- Abstract
- 1. Bevezetés
- 2. Anyag és módszerek
- 2.1. Az elit genotípusok azonosítására szolgáló tesztelési rendszer kifejlesztése Növényi anyag
- 2.2. DNS-kivonás. DNS-kivonás
- 2.3. A DNS-kivonás az őshonos fákból történt. Mikroszatellit-elemzés
- 2.4. A molekulatömeg-markereket a HpaII endonukleázzal módosítottuk. Statisztikai elemzés
- 3. Eredmények és megbeszélés
- 3.1. Eredmények és megbeszélések 3.1. SSR-alapú vizsgálati rendszerek kifejlesztése a nyárfa genotípus-azonosítására
- 3.2. A kariológiai és lebegő citometriás vizsgálatokat a nyárfa hibridek esetében is folytatni kell. A klonális struktúra elemzése az őshonos nyárfa-állományokban
- 3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
- 4. Következtetés
- Érdekütközés
- Megköszönések
- Kiegészítő anyagok
Abstract
Mikroszatellita (SSR) lókuszok alapján vizsgálati rendszereket fejlesztettünk ki a mikroszaporított elit nyárfa (Populus tremula L.) genotípusok molekuláris azonosítására. A 33 vizsgált mikroszatellita lókuszból 14-et választottunk ki a fenntartható PCR-amplifikáció és a gyors forgatású erdészeti ültetvények létrehozására szánt elit nyárfa klónok jelentős variabilitása miatt. Mind a nyolc vizsgált klón különböző multilokusz genotípusokkal rendelkezett. A telepített ültetvények közelében található három őshonos referenciaállomány 114 fája között 80 haplotípust azonosítottak, míg néhány ismétlődő genotípust természetes klónoknak tulajdonítottak, amelyek a csírázás eredményeként jelentek meg. A kiválasztott SSR markerek megbízható egyedazonosítást mutattak, az azonos nyárfa genotípusok megjelenésének alacsony valószínűségével (legalább 1 × 10-4 és 1 × 10-4 a nem rokon és a rokon egyedek esetében). A vizsgálati rendszer gyakorlati alkalmazását bemutató esettanulmányokat ismertetünk, beleértve a klónszerkezet és a genetikai diverzitás szintjének elemzését három természetes nyárfaállományban, amelyek olyan területeken nőnek, ahol elit klónokból álló ültetvényeket hoztak létre.
1. Bevezetés
Az őshonos erdők folyamatos pusztulása világszerte a túlhasználat miatt olyan intenzív erdőgazdálkodási formák bevezetését teszi szükségessé, amelyek nemcsak a gazdasági hatásnak, hanem a fásszárú növényi genetikai erőforrások megőrzésének is kedveznek. Ez a feladat az erdei fák elit genotípusainak megszerzését és fenntartását hirdeti meg, amelyek célja a gyors forgatású erdőtelepítések. A nemesítés, a mutációk szelekciója és/vagy a géntechnológia eredményeként új, nagy termőképességű és az abiotikus tényezőkkel, kártevőkkel és kórokozókkal szemben fenntartható fajták és fajták jelennek meg. Az ilyen kiváló egyedek klónozott szaporítása biztosítja hasznos tulajdonságaik rögzítését mind a további nemesítési kísérletekhez, mind a célzott erdészeti ültetvények létrehozásához. Különösen a mikroklonális szaporítás in vitro kultúrával lehetővé teszi a kívánt tulajdonságokkal rendelkező egyedek gyors, nagyszabású és költséghatékony klónozását, különösen akkor, ha a hagyományos rügyfakasztás vagy oltás nem lehetséges vagy különleges erőfeszítéseket igényel.
Mivel a morfológiailag és anatómiailag különböző növényi klónok hasonlónak tűnhetnek, elengedhetetlen azok megbízható azonosítása, beleértve az egymástól és a rokon fajú egyedektől vagy más, közeli rokon fajok képviselőitől való megkülönböztetést. Az erdészetben az egyedek azonosításának problémája különösen fontos, mivel a fák külső megjelenése nagymértékben függ a környezeti paraméterektől . Az erdei fák természetes ontogenezisének bizonyos szakaszaiban, például a csemeték és a csemeték, és különösen kalluszokként vagy vitro sejttenyészetekben, az egyedek nemcsak egyedileg, hanem a fajmeghatározás szempontjából is megkülönböztethetetlenek lehetnek. A hosszú generációs idő és az ontogenetikailag késői érés reálissá teszi az elit klónok genetikai passzportálásának feladatát a fás növényeknél. Az elit fajták nemesítéssel vagy géntechnológiával történő kinyerésének, szaporításának és bevezetésének összetett, többlépcsős folyamata növeli a különböző hibák valószínűségét.
A molekuláris genetikai markerek (MGM) igen hatékony eszköznek bizonyultak az egyedazonosításban. A különböző MGM-osztályok közül a mikroszatellitek vagy egyszerű szekvenciaismétlődések (SSR) a legjobban megfelelnek az azonosításra szolgáló vizsgálati rendszerek követelményeinek, mivel specifikusak, kodominánsak, szelektív semlegesek, elegendő allélgazdagsággal rendelkeznek, és a magas mutációs ráta miatt heterozigóták. Ráadásul a növények nemzetségein és családjain belüli viszonylagos genomkonzervativizmus miatt az SSR-jelölők és az amplifikációjukhoz szükséges PCR-primerek egyik taxonról a másikra átvihetők.
Számos nyárfafajban sikerült molekuláris markerek, köztük SSR-loci segítségével DNS-ujjlenyomatot készíteni és megkülönböztetni a klónokat, kultivárokat és fajtákat.
A jelen tanulmányban a nyárfa (Populus tremula L.) mikroszaporított elit genotípusainak molekuláris genetikai azonosítására szolgáló SSR-alapú vizsgálati rendszer kifejlesztéséről számolunk be, amely az Orosz Föderáció több régiójában gyorsan növő erdészeti célültