Los sistemas inducibles por tetraciclina se han utilizado ampliamente en levadura para estudiar el control de la transcripción de genes en células individuales15,16,17,18,19,20,21,22. Para utilizar rtTA en este contexto, creamos dos promotores fuertes que responden a la doxiciclina con tres (PTET3) o cuatro (PTET4) sitios de unión a rtTA y utilizamos la variante optimizada rtTA-M27 para controlar la expresión de la proteína verde fluorescente potenciada por la levadura (yeGFP)23 a partir de estos promotores (Fig. 1a). El casete de expresión rtTA/PTET-yeGFP se integró en una sola copia en el genoma de la levadura. La variante M2 es idéntica a la variante encontrada en los sistemas de expresión Tet-ON Advanced de ClonTech.
(a) Esquema del montaje experimental donde rtTA-M2 se expresa a partir de los promotores constitutivos PMYO2 o PTDH3 y yeGFP se expresa a partir de un promotor sensible a tet. (b) Activación dependiente de la dosis de doxiciclina de rtTA-M2 expresada a partir de PMYO2 o PTDH3 (media +/- s.e.m. de tres réplicas técnicas). AutoFL son células de levadura BY4742 de tipo salvaje. (c) Distribuciones de la fluorescencia de una sola célula obtenida a partir de células que llevan el sistema PMYO2-rtTA a diferentes concentraciones de doxiciclina. Los tonos de gris progresivamente más oscuros corresponden a 0,25, 1, 5 y 100 μg/mL de doxiciclina respectivamente. AutoFL son células de levadura BY4742 de tipo salvaje (d) Imágenes de campo brillante-fluorescencia fusionadas de células de levadura BY4742 de tipo salvaje o de células no inducidas que llevan el sistema PMYO2-rtTA.
El problema de la transcripción de genes diana con fugas es especialmente profundo cuando rtTA se expresa a niveles altos. Esto se ilustra en la Fig. 1b, que muestra las curvas de respuesta a la dosis de doxiciclina de PTET3 cuando rtTA-M2 se expresa desde el promotor fuerte de PTDH3. La fluorescencia fue muy alta cuando las células fueron expuestas a cantidades saturantes de doxiciclina. No obstante, debido a la transcripción permeable del promotor de PTET3, el rango dinámico del sistema fue bastante pobre, con una expresión máxima ~17 veces mayor en la inducción completa en comparación con la ausencia de doxiciclina.
Consistente con un modelo en el que el transactivador tiene un potencial de activación significativo en su estado no inducido, la expresión de rtTA-M2 desde el promotor débil de PMYO2 redujo sustancialmente la fluorescencia en ausencia de doxiciclina. Aunque no se observó una saturación completa con este sistema, la reducción de la expresión con fugas dio lugar a una mejora drástica del rango dinámico y la inducción con doxiciclina dio lugar a un aumento de la fluorescencia de ~200 veces. Sin embargo, a pesar de esta mejora, tanto los datos de citometría de flujo (Fig. 1c) como los de microscopía de fluorescencia (Fig. 1d) indicaron que el rtTA-M2 no inducido provoca una expresión significativa del gen reportero incluso cuando el transactivador se expresa desde un promotor débil.
Durante el ensayo inicial de doce clones portadores del sistema PTDH3-rtTA-M2, descubrimos por casualidad que uno de ellos emitía una fluorescencia inesperadamente baja en ausencia de doxiciclina, pero una fluorescencia casi normal a plena inducción (Fig. 2a). La secuenciación posterior identificó una mutación de un solo nucleótido, de guanina a timina, que cambia una glicina (GGG) por una valina (GTG) en el residuo 72 dentro de la proteína transactivadora. El análisis de Western blot indicó que esta sustitución no afecta a la abundancia de la proteína (Fig. 2a, Inserción, véase la Fig. Suplementaria S1 para más detalles) y la reconstrucción del sistema de expresión confirmó que la única mutación de guanina a timina es responsable de los cambios observados en la respuesta a la dosis de doxiciclina (datos no mostrados).
(a) Activación dependiente de la dosis de doxiciclina de las variantes de rtTA-M2 expresadas a partir de PTDH3 (media +/- s.e.m de tres réplicas técnicas). El autoFL es de células de levadura BY4742 de tipo salvaje. En el recuadro, un western blot (recortado) comparando la abundancia de proteínas de rtTA-M2 y del mutante G72V. Todas las muestras fueron preparadas y ejecutadas bajo idénticas condiciones experimentales. (b) Distribuciones de fluorescencia unicelular obtenidas de células portadoras del sistema PTDH3-rtTA(G72V) a diferentes concentraciones de doxiciclina. AutoFL son células de levadura BY4742 de tipo salvaje. Los tonos de gris progresivamente más oscuros corresponden a 1, 2,5, 5 y 100 μg/mL de doxiciclina respectivamente. (c) Imágenes fusionadas de campo claro y fluorescencia de células no inducidas que llevan los sistemas PTDH3-rtTA-M2 o PTDH3-rtTA(G72V). (d) Representación en dibujos animados del dímero de TetR en el que cada protómero está coloreado de forma diferente (amarillo y turquesa). La estructura secundaria está etiquetada y G72 se muestra como una esfera.
