratope (ver secções V,B e V,C).
No caso dos anticorpos às proteínas nativas, tem sido argumentado que a maioria ou talvez todos os epitopos são descontínuos (Barlow et al., 1986). Devido ao grande tamanho de um epitopo de contato típico em um cristal de antígeno-anticorpo, é realmente improvável que um anticorpo se ligue exclusivamente a um trecho contíguo da cadeia de polipeptídeos e não entre em contato com resíduos separados em seqüência, mas próximos no espaço. Os modelos de proteínas que preenchem o espaço mostram poucos estiramentos lineares com mais de 4 a 5 resíduos na ligação directa do peptídeo acessível na superfície da molécula. Isto não quer dizer que um anticorpo dirigido contra um epitopo montado na superfície de uma proteína não possa ter uma reação cruzada também com um peptídeo correspondente a um segmento da proteína.
Concluindo nossa visão geral sobre a natureza dos epitopos das células B, enfatizamos mais uma vez a pura dificuldade de dar uma definição geral de “epitopo”. Um recurso pragmático a definições operacionais pode não agradar ao purista, mas definições operacionais podem ser úteis na resposta a perguntas sobre o caráter de uma interação antígeno-anticorpo particular.