Comparación del análisis cromosómico y el análisis de microarrays cromosómicos: ¿cuál es el valor del análisis cromosómico en la era actual de los arrays genómicos?

El análisis cromosómico y la AMC son herramientas de diagnóstico clínicamente útiles para detectar anomalías cromosómicas en todo el genoma humano. Actualmente, la AMC se recomienda como prueba de primer nivel para la discapacidad intelectual y los defectos congénitos, sustituyendo el papel anterior del análisis cromosómico. En este estudio, comparamos los resultados del análisis cromosómico y del CMA en 3.710 casos para determinar el valor de realizar el análisis cromosómico.

Detección máxima de mosaicismo mediante la conjunción del CMA y el análisis citogenético tradicional

Este estudio mostró que el 1,2% (43/3.710) de los pacientes tenían un hallazgo de mosaico. El mosaicismo se observó sólo por análisis cromosómico en el 39% de los casos debido a un porcentaje muy bajo (<10%) o muy alto (>80%) de células anormales mientras que el 12% de los casos se detectó sólo por AMC. El 49% restante de los casos se detectó tanto por AMC como por análisis cromosómico.

La detección del mosaicismo por AMC y la del análisis cromosómico difieren debido a la diferencia en la tecnología y en la población celular analizada. El AMC analiza el ADN extraído de todas las células nucleadas de la sangre periférica, incluyendo múltiples linajes celulares. En cambio, el análisis cromosómico se realiza principalmente en linfocitos T estimulados por fitohemaglutinina. Los estudios han demostrado que la AMC puede ser más sensible cuando las células anormales no responden a los mitógenos y/o las anomalías son raras o están ausentes en las células T, como en el síndrome de Pallister-Killian.5,6 Cinco casos de trisomía en mosaico, que implican a los cromosomas 8, 9, 14 y 22, fueron detectados únicamente por CMA.

Aunque CMA puede detectar fácilmente el mosaicismo a niveles del 30% o superiores, está limitado en la detección rutinaria del mosaicismo a niveles del <10%.6,13,14 Otras plataformas de arrays, como los arrays de polimorfismo de un solo nucleótido, pueden ser más capaces de detectar el mosaicismo por la información obtenida de las frecuencias de los alelos B.15,16 El análisis cromosómico puede detectar mosaicismos de bajo nivel mediante el examen individual de un gran número de células. Los estudios cromosómicos estándar de 20 células descartarán un 14% de mosaicismo con un nivel de confianza del 95%. Se pueden examinar más células cuando se identifican una o dos células anormales en metafase. Sin embargo, el análisis de muchas células individuales requiere mucho tiempo y trabajo. Si se sospecha o se confirma el mosaicismo, se puede utilizar FISH para examinar cientos de células interfásicas individuales para determinar el nivel de mosaicismo; FISH consume relativamente menos tiempo que el análisis cromosómico.

Las anomalías no detectadas por CMA, excluyendo los reordenamientos aparentemente equilibrados, representan el <0,2% del total de casos en este estudio ( Tabla 2 ). La mayoría de los casos fueron indetectables por CMA porque la proporción de células anormales estaba por debajo del límite de detección de CMA (<10%). No está claro el significado clínico del mosaicismo de muy bajo nivel en los casos 2 y 3, y del pequeño cromosoma marcador que contiene exclusivamente secuencias de repetición pericentromérica en el caso 4. El resto de las anomalías no detectadas por la AMC se asocian a anomalías fenotípicas. No está claro por qué la anormalidad observada en el 30% de las células cultivadas en el caso 5 no fue detectada por la CMA, pero presumiblemente se debe a que las células anormales están sobrerrepresentadas específicamente en las células T. La presencia de dos líneas celulares diferentes con ganancias y pérdidas genómicas que implican la misma región condujo a un equilibrio genómico neto para esa región, por lo tanto, eludiendo la detección por CMA, como se muestra en el caso 6.

La detección del mosaicismo por CMA se basa en la desviación de los cocientes logarítmicos esperados para la deleción o duplicación sin mosaicismo. La sospecha de mosaicismo debe confirmarse mediante un análisis cromosómico en células cultivadas o mediante un análisis FISH, preferentemente con frotis de sangre. En 11 casos estudiados aquí, la AMC pudo detectar la anomalía cromosómica pero no pudo detectar que el caso era mosaico debido a un bajo porcentaje de células normales o a la presencia de un cromosoma isodicéntrico que daba lugar a una tetrasomía segmentaria. Por ejemplo, en dos casos se detectó una ganancia de número de copias con todas las sondas para el cromosoma 18 por CMA ( Figura 2 ), lo que sugería una trisomía 18. En realidad, el análisis cromosómico mostró que un caso tenía trisomía 18 en todas las células ( Figura 2a ), mientras que el otro caso tenía mosaicismo para la trisomía 18 en el 80% de las células ( Figura 2b ). Además, cuando dos o más líneas celulares anormales implican la misma región, como se ejemplifica en el caso de la Figura 2c , el análisis cromosómico y/o FISH es esencial para una correcta interpretación de las anomalías cromosómicas.

