Caracterización del antiinflamatorio Lactobacillus reuteri BM36301 y sus beneficios probióticos en ratones envejecidos

Caracterización de bacterias lácticas probióticas

Hemos estado aislando bacterias lácticas (BL) durante años de varias fuentes, incluyendo humanos, animales, plantas y productos alimenticios. Estas colecciones de Microorganismos Benebios (BM) están compuestas por más de 500 cepas, con potenciales probióticos revelados a partir de sus cribados iniciales. En este estudio, elegimos cuatro cepas comensales humanas derivadas de muestras fecales y las estudiamos en detalle (Tabla 1). Las examinadas específicamente fueron dos cepas de Lactobacillus reuteri (BM36301 y BM36304), una cepa de L. gasseri (BM33601) y una cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BM10307).

Examinamos las bacterias con respecto a sus calificaciones generales como probióticas (Tabla 1). En primer lugar, estas cepas de BM mostraron resistencia contra los ácidos (pH 2,5) y las sales biliares (0,3 %), demostrando un rango de tasa de supervivencia del 43 % al 98,5 % después de 1 h de tratamiento a 37 °C, que son puntuaciones razonablemente altas . A continuación, probamos las actividades antimicrobianas contra las bacterias entéricas. Mientras que L. gasseri BM33601 mostró una inhibición mínima de la cepa probadora E. coli, todas las demás formaron zonas inhibitorias distintas (a 0,5-3 mm de distancia de los bordes de la LAB). Estos efectos inhibitorios suelen ser causados por las bacteriocinas, los ácidos orgánicos (ácido láctico o ácido acético), el peróxido de hidrógeno o el etanol de las BL. Por último, examinamos su capacidad para unirse a las células epiteliales intestinales humanas (IEC) in vitro. Para ello, cultivamos células humanas de cáncer de colon, HT-29, en cubreobjetos durante 15 días y aplicamos cultivos vivos de BAL sobre ellas durante 1 hora (Métodos). Tras un lavado exhaustivo, las células bacterianas restantes se visualizaron mediante tinción de Gram para su recuento al microscopio. Las cepas de L. reuteri BM36301 y BM36304 mostraron altas puntuaciones de retención (5,5-7,4 bacterias por HT-29), mientras que L. gasseri BM33601 tuvo puntuaciones moderadas (1,7 bacterias por HT-29) y B. animalis subsp. lactis BM10307 tuvo puntuaciones bajas (0,3 bacterias por HT-29). Una mayor adhesión de las BAL a las CEI es especialmente importante, ya que necesitan permanecer en la capa de la mucosa intestinal el tiempo suficiente para que los beneficios surtan efecto en el huésped. A partir de estos experimentos primarios, las dos cepas de L. reuteri revelaron un mayor potencial como probióticos de calidad.

Regulación de la producción de TNF-α por parte de las bacterias lácticas in vitro

Nos propusimos examinar las BAL por su potencial para suprimir la inflamación intestinal. Para ello, adaptamos un sistema de cultivo tisular in vitro en el que las células mieloides humanas (THP-1) secretan TNF-α tras la activación de sus receptores tipo Toll (TLR) por el lipopolisacárido bacteriano (LPS) . En primer lugar, comprobamos que las células THP-1 de 5 × 104 en 1 ml de cultivo tratadas con LPS a una dosis de 150 ng/ml durante 3,5 h solían producir 200-300 pg/ml de TNF-α (Fig. 1a, carriles 1 y 2). A continuación, recogimos los sobrenadantes de los cultivos bacterianos cultivados durante 24 h, los secamos al vacío y reconstituimos el medio condicionado (MC) (Métodos). Este MC contiene actividades complejas tanto para suprimir como para inducir el TNF-α, dependiendo de la BL y de las condiciones de cultivo. De hecho, observamos una ligera producción de TNF-α por parte de los MC de BM36304 y BM36301 sin LPS, pero esta cantidad era inferior al 20 % de la inducción estimulada por LPS (datos no mostrados). Por último, añadimos a cada CM hasta un 5 % de cultivo de THP-1 (v/v) en presencia de LPS (Fig. 1a, carriles 3-6). La producción de TNF-α con LPS (208 ± 49 pg/ml, carril 2) se suprimió al 40 % con el CM de L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, carril 3), y al 52 % con el CM de B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, carril 6). Para nuestros fines de selección, consideramos que la supresión del TNF-α cercana o inferior al 50 % de la expresión por el tratamiento con LPS era antiinflamatoria. Sin embargo, las CM de L. reuteri BM36304 y L. gasseri BM33601 no fueron capaces de suprimir la producción de TNF-α hasta ese punto. Verificamos esta actividad inerte preparando estos CMs bajo varias condiciones de cultivo (datos no mostrados).

