B. Epítopos de células B
Restringimos nuestra discusión a los epítopos de células B en proteínas y péptidos; los epítopos en otros biopolímeros y grupos haptenos no están cubiertos. La primera generalización importante sobre los epítopos de células B es que se dirigen contra las características tridimensionales de la superficie molecular de las proteínas y los polipéptidos. Una topología tridimensional particular es un rasgo distintivo de los epítopos de células B, a diferencia de los epítopos de células T. Es probable que cualquier residuo de aminoácido accesible desde la superficie de una proteína pueda formar parte de uno u otro epítopo de células B (Benjamin et al., 1984). Por lo tanto, las proteínas pueden contener muchos epítopos diferentes aunque, por razones estéricas, sólo un número limitado de anticuerpos puede unirse al antígeno en un momento dado. La respuesta de las células B es estereoespecífica, siendo mucho más débil frente a los enantiómeros d de los péptidos (Gill et al., 1963) y las proteínas (Dintzis et al., 1993), posiblemente porque las proteínas d-enantioméricas no se procesan eficazmente para producir péptidos para la ayuda de las células T.
Antes se creía que las proteínas tenían una estructura antigénica bien definida caracterizada por un número limitado de epítopos. El conocimiento de la compleja naturaleza de la respuesta inmunitaria de las células B y su regulación, así como de la especificidad de los anticuerpos monoclonales contra las proteínas, dejó claro que una proteína no posee una estructura antigénica definida. No es posible definir la «estructura antigénica completa» de una proteína, en contra de lo que han afirmado algunos investigadores (Atassi y Lee, 1978; Atassi, 1984). La antigenicidad de una proteína es tanto una propiedad de la topografía de la proteína como de los mecanismos reguladores del sistema inmunitario del huésped, incluyendo la tolerancia a las estructuras que se parecen a las propias proteínas del huésped, la especificidad de la ayuda de las células T y las redes idiotípicas (Benjamin et al., 1984; Berzofsky, 1985). Los sitios inmunodominantes, es decir, los sitios a los que se dirigen la mayoría de los anticuerpos de la respuesta inmunitaria, pero no todos, no son una propiedad intrínseca per se de la proteína. Como ya han señalado otros, los epítopos no existen por derecho propio, sino sólo en virtud de una conexión con el sitio de unión del anticuerpo complementario, el llamado paratopo (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Por lo tanto, un epítopo es un concepto relacional, y la definición de un epítopo es necesariamente operativa (Van Regenmortel, 1986). En otras palabras, la definición de un epítopo concreto depende en gran medida de la geometría molecular y de la naturaleza química del parátopo correspondiente y, lo que es quizá más importante, del enfoque experimental elegido para cartografiar el epítopo.
Este estado de cosas puede ilustrarse con el ejemplo del primer complejo proteína-anticuerpo cuya estructura se resolvió mediante cristalografía de rayos X (Amit et al., 1986). En este complejo, 16 residuos de lisozima entran en contacto con 17 residuos de un Fab (fragmento de anticuerpo) monoclonal de lisozima. El epítopo se extiende a lo largo de 750 Å2 de la superficie de la lisozima. En cambio, el mapeo del epítopo con una serie de lisozimas aviares relacionadas con la secuencia indica que sólo unos pocos residuos son importantes para la unión de la lisozima a los anticuerpos monoclonales antilisozima. La mutación de muy pocos residuos puede reducir radicalmente la constante de asociación del complejo lisozima-anticuerpo (Harper et al., 1987). En un caso, una única sustitución de Arg por Lys redujo en dos órdenes de magnitud la afinidad de la lisozima por un anticuerpo monoclonal (Smith-Gill et al., 1982). Los cálculos teóricos basados en las estructuras cristalinas de dos complejos de lisozima con fragmentos Fab demostraron que, de los muchos residuos que definen el epítopo en el cristal, sólo unos pocos contribuyen realmente a la estabilidad del complejo (Novotny et al., 1989). Basándose en sus cálculos, Novotny et al. distinguieron entre un epítopo energético y un epítopo pasivo. El epítopo energético abarca los residuos que contribuyen a la energía de la unión. El epítopo pasivo sólo proporciona complementariedad de superficie alrededor de los residuos que forman el epítopo energético. El hecho de que sólo algunas de las interacciones observadas en la estructura cristalina desempeñen un papel importante en la estabilización del complejo antígeno-anticuerpo se confirmó en el caso de la unión de la neuraminidasa del virus de la gripe a un anticuerpo monoclonal. Diecinueve residuos de la neuraminidasa entran en contacto con 17 residuos del anticuerpo en el cristal, pero la mutación específica del sitio de sólo 3 residuos suprime totalmente la unión (Air et al., 1990; Nuss et al., 1993).
