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De nombreuses approches alternatives au clonage PCR (1) ont été développées, notamment le clonage TA (2), le clonage indépendant de la ligature (LIC) (3-4), le clonage dépendant de la recombinase (5-7) et le clonage médié par la PCR (8-10). L’utilité pratique de toute méthode de clonage repose sur sa fiabilité, plutôt que sur sa commodité, son prix ou son efficacité dans des conditions optimales. Les méthodes les plus faciles à contrôler et à optimiser s’avèrent finalement les plus fiables. Le clonage TA et le LIC nécessitent des modifications finales qui ne peuvent pas être contrôlées par électrophorèse sur gel. Les recombinases sont généralement vendues comme des composants propriétaires des kits de clonage, si bien que peu de consommateurs optimisent les réactions de recombinaison in vitro. Le clonage par PCR à extension par chevauchement, décrit ici, n’est pas la première forme de clonage médié par la PCR (8-10). Il est cependant relativement simple, efficace et fiable.

La première de deux PCR (figure 1A) crée un insert linéaire avec des séquences plasmidiques aux deux extrémités (voir les matériaux supplémentaires pour les méthodes et les instructions pour la conception des amorces). Ces extensions permettent ensuite aux brins du produit de la PCR (Figure 1A) d’agir comme une paire d’amorces surdimensionnées sur le fragment de vecteur (Figure 1B). Après dénaturation et recuit, les brins de l’insert s’hybrident au vecteur et s’étendent pour former un nouveau plasmide à double brin. L’ADN polymérase de Phusion (Cat. no. F-530 ; New England BioLabs, Ipswich, MA, USA), cruciale pour la réalisation de la technique, ne possède pas d’activité de déplacement de brin. Par conséquent, le produit final de la réaction est un plasmide de fusion double brin avec deux entailles (une sur chaque brin). Ce plasmide double brin détendu est ensuite transformé dans des cellules Escherichia coli compétentes, qui scellent les entailles avec des enzymes de réparation de l’ADN (figure 1C). Nous employons la même polymérase thermostable pour les deux PCR, de sorte que les utilisateurs inexpérimentés peuvent cloner efficacement sans maîtriser les idiosyncrasies de multiples enzymes de restriction, polymérases, glycosylases, recombinases et ligases.

Nous avons d’abord utilisé la gfp pour des expériences de preuve de principe. Le gène gfp a été amplifié par PCR (Figure 1A) avec les amorces chimériques (extrémités 5′ complémentaires du plasmide pQE30 ; extrémité 3′ complémentaire de la gfp). La PCR d’extension par chevauchement (Figure 1B) a été réalisée avec cinq ADN polymérases différentes (Tableau supplémentaire S1). Des concentrations élevées de l’insert et des températures de recuit relativement basses dans la réaction (5-10°C en dessous de la température de fusion calculée du complexe amorce/plasmide) sont importantes pour une extension par chevauchement efficace. Certains des produits PCR correspondent à la forme relâchée du vecteur souhaitable, comme le révèle l’analyse du gel d’agarose (Figure 2A). Le vecteur pQE30 original a été détruit dans les réactions avec l’endonucléase de restriction DpnI (Figure 1C). Une petite aliquote de chaque réaction a été utilisée pour transformer les cellules E. coli.

L’ADN polymérase Phusion était mieux adaptée au clonage par PCR à extension par chevauchement que les concurrents que nous avons testés (tableau supplémentaire S1), peut-être en raison de sa processivité et de sa fidélité supérieures (11-12). L’ADN polymérase Phusion est 10 fois plus processive que la polymérase Pfu native (Cat. no. 600135 ; Stratagene, La Jolla, CA, USA), et a produit 46 fois plus de colonies (Supplementary Table S1). Elle a également produit 35× plus de colonies que le mélange d’ADN polymérase Expand Long Template (Cat. no. 11681834001 ; Roche, Basel, Switzerland), qui est principalement de l’ADN polymérase Taq. Zuo et Rabie ont développé une méthode similaire avec l’ADN polymérase Taq seule, et ont rapporté des efficacités de clonage tout aussi modestes (8). L’ADN polymérase Taq est relativement processive (60% de celle de Phusion), mais la fidélité globale du mélange n’est que de 3,8% de celle de Phusion. Plus de 98 % des colonies transformées avec l’ADN produit par l’ADN polymérase Phusion étaient visiblement vertes, ce qui indique une erreur de clonage minimale ou un report du vecteur d’origine.