Inmunomodulación por parte de bacterias lácticas in vitro. a Examen de bacterias lácticas (BL) con medio condicionado (MC) para actividades antiinflamatorias contra la producción de TNF-α inducida por LPS en THP-1. Sin LPS, se observó una cantidad no detectable de TNF-α (carril 1). Con un tratamiento de 150 ng/ml de LPS, las células THP-1 produjeron cantidades significativas de TNF-α (carril 2). Cada CM se trató al 5 % del volumen de cultivo de THP-1 para evaluar sus efectos inhibidores (carril 3, L. reuteri BM36301; carril 4, L. reuteri BM36304; carril 5, L. gasseri BM33601; y carril 6, B. animalis subsp. lactis BM10307). Se preparó CM del medio de control (MRS) y se añadió en los carriles 1 y 2. * indica p < 0,03 de la prueba t entre el control (carril 2) y el CM tratado con BM36301 (carril 3) o con BM10307 (carril 6). Las barras muestran los promedios con la desviación estándar (SD) de 5 ensayos independientes. b Examen de LAB con células vivas para actividades proinflamatorias para inducir la producción de TNF-α en células THP-1. Se aplicaron alrededor de 1,5 × 108 células bacterianas de cultivos de crecimiento exponencial a 6 × 105 células THP-1 durante 6 h. Se recogieron los sobrenadantes libres de células y se evaluó la secreción de TNF-α por el método ELISA. Los resultados muestran los promedios con SD de 4 experimentos independientes. c Resumen de la inmunomodulación in vitro por varias bacterias lácticas

A continuación, examinamos la capacidad de inducción de TNF-α de las propias células bacterianas porque los componentes celulares de las bacterias Gram positivas pueden inducir respuestas inflamatorias . Para ello, cultivamos las bacterias hasta una fase exponencial (16 h), luego las cosechamos, lavamos y añadimos estas células bacterianas vivas en exceso (250 veces el número de células) al cultivo de THP-1. Las actividades metabólicas de las células bacterianas se mantuvieron minimizadas por los antibióticos añadidos en el medio THP-1. Tras 6 h de incubación, se midió cuantitativamente el TNF-α secretado (Fig. 1b). Aunque se encontró que las cuatro células LAB inducen TNF-α, BM36301 produjo una cantidad significativamente menor (609 pg/ml) que las otras: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml), y BM10307 (7141 pg/ml). Durante esta coincubación de 6 horas, observamos que las células THP-1 experimentaron una muerte celular variable en función del BAL utilizado (archivo adicional 1). En particular, BM36301, el inductor de TNF-α más bajo, causó la menor cantidad de muerte de THP-1 (9,7 %), mientras que las otras cepas inductoras de TNF-α más altas causaron una muerte significativamente más prominente (24-38 %). Por lo tanto, no es el caso de que BM36301 indujera un bajo TNF-α debido a la pérdida de viabilidad de THP-1 per se. Para nuestros fines de cribado, consideramos las BAL con una producción activa de TNF-α de más de 1000 pg/ml como proinflamatorias.