Una distinción operativa más aplicable de los epítopos es la que existe entre un epítopo de contacto y un epítopo funcional. El epítopo de contacto se relaciona con la información obtenida de la estructura tridimensional del complejo antígeno-anticuerpo; el epítopo funcional se relaciona con la información de los procedimientos de mapeo no cristalográficos, incluyendo el mapeo de epítopos con péptidos. Un epítopo de contacto está representado por un ajuste entre grandes áreas superficiales complementarias de antígeno y anticuerpo, como se observa en varias estructuras de rayos X de complejos proteína-anticuerpo (Davies y Padlan, 1990; Wilson y Stanfield, 1994; Braden y Poljak, 1995). Los epítopos de contacto cubren varios cientos de angstroms cuadrados de superficie molecular. El epítopo funcional define los residuos que parecen significativos para la unión del anticuerpo y cuya mutación puede reducir o abolir totalmente la unión. El epítopo funcional puede comprender tan sólo 2 ó 3 residuos, como en los ejemplos de la lisozima y la neuraminidasa mencionados anteriormente. No es posible deducir el epítopo de contacto del epítopo funcional. Del mismo modo, el epítopo de contacto no revela por sí mismo el epítopo funcional. Por parte del anticuerpo, también se pueden diferenciar dos tipos de paratopos: un paratopo funcional y un paratopo de contacto. Esto se desprende del análisis termodinámico de las regiones que determinan la complementariedad de un anticuerpo monoclonal (Kelley y O’Connell, 1993).
La naturaleza dual de un epítopo revelada por las técnicas de mapeo cristalográficas y no cristalográficas refleja dos modelos diferentes de reconocimiento molecular. Visto así, la dificultad para definir la naturaleza de los epítopos se traslada al nivel de una dificultad epistemológica: ¿cómo vamos a modelar la realidad con los restringidos medios experimentales de que disponemos? Estos límites se tendrán en cuenta cuando se hable del mapeo de epítopos mediante péptidos.
Aquí debemos mencionar la conocida clasificación conceptual de los epítopos de células B en secuenciales y conformacionales (Sela et al., 1967; Sela, 1969; Atassi y Smith, 1978). Un epítopo se denomina secuencial o continuo si puede ser representado por una serie de residuos contiguos de una cadena polipeptídica. Se dice que un anticuerpo reconoce un epítopo secuencial si reacciona con un péptido corto y flexible o con la cadena polipeptídica desnaturalizada y desplegada. Un epítopo conformacional, también llamado discontinuo o topográfico o ensamblado, se construye a partir de partes no contiguas de la secuencia de aminoácidos mediante el plegado de la cadena polipeptídica en la proteína nativa. Se dice que un anticuerpo reconoce un epítopo conformacional si reacciona con una proteína nativa y no con la cadena polipeptídica desplegada, o si reacciona con un péptido de conformación única, por ejemplo, una hélice, pero no con un péptido de bobina aleatoria.
La distinción entre epítopos secuenciales y conformacionales es algo arbitraria y puede ser engañosa. Dado que cada paratopo tiene una estructura tridimensional bien definida, la interacción entre el paratopo y el epítopo es siempre un ajuste de estructuras en el espacio tridimensional. Esto se aplica tanto a un epítopo en una proteína globular bien ordenada como a un epítopo en un péptido corto y flexible. En este último caso, el péptido también debe adoptar una conformación única al unirse al anticuerpo; por tanto, un epítopo continuo también es «conformacional». La conformación de unión preexiste o es inducida por el paratopo (véanse las secciones V,B y V,C).
En el caso de los anticuerpos contra proteínas nativas, se ha argumentado que la mayoría o quizás todos los epítopos son discontinuos (Barlow et al., 1986). Debido al gran tamaño de un epítopo de contacto típico en un cristal de antígeno-anticuerpo, es de hecho improbable que un anticuerpo se una exclusivamente a un tramo contiguo de la cadena polipeptídica y no también a residuos de contacto separados en la secuencia pero cercanos en el espacio. Los modelos de llenado de espacio de las proteínas muestran pocos tramos lineales de más de 4 o 5 residuos en enlace peptídico directo accesibles en la superficie de la molécula. Esto no quiere decir que un anticuerpo dirigido contra un epítopo ensamblado en la superficie de una proteína no pueda dar una reacción cruzada también con un péptido correspondiente a un segmento de la proteína.
Concluyendo nuestra visión general de la naturaleza de los epítopos de las células B, destacamos una vez más la enorme dificultad de dar una definición general de «epítopo». Un recurso pragmático a las definiciones operativas puede no gustar a los puristas, pero las definiciones operativas pueden ser útiles para responder a preguntas sobre el carácter de una determinada interacción antígeno-anticuerpo.