El sistema PTDH3-rtTA-M2(G72V) tiene un rango dinámico notable y mostró un aumento de ~500 veces en la intensidad de fluorescencia cuando las células fueron inducidas con doxiciclina alta en comparación con la no inducción (Fig. 2b). Además, la emisión de fluorescencia detectada por citometría de flujo es indistinguible de la autofluorescencia celular en ausencia de doxiciclina y la variante conserva la respuesta de inducción graduada del transactivador original. Además, la expresión del reportero de la cepa rtTA-M2(G72V) no inducida fue indetectable por microscopía de fluorescencia incluso en los ajustes del instrumento en los que la cepa rtTA-M2 no inducida dio una fuerte señal de saturación (Fig. 2c).
Para obtener información sobre cómo la única mutación puede tener un impacto tan drástico en el rango dinámico de rtTA-M2(G72V), investigamos dónde se encontraba el residuo en el contexto de la estructura tridimensional de la proteína. La estructura de la rtTA-M2 o de otras variantes de la rtTA no ha sido resuelta. Sin embargo, al conservarse 203 de los 207 aminoácidos del dominio TetR de rtTA7, la estructura de alta resolución de TetR24 permite conocer la estructura del dominio de unión al ADN de rtTA. En la estructura de TetR, el residuo de glicina 72 se encuentra en un bucle flexible situado entre las hélices α4 y α5, una región que une el dominio de unión al ADN represor (α1-α3) y su región de unión a la tetraciclina (α5-α9)24,25 (Fig. 2d). Esto sugiere que la sustitución, que introduce una cadena lateral no polar, desencadena cambios conformacionales de largo alcance que en última instancia afectan a la actividad del transactivador, presumiblemente mediante la rigidización de su estructura terciaria.
Para examinar esta hipótesis, creamos dos variantes adicionales en las que el residuo de glicina fue mutado en alanina o prolina. Estas mutaciones conservan la naturaleza no polar del residuo de valina pero introducen cadenas laterales de distinto tamaño. Previmos que la cadena lateral de metilo única de la alanina sería menos eficaz para evitar la actividad no inducida que la gran cadena lateral cíclica de la prolina. También creamos un sistema de expresión inducible por β-estradiol26 para obtener un control directo de la expresión de rtTA-M2 y utilizamos el promotor con un sitio extra de unión a TetR, PTET4, para mejorar la capacidad de rtTA de unirse al ADN. El sistema de expresión se ilustra esquemáticamente en la (Fig. 3a). Confirmamos mediante análisis de western blot que las cuatro variantes de rtTA se expresan a niveles similares en plena inducción de β-estradiol (Fig. 3b, véase la Fig. Suplementaria S2 para más detalles) y que la fluorescencia de una cepa que carece de rtTA tiene una expresión reportera que es indistinguible de una cepa de levadura BY4742 de tipo salvaje, lo que demuestra que no hay expresión reportera de fondo de PTET4 (Fig. Suplementaria S3). S3).
(a) Esquema de la red génica donde las variantes de rtTA-M2 se expresan a partir de un promotor inducible por β-estradiol y yeGFP se expresa a partir de un promotor sensible a tet. (b) Western blot (recortado) comparando la abundancia de proteínas de las cuatro variantes rtTA cuando son inducidas por 1000 nM de β-estradiol o sin inducción. Todas las muestras fueron preparadas y ejecutadas bajo idénticas condiciones experimentales. (c) Imágenes fusionadas de campo brillante-fluorescencia de las cuatro variantes de rtTA inducidas por 1000 nM de β-estradiol sin inducción de doxiciclina. (d) La actividad basal de las variantes de rtTA en función de su nivel de expresión dependiente de β-estradiol (media +/- s.e.m de tres réplicas técnicas). En el recuadro, histogramas de la expresión del reportero para las diferentes variantes de rtTA. (e) Activación dependiente de la dosis de doxiciclina de las variantes de rtTA-M2 expresadas de forma ubicua en 1000 nM de β-estradiol (media +/- s.e.m de tres réplicas técnicas).
Como se esperaba, la variante de alanina mostró una mayor expresión de fuga que la variante de valina y la variante de prolina tenía una fluorescencia que era indistinguible de la autofluorescencia celular medida por citometría de flujo. Esto es evidente a partir de las imágenes de microscopía de fluorescencia obtenidas con los ajustes de los instrumentos en los que la cepa que alberga la variante M2 original da una fuerte señal de fluorescencia en la inducción completa de β-estradiol (Fig. 3c) y de las mediciones de fluorescencia por citometría de flujo en la inducción variable de β-estradiol (Fig. 3d).