En resumen, las actividades de inmunomodulación in vitro se asignaron como antiinflamatorias con las CM supresoras (BM36301 y BM10307) y proinflamatorias con las células vivas inductoras (BM36304, BM33601 y BM10307). Dado que BM10307 mostró ambas actividades, lo asignamos como poseedor de una funcionalidad dual (Fig. 1c). Fue interesante observar que las dos cepas de L. reuteri mostraron actividades distintas. En el cribado inicial de nuestra amplia gama de colecciones de BM, las cepas antiinflamatorias resultaron ser bastante escasas, con una tasa de descubrimiento inferior al 5 % (datos no mostrados). También algunas cepas no mostraron ninguna de las dos actividades, cayendo así en la categoría de «neutras» (datos no mostrados).

Las moléculas supresoras en los CMs son estables frente al calor y la tripsina

Dado que el CM de LAB está compuesto por varios metabolitos bacterianos así como por componentes celulares, buscamos entender mejor la naturaleza antiinflamatoria del CM. La expresión de TNF-α disminuyó cuantitativamente con el aumento de las concentraciones de los CM de L. reuteri BM36301 (Fig. 2a) y B. animalis subsp. lactis BM10307 (Fig. 2b). Curiosamente, una menor cantidad de CM de BM36301 (0,5× entrada o 2,5% v/v) en realidad indujo el TNF-α más, consistente con la observación de que este CM contiene materiales inductores de TNF-α en cierta medida (Fig. 2a, carriles 2 y 3). No obstante, los efectos supresores se volvieron dominantes ante mayores cantidades de CM, lo que sugiere que los materiales antiinflamatorios son cuantitativamente aditivos y que los receptores correspondientes en la superficie de las células THP-1 son lo suficientemente abundantes como para responder fácilmente al aumento del tratamiento con CM. En general, estas observaciones sugieren que los MC contienen metabolitos activos responsables de la supresión del TNF-α, a pesar de su naturaleza compleja.

Los CMs supresores son cuantitativos y resistentes al calor y a la digestión enzimática.Un CM de la cepa BM36301 de L. reuteri reprime la producción de TNF-α de las células THP-1 tratadas con LPS de forma cuantitativa. Los niveles de TNF-α producidos a partir de los cultivos de THP-1 con (carriles 2 – 6) o sin (carril 1) LPS se midieron por el método ELISA. Para el tratamiento del CM, se añadió el 2,5 % (0,5×, carril 3), el 5 % (1×, carril 4), el 10 % (2×, carril 5) o el 15 % (3×, carril 6) del volumen de cultivo de THP-1 (v/v) en el momento de la estimulación con LPS. Se añadió CM del medio de control (MRS) al 5 % en los carriles 1 y 2. Los datos muestran los promedios con DE de 3 ensayos independientes. b El CM de la cepa BM10307 de B. animalis subsp. lactis contiene metabolitos que reprimen la producción de TNF-α de las células THP-1 tratadas con LPS de forma cuantitativa. El LPS y el CM fueron tratados como se indica. Se añadió CM del medio de control (BL) al 5 % en los carriles 1 y 2. Los datos proceden de 3 experimentos independientes. c Los CM de BM36301 (gris) o BM10307 (negro) fueron hervidos (carril 4) o tratados con tripsina (carril 5) para comparar sus actividades con los CM nativos (carril 3). Los resultados son promedios con SD de 3 experimentos independientes

Examinamos además las características fisicoquímicas de los materiales antiinflamatorios en los CMs. Se comprobó que hervir los CMs de cada cepa durante 10 min no alteraba sus funciones inhibidoras del TNF-α en comparación con los CMs nativos (Fig. 2c, carriles 3 y 4). Asimismo, el tratamiento con tripsina no afectó a sus actividades (Fig. 2c, carril 5). Estas observaciones sugieren que los principales factores inhibitorios en estas CMs no son ni proteínas ni moléculas sensibles al calor.