La información estructural cromosómica es proporcionada por el análisis cromosómico pero no es evidente por el CMA

El CMA proporciona información muy fiable sobre la presencia de ganancias y pérdidas en el número de copias pero no proporciona información posicional o de orientación. Nuestros estudios mostraron que se observaron anormalidades estructurales en el 18% de los casos de AMC anormal. La mitad de los reordenamientos estructurales identificados en este estudio son translocaciones/inserciones desequilibradas, un tercio son otros cambios estructurales como cromosomas en anillo, cromosomas marcadores, isocromosomas y cromosomas isodicéntricos, y el 15% restante son reordenamientos complejos. Dado que la mayoría de estas aberraciones estructurales implican regiones subteloméricas, los cambios terminales en el número de copias tienen una mayor probabilidad de presentar otras anomalías estructurales.17 En general, tanto el análisis cromosómico como el de FISH son capaces de identificar translocaciones, inserciones, isocromosomas y marcadores, con diferentes puntos fuertes para cada método. Aunque el FISH puede detectar cambios demasiado pequeños para ser detectables mediante el análisis cromosómico, el análisis de los patrones de bandas cromosómicas proporciona información adicional sobre las regiones implicadas. En el caso de reordenamientos complejos, puede ser necesario combinar el FISH y el análisis cromosómico para determinar completamente los cambios estructurales complejos. Con esta excepción, el análisis FISH después de un hallazgo anormal por CMA suele ser adecuado para proporcionar información sobre la naturaleza del cambio en el número de copias.

Algunas reordenaciones cromosómicas podrían pasar desapercibidas incluso después de CMA y FISH. Por ejemplo, una deleción intersticial en 2q fue detectada por CMA en el caso 9 ( Figura 1a ). Sin el análisis cromosómico, el reordenamiento parece ser una simple deleción simple incluso después del análisis FISH confirmatorio. Sin embargo, el examen del cariotipo mostró un cromosoma 2 anormal con una inserción de un segmento de 17q23.1q23.3 en la banda 2p11.2. Además, el cromosoma 2 con el segmento 17q insertado también presenta una inversión pericéntrica entre 2p12 y 2q31.1. La deleción en 2q31.1 detectada por CMA probablemente se produjo en o cerca del punto de rotura de la inversión en el brazo largo de un cromosoma 2. En resumen, el caso 9 tenía un reordenamiento complejo que incluía una deleción en 2q detectable por CMA pero no visible por el análisis cromosómico, así como una inserción y una inversión que afectaban a los cromosomas 2 y 17, detectables por el análisis cromosómico pero no por CMA. Del mismo modo, el caso 10 presentaba reordenamientos de novo que afectaban a cuatro cromosomas, incluyendo una inserción del segmento 2q14.2q24.1 en el brazo corto de un cromosoma 6, que también presenta una inversión paracéntrica, y una translocación recíproca entre los cromosomas 12 y 18. Las pérdidas de número de copias fueron identificadas por CMA cerca de los puntos de rotura en los cromosomas 2 y 6 ( Figura 1b ). Un diagnóstico correcto requiere la combinación de AMC y análisis cromosómico.18

La identificación de reordenamientos estructurales cromosómicos es indispensable para el asesoramiento genético de la familia. Los desequilibrios genómicos detectados por CMA podrían deberse a una segregación desequilibrada producto de una translocación o inserción equilibrada en uno de los progenitores y, por lo tanto, justifica una fuerte recomendación para realizar estudios parentales. Además, la información estructural cromosómica proporciona una guía sobre qué estudios parentales deben recomendarse. Para las reordenaciones que probablemente sean producto de una reordenación equilibrada, debe realizarse FISH o análisis cromosómico parental en lugar de CMA parental.