Nous avons mesuré l’efficacité du clonage par PCR à extension par chevauchement en fonction des cycles de température ; le nombre de clones recombinants a augmenté de façon géométrique au cours des 15 premiers cycles et a atteint un pic à 17-18 cycles (figure 2B). Des cycles supplémentaires ont entraîné une légère diminution (~30%) de la quantité de clones produits, associée à l’accumulation des produits d’ADN de poids moléculaire élevé observés dans les gels d’agarose (Figure 2A). Le rapport insert/plasmide peut également avoir un effet prononcé sur le résultat de la réaction. Nous avons comparé trois rapports vecteur/insertion différents (1:5 ; 1:50 et 1:250) dans une réaction de clonage par extension PCR avec Phusion DNA polymerase. Les trois rapports ont entraîné l’apparition de la forme entaillée du plasmide (comme en témoigne l’électrophorèse sur gel d’agarose, non montrée) et de clones recombinants (comme en témoignent la transformation et la croissance de colonies vertes). Le rapport 1:250 a produit le plus grand nombre de clones recombinants.

Nous avons ensuite appliqué le clonage par PCR à extension par recouvrement pour cloner les gènes de la GFP (gfp, 1 kb), de la β-D-glucuronidase (gusA, 1,9 kb) et de la β-galactosidase (lacZ, 3,2 kb), ainsi que l’ensemble de l’opéron luxABCDE (6 kb). La structure correcte de tous les vecteurs recombinants a été confirmée par l’analyse de restriction et la fonction de la protéine rapporteur. Le taux d’erreur apparent associé à notre méthode, jugé par la fraction de colonies ne présentant pas une activité de rapporteur complète, était <3% quelle que soit la taille de l’insert (données non présentées). Parallèlement, le nombre de colonies que nous avons observées sur les plaques après transformation a considérablement diminué avec l’augmentation de la longueur de l’insert (figure 2C). Le graphique est presque linéaire, ce qui suggère que 6,7 kb est la limite supérieure pour les inserts avec cette technique.

Le résultat de tout projet de clonage dépend largement de l’effort et de l’attention aux détails du travailleur. La réaction de clonage PCR à extension par chevauchement décrite ici est aussi facile à surveiller et à optimiser que tout autre protocole PCR long (13). En général, les rendements de la PCR sont faibles lorsque les conditions de réaction sont trop strictes (les amorces ne s’hybrident pas) ou trop souples (amorçage non spécifique). Ces deux phénomènes se manifestent par des voies vides dans les gels d’agarose, bien que le dernier cas puisse également entraîner des macules ou des bandes indésirables (voir les matériaux supplémentaires pour plus de détails sur la conception des amorces et l’optimisation de la réaction PCR). La rigueur de la PCR peut être contrôlée en modifiant les concentrations des réactifs (amorces, matrice), la température d’hybridation, les ingrédients du tampon (magnésium, pH, DMSO) ou le nombre de cycles de température. Globalement, cette approche de clonage s’est avérée insensible à la présence des éléments répétés internes (voir les matériaux supplémentaires pour plus de détails). L’ADN polymérase de Phusion peut être utilisée pour catalyser à la fois l’amplification PCR de l’insert et les réactions d’extension par chevauchement, de sorte que les praticiens n’auront qu’à se familiariser avec les idiosyncrasies d’une seule enzyme.