Regulación del TNF-α en ratones con bacterias probióticas

La última pregunta con respecto a la regulación in vitro del TNF-α basada en nuestro cribado de LAB fue la relevancia que tendría con las aplicaciones in vivo. Intentamos responder directamente a esta pregunta aplicando las cepas de L. reuteri seleccionadas a un sistema modelo de ratón. Preparamos ratones C57BL/6 de 20 semanas de edad con 6 machos y 8 hembras por grupo. Luego, durante un período de 20 semanas, un grupo fue tratado con el antiinflamatorio BM36301, otro grupo fue tratado con el proinflamatorio BM36304, y el grupo de control fue tratado con dextrosa (Métodos). Como medio para minimizar la angustia de los animales, los cultivos de BL se administraron a través del agua de bebida para cumplir con la dosis de consumo diario de 1 × 106 bacterias por ratón. También se proporcionó una dieta estándar para que el proceso de envejecimiento fuera natural durante el periodo. Al final de las 20 semanas de incubación (un total de 40 semanas de edad), practicamos la eutanasia a los ratones y les extrajimos sangre para la preparación del suero con el fin de medir las citocinas y la testosterona mediante métodos ELISA cuantitativos. Al realizar la necropsia, no encontramos anormalidades morfológicas gruesas.

TNF-α de ratones C57BL/6 suplementados con bacterias probióticas. a El TNF-α del suero de ratones macho (n = 6 cada uno) alimentados con la cepa L. reuteri. ** Indica p = 0,006 de la prueba t en comparación con el grupo de control (carriles 1 y 3). b El TNF-α del suero de ratones hembra (n = 8 cada uno) alimentados con la cepa L. reuteri. * indica p = 0,017 de la prueba t en comparación con el grupo de control (carriles 1 y 2)

En resumen, observamos una reducción del TNF-α sérico con el antiinflamatorio BM36301, con un efecto más pronunciado observado en las hembras. El proinflamatorio BM36304 provocó un aumento del TNF-α en los machos, pero no en las hembras. Estos hallazgos sugieren que nuestro cribado in vitro tiene una relevancia significativa con el mantenimiento in vivo del TNF-α en estos ensayos con ratones.

L. reuteri BM36301 mantuvo un aumento de peso corporal reducido y una testosterona elevada en ratones macho

El envejecimiento es la fuente de muchos problemas de salud en los seres humanos, incluyendo la diabetes y la obesidad. Para exacerbar estos problemas de envejecimiento en el modelo animal, a menudo se emplean dietas altas en grasas . Sin embargo, la interpretación de estos experimentos acelerados puede ser complicada, ya que el envejecimiento en los humanos no debería ser provocado por una dieta alta en grasas. Cultivamos todos los ratones con una dieta estándar para que su proceso de envejecimiento fuera lo más natural posible. En el periodo de 20 semanas del experimento, a partir de la edad de 20 semanas, los machos del grupo de control ganaron unos 8 g de peso (7,83 ± 1,2 g) y las hembras del grupo de control ganaron unos 5 g de peso (4,8 ± 0,94 g). Cabe destacar que el aumento de peso en los machos alimentados con el antiinflamatorio BM36301 fue significativamente menor que en el control (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040) en un 36 % (Fig. 4a, carriles 1 y 2). Sin embargo, el aumento de peso de los machos tratados con BM36304 (7,53 ± 0,74 g) no fue significativamente diferente del control (p = 0,67). Los aumentos de peso de los grupos de hembras no fueron estadísticamente diferentes entre sí.

