La clonación basada en la topoisomerasa (clonación TOPO) es un método de clonación de ADN que no utiliza enzimas de restricción ni ligasa, y no requiere procedimientos posteriores a la PCR. Suena fácil, ¿verdad? La técnica se basa en la capacidad básica de los pares de bases complementarios adenina (A) y timina (T) para hibridarse y formar enlaces de hidrógeno. Este artículo se centra en la clonación TOPO «sticky end» (también llamada TOPO-TA); sin embargo, la técnica de clonación TOPO también se ha adaptado para la clonación «blunt end».
¿Cómo funciona la clonación TOPO?
Como se ilustra en la figura siguiente, el saliente «A» en el inserto del producto de PCR azul proviene del uso de la Taq polimerasa para el paso de amplificación, ya que la Taq polimerasa deja una sola desoxiadenosina (A) en los extremos 3′ de los productos de PCR. La «T» complementaria en el par proviene de una columna vertebral linealizada por la topoisomerasa I. La topoisomerasa I del ADN (representada como una nube verde) funciona como endonucleasa de restricción y como ligasa al escindir y volver a unir los extremos del ADN superenrollado para facilitar la replicación.
La técnica TOPO utiliza específicamente la topoisomerasa I aislada del virus Vaccinia, ya que esta enzima reconoce la secuencia de ADN 5′-(C/T)CCTT-3′ y digiere el ADN de doble cadena en esta secuencia. La energía de esta rotura se almacena como un enlace covalente entre la hebra 3′ del ADN escindida y un residuo de tirosilo de la topoisomerasa I (1). Si aparece un grupo hidroxilo 5′ de una hebra de ADN diferente, puede atacar este enlace covalente uniendo así las dos hebras de ADN y liberando la topoisomerasa (2).
En la actualidad, los kits TOPO disponibles en el mercado proporcionan vectores o brazos de clonación con residuos de desoximidina (T) que sobresalen y que están unidos covalentemente a la topoisomerasa. Los vectores de estos kits también suelen tener el sitio de la topoisomerasa insertado en un casete de beta-galactosidasa, lo que permite al investigador realizar un cribado azul-blanco después de la transformación: la autounión de los extremos del vector da lugar a la producción de colonias azules que no necesitan ser recogidas y secuenciadas para detectar posibles clones positivos. Una vez que introduzca su inserto en el extremo 3’A del voladizo, se produce la magia de la clonación TOPO.
Procedimiento básico
Vamos a desglosar los pasos necesarios para la clonación TOPO:
1. Crea tu producto de PCR: Diseñe cebadores estándar (no es necesario añadir sitios de restricción únicos en los extremos) y amplifique su secuencia de interés con la polimerasa Taq utilizando su protocolo de PCR favorito.
2. Prepare la reacción de clonación TOPO: Mezcle el producto de la PCR y el vector TOPO.
3. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente: Puede colocar su reacción en hielo si está planeando transformar inmediatamente O puede almacenar la reacción a -20C durante la noche.
4. Transformar la reacción de clonación TOPO en células competentes: Puede utilizar su protocolo de laboratorio estándar para esto; sin embargo, debe reducir su tiempo de incubación en hielo a 5 minutos (incubar los 30 minutos completos no mejorará significativamente la eficiencia de la transformación).
5. Seleccione y analice 10 colonias blancas o celestes: Puede confirmar la presencia de su inserto mediante PCR, digestión de restricción o secuenciación.
Consejos profesionales
- No añada fosfatos 5′ a sus cebadores de PCR; ¡necesita ese grupo hidroxilo libre!
- Es posible que desee incluir un tiempo de extensión adicional después del último ciclo de la PCR para asegurarse de que la «A» se añade a todos los productos de la PCR.
- Tenga en cuenta que la Taq polimerasa tiene una tasa de error de aproximadamente 1 en 3.500 bases. Normalmente se utilizan polimerasas con funcionalidad de corrección de pruebas en lugar de Taq para reducir las tasas de error; sin embargo, las polimerasas de corrección de pruebas también eliminarán todos los extremos 3′ no apareados en su producto de PCR. Si necesita reducir la tasa de error, utilice uno de estos métodos para asegurarse de que su inserto conserva el saliente 3′ A:
- Utilice una mezcla de enzima correctora y Taq, con Taq utilizada en una proporción de exceso de 10:1.
- Purifique en gel su producto de PCR e incúbelo con tampón, Taq y dATPs a 72C durante 10-15min.
- Al mezclar el producto de la PCR con el vector TOPO, es posible que desee añadir sal adicional a su reacción:
La topoisomerasa I se libera del vector cuando el producto de la PCR y el vector se ligan; sin embargo, puede potencialmente volver a unirse y mellar el ADN recién ligado. La sal ayuda a evitar que la topoisomerasa I se vuelva a unir, lo que resulta en más moléculas intactas. (Tenga en cuenta que la cantidad de sal que añada dependerá de si está planeando transformar su reacción en E. coli químicamente o electrocompetente – el exceso de sal provoca la formación de arcos durante la electroporación, lo que haría que la electroporación fallara).
- Cuando se incuba a temperatura ambiente, no se recomienda superar el límite de tiempo de 5 minutos (se han notificado eficiencias de transformación más bajas con una incubación más larga); sin embargo, es posible que necesite incubar durante 20-30 minutos si su producto de PCR está a una baja concentración o si está clonando un inserto extremadamente grande.
- Dado que la reacción de ligación estándar es bastante rápida, asegúrese de mantenerse organizado y de preparar todo lo que necesita para el siguiente paso antes de proceder.
- Precalentar su placa con antibióticos antes de chapar su transformación puede permitirle ver colonias en 8 horas.
- Realice mutagénesis dirigida al sitio por PCR
- Use la mutatogénesis REPLACR para generar fácilmente inserciones y deleciones en un plásmido
- Aprenda a verificar su plásmido
1. Shuman S. «La recombinación mediada por la topoisomerasa I del ADN del virus vaccinia en Escherichia coli es específica de la secuencia». Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796. PubMed Central PMCID: PMC52876.
2. Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
Recursos adicionales en el blog de Addgene
.