Reordenaciones aparentemente equilibradas con un estudio CMA normal

En este estudio, se detectaron translocaciones o inversiones únicas aparentemente equilibradas sin otras anomalías cromosómicas en 30 casos (~0,8%) mediante análisis cromosómico. Se ha informado de que el ~40% de los pacientes con múltiples anomalías congénitas/retraso mental y una translocación de novo aparentemente equilibrada tienen anomalías crípticas cerca de los puntos de rotura, o no relacionadas con los puntos de rotura, que pueden ser fácilmente detectadas por CMA.19,20 Sin embargo, CMA no detectó ningún cambio en el número de copias cerca de los puntos de rotura en estos 30 casos. Varios factores pueden contribuir a esta observación. La mayoría de los reordenamientos se heredaron a partir de los estudios de los padres de un subconjunto de los casos, lo que significa que es más probable que estén «verdaderamente» equilibrados. Además, las translocaciones robertsonianas, que normalmente no dan lugar a cambios en el número de copias de la eucromatina, se incluyeron en este estudio pero se excluyeron en los estudios publicados. Además, es posible que se pasen por alto pequeñas deleciones/duplicaciones crípticas adyacentes a los puntos de rotura porque las matrices utilizadas para la mayoría de estos casos estaban dirigidas y no tenían una resolución genómica suficiente para detectar un desequilibrio.

Aunque la mayoría de los reordenamientos equilibrados son benignos, los reordenamientos de novo se asocian a un mayor riesgo de enfermedad debido a una deleción o duplicación críptica, a una alteración del gen o del potenciador, a efectos de posición o a un efecto epigenético. El riesgo de presentar una anomalía congénita grave para las translocaciones e inversiones recíprocas de novo es del 6,7%21 . Por lo tanto, es menos probable que los reordenamientos simples equilibrados detectados en este estudio sean la causa de los fenotipos de los pacientes.

Estrategia basada en la evidencia para la detección eficaz de las anomalías cromosómicas

Para determinar si se debe realizar un análisis cromosómico para el diagnóstico clínico de las anomalías cromosómicas, y cuándo, se examinaron los resultados de los casos estudiados simultáneamente mediante CMA y análisis cromosómico. Se observaron anomalías cromosómicas detectadas por el análisis cromosómico pero que no fueron detectadas por la AMC en aproximadamente el 1% de los casos, incluyendo reordenamientos aparentemente equilibrados en el 0,8% de los casos y desequilibrios asociados al mosaicismo en el 0,16% de los casos. Además, el análisis cromosómico facilitó la detección de reordenamientos estructurales cromosómicos en el 18% de los casos con resultados anormales de CMA.

Aunque CMA proporciona información sobre la variación del número de copias y el mosaicismo, sólo el análisis cromosómico o FISH proporciona la información estructural cromosómica asociada a estos cambios en el número de copias e identifica algunos casos de mosaicismo no detectados por CMA. Las ventajas del FISH sobre el análisis cromosómico es que se pueden detectar cambios pequeños (<3-10 Mb) en el número de copias y se puede analizar rápidamente un gran número de núcleos, lo que es especialmente útil para la evaluación del mosaicismo. Por lo tanto, después de un CMA anormal, el análisis FISH puede aplicarse primero para detectar reordenamientos estructurales asociados con cambios en el número de copias y confirmar el mosaicismo y determinar el porcentaje de células anormales. Cuando se detectan inserciones o translocaciones mediante FISH, puede estar indicado el análisis cromosómico para determinar los cromosomas implicados. En lugar del análisis cromosómico estándar, que estudia 20 células en metafase de dos cultivos, un análisis cromosómico a pequeña escala de cinco células de un cultivo es suficiente para este propósito. Esta estrategia detectaría todos los cambios estructurales a excepción de unos pocos reordenamientos complejos poco frecuentes.

Para los casos con un resultado normal por CMA, se puede considerar la posibilidad de realizar un análisis cromosómico completo si el paciente presenta múltiples anomalías congénitas, rasgos dismórficos y/o retraso mental que recuerden a un síndrome cromosómico o manifestaciones clínicas indicativas de un posible mosaicismo, como anomalías pigmentarias distribuidas al azar o que siguen las líneas de Blashko y asimetría de crecimiento en asociación con discapacidad intelectual. En base a este estudio, ~1% de los casos tendrían resultados cromosómicos informativos, pero <0,001 de los casos (3/3.710) tendrían un hallazgo clínicamente significativo.

En resumen, nuestro estudio confirma además que casi todas las anomalías cromosómicas detectables por análisis cromosómico son detectadas por CMA, apoyando la recomendación de que CMA sea la prueba de primer nivel. Sin embargo, el análisis citogenético tradicional sigue siendo útil para la detección de mosaicismos y la caracterización de reordenamientos estructurales.