Ratones macho envejecidos suplementados con L. reuteri BM36301 mantienen un índice corporal saludable. a Aumento de peso neto de los ratones C57BL/6 (n = 6 para los machos, barra gris; n = 8 para las hembras, barra oscura) alimentados con cada cepa de L. reuteri durante 20 semanas. * indica p = 0,040 de la prueba t en comparación con el grupo de control (carriles 1 y 2 para machos). b Concentración de insulina en suero de los ratones alimentados con cada cepa de L. reuteri como en (a). ** indica p = 0,027 de la prueba t en comparación con el grupo de control (carriles de machos 1 y 3). c Cantidad de testosterona en suero de los ratones machos alimentados con cada cepa de L. reuteri como en (a). *** indica p = 0,0025 de la prueba t en comparación con el grupo de control (carriles 1 y 2)

Otra diferencia significativa fue el nivel de insulina sérica de los machos tratados con BM36304 (Fig. 4b). Mientras que el grupo de machos de control mostró 3,18 ± 0,65 ng/ml de insulina, el grupo de machos alimentados con BM36304 mostró 4,91 ± 0,63 ng/ml de insulina (p = 0,027). Sin embargo, en consonancia con el hallazgo de que el aumento de peso de este grupo no era muy diferente del control (Fig. 4a), no observamos una acumulación de grasa abdominal más prominente en los machos tratados con BM36304 (datos no mostrados). A las 40 semanas de edad, el pico de insulina puede no haber causado una diabetes clínicamente evidente en los ratones, pero la enfermedad puede haberse acentuado si los ratones envejecen más. La variación de la insulina entre los grupos de hembras no fue significativamente diferente entre sí.

Por último, nos centramos en los niveles de testosterona de los machos. Como se muestra en la Fig. 4c, los machos alimentados con BM36301 antiinflamatorio conservaron niveles significativamente más altos de testosterona sérica (5,18 ± 0,87 ng/ml) que el grupo de control (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). Sin embargo, el grupo tratado con BM36304 no fue estadísticamente diferente (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) del control. Para comprender mejor los resultados de la testosterona, examinamos los testículos de cada ratón. El peso de los testículos emparejados de los machos alimentados con BM36301 era de 0,579 ± 0,075 g, un 10 % más pesado que el del control (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Teniendo en cuenta la menor ganancia de peso en el grupo BM36301 (Fig. 4a), esta diferencia de tamaño de los testículos es más evidente; la relación entre el peso de los testículos y la ganancia de peso corporal (TW/WG) del control era sólo el 67 % de la del grupo BM36301. Sin embargo, no pudimos observar diferencias microscópicas de los tejidos de los testículos, como el diámetro de los túbulos seminíferos entre estos dos grupos (156,03 ± 6,65 μm del control frente a 153,95 ± 18,66 μm de los machos tratados con BM36301, p = 0,51). No hemos realizado otros estudios como la comparación de la espermatogénesis o el área de las células de Leydig.

En resumen, el antiinflamatorio BM36301 ayudó a los machos a mantener un menor aumento de peso con testículos más grandes y más testosterona a medida que envejecían. Se ha propuesto que la reducción de la producción de testosterona en los varones de edad está relacionada con las lesiones dependientes de la edad en los testículos, presumiblemente como resultado de un insulto inflamatorio . Por su parte, la bacteria proinflamatoria BM36304 provocó un aumento de la insulina, aunque sin cambios en el aumento de peso o la testosterona entre los varones. Notablemente, ninguna de estas cepas bacterianas tuvo influencias significativas en estas medidas corporales en los ratones hembra.