Notablemente, las sustituciones de aminoácidos que reducen significativamente la expresión del gen reportero basal tienen un efecto mínimo en la activación transcripcional de rtTA en la inducción completa de β-estradiol y doxiciclina. Esto se ilustra en la Fig. 3E, que muestra las curvas dosis-respuesta para las cuatro variantes de G72-M2 medidas cuando se varía la doxiciclina a plena inducción de β-estradiol. Sin embargo, las sustituciones de aminoácidos impactan en la sensibilidad a la doxiciclina. En nuestros experimentos (Fig. 3e), la variante M2 tuvo la mayor sensibilidad con una concentración media máxima efectiva (EC50) de ~0,06 μg/mL mientras que la variante de alanina (EC50 de ~0,2 μg/mL), la variante de valina (EC50 de ~1,0 μg/mL) y la variante de prolina (EC50 de ~1.5 μg/mL) requerían concentraciones de doxiciclina progresivamente más altas para alcanzar la capacidad de expresión máxima.
Para contrarrestar el efecto de la mutación G72 en la sensibilidad a la doxiciclina, introdujimos mutaciones adicionales en el dominio TetR que habían demostrado recientemente que aumentaban la sensibilidad a la doxiciclina10,11,27. Examinamos específicamente el efecto de introducir las mutaciones de mejora de la sensibilidad (SE) V9I, F67S, F86Y y R171K.
La Figura 4A,B demuestra que las mutaciones SE mejoran la sensibilidad a la doxiciclina de las variantes rtTA M2 SE-G72P y SE-G72A. Cuando las variantes rtTA se expresan a altos niveles desde el promotor inducible por β-estradiol totalmente activado (Fig. 3a), la introducción de las mutaciones SE reduce la EC50 de la doxiciclina de ~1,5 μg/mL a ~0,1 μg/mL para la variante G72P (Fig. 4a) y de ~0,2 μg/mL a ~0,02 μg/mL para la variante G72A (Fig. 4b). Este efecto se produjo sin un cambio apreciable en la expresión del reportero bajo la inducción completa de doxiciclina y no comprometió el rango dinámico de la variante SE-G72P. Sin embargo, es interesante que las mutaciones SE causaron una pérdida significativa de rango dinámico para la variante SE-G72A al aumentar la expresión del gen reportero en ausencia de doxiciclina.
(a,b) Activación dependiente de la dosis de doxiciclina de las variantes rtTA expresadas de forma ubicua en 1000 nM de β-estradiol (media +/- s.e.m de tres réplicas técnicas). (c-f) Mapas de calor que muestran la expresión del reportero (unidades arbitrarias) en función de la expresión del transactivador dependiente de β-estradiol y la inducción de doxiciclina.
Para explorar más a fondo la relación entre el nivel de expresión del rtTA, la EC50 de la doxiciclina y la actividad basal, examinamos el efecto sobre la expresión del gen reportero de variar simultáneamente la inducción de β-estradiol y doxiciclina. Investigamos cuatro variantes diferentes de M2; la variante original, la variante original con las mutaciones SE, la variante G72P y la variante SE-G72P.
La superficie bidimensional dosis-respuesta para la variante original de M2 contiene tres regiones distintas de expresión del gen informador que corresponden a una expresión baja, intermedia y alta del gen informador. Estas regiones están etiquetadas como I, II y III en la Fig. 4c-f. La región III es donde la expresión del reportero es máxima, lo que depende tanto del nivel de expresión de rtTA como del nivel de inducción de doxiciclina. La región II es donde la expresión del reportero es relativamente alta incluso cuando la inducción de la doxiciclina es baja. La región I es donde la expresión del reportero es baja debido al bajo β-estradiol o a la baja inducción de doxiciclina.
Las mutaciones SE por sí solas (Fig. 4d) aumentan drásticamente la expresión del reportero en parte de la región I y en toda la región II. Esto confirma que estas mutaciones pueden aumentar la sensibilidad en un estrecho rango de niveles de expresión de rtTA, pero también causan un aumento significativo de la actividad de rtTA en el estado no inducido. Por el contrario, la mutación G72P sola (Fig. 4e) reduce drásticamente la expresión del reportero en toda la región II y en parte de la región III. Esto confirma que el profundo efecto de esta mutación sobre la actividad de rtTA en el estado no inducido se asocia con una pérdida general de sensibilidad a la doxiciclina.
La figura 4f muestra el efecto de la combinación de las mutaciones SE y G72P. En comparación con la variante SE (Fig. 4d), la adición de la mutación G72P contrarresta el aumento de la expresión del reportero causado por las mutaciones SE en la región I y reduce la expresión del reportero a niveles indetectables en esta región. Además, en comparación con la variante G72P (Fig. 4e), la adición de las mutaciones SE restablece casi por completo la pérdida de expresión del reportero en la región III. En otras palabras, se mejora la sensibilidad sin introducir la expresión del gen diana con fugas en cualquier nivel de expresión del transactivador.