Piel femenina saludable gracias al antiinflamatorio BM36301

Una característica interesante de ciertos probióticos es que pueden promover la salud de la piel de una manera dependiente de la regulación inmunológica . Dado que el BM36301 también mostró efectos antiinflamatorios in vitro e in vivo, nos preguntamos si esta cepa puede provocar tales beneficios para la salud de la piel. A la 18ª semana de tratamiento, afeitamos una zona en 2 ratones de cada grupo y los examinamos al cabo de una semana. Curiosamente, los ratones hembra alimentados con BM36301 mostraron un crecimiento más rápido del pelo, aunque no una recuperación total, en la zona afeitada (Fig. 5a). En cambio, los grupos de control o BM36304 no mostraron un ritmo de recuperación tan rápido. Ninguno de los machos tratados mostró un recrecimiento del pelo distinguiblemente más rápido que el control, lo que indica que este crecimiento acelerado del pelo puede ser evidente sólo en las hembras. Otra métrica para evaluar la salud de la piel es el examen del brillo del pelo. Sin embargo, no observamos diferencias significativas entre cada grupo a través de mediciones sensoriales o de medidores de luz, principalmente debido a las condiciones de pelaje relativamente brillante de los controles (datos no mostrados).

Los ratones hembra envejecidos suplementados con la cepa de L. reuteri BM36301 muestran pieles sanas. a Experimento de recrecimiento del pelo en ratones C57BL/6 que consumen agua tratada con la cepa de L. reuteri o agua de control. Se afeitó claramente una zona de la piel de 2 × 2 cm de ancho y se examinó el recrecimiento del pelo una semana después. b Se recogieron recuentos de folículos pilosos (HF) de las muestras de la sección de piel de los ratones alimentados con las cepas de control o de L. reuteri. Se contaron cinco imágenes microscópicas con una resolución de 400× de 5 a 8 ratones. * indica p = 0,023 de la prueba t en comparación con el grupo de control (carriles hembra 1 y 2). c Las secciones de piel de los ratones de control (izquierda) y tratados con BM36301 (derecha) se tiñeron con hematoxilina y eosina para mostrar las capas de tejido de la piel y los HF etiquetados. Las fotos se tomaron con una resolución de 100×; la barra indica de 100 μm de longitud para la escala

Evaluamos además la salud de la piel examinando los cortes transversales de la piel bajo el microscopio después de la tinción con Hematoxilina y Eosina. Como se muestra en la Fig. 5b y c, descubrimos que los ratones hembra tratados con BM36301 mostraban mayores recuentos de folículos pilosos subcutáneos (HF) que los ratones hembra de control. Los recuentos de HF por vista microscópica a una resolución de 400× fueron de 3,50 ± 0,52 para el grupo de hembras de control, mientras que los recuentos fueron de 4,80 ± 0,61 de las hembras alimentadas con BM36301, con una diferencia significativa (p = 0,023). Sin embargo, las hembras tratadas con BM36304 sólo presentaron un ligero cambio (4,15 ± 1,73, p = 0,55 frente al control). Tras un análisis más detallado de los folículos pilosos, descubrimos que las hembras alimentadas con BM36301 mostraban fases del ciclo piloso marginalmente más activas que el control (anágena + catágena: telógena era de 81:19 del control frente a 95: 5 de las hembras alimentadas con BM36301). Mientras tanto, los recuentos de HF de los grupos masculinos no fueron muy diferentes entre sí (Fig. 5b). Finalmente, también evaluamos el grosor de la piel medido como la profundidad desde la epidermis hasta el panículo carnoso (Fig. 5c, archivo adicional 1). No pudimos encontrar mucha diferencia de la profundidad entre el control y las hembras tratadas con BM36301. Sin embargo, las capas dérmicas de los ratones alimentados con BM36301 resultaron ser marginalmente más profundas que las de los controles, y el tejido adiposo de los ratones tratados con BM36301 era más superficial que el del control. La mayoría de los HF subcutáneos se encontraban en la dermis.

En general, estas observaciones sugieren que el tratamiento con el antiinflamatorio BM36301 fomentó una piel más sana, tal y como demuestran el recrecimiento del pelo y el recuento de HF en las hembras. Sin embargo, las diferencias microscópicas de las muestras de piel entre los grupos de control y de BM36301 parecían más bien marginales. Estos beneficios para la salud de la piel no se observaron en los varones. Además, el proinflamatorio BM36304 no causó ningún efecto adverso en la piel en el momento de los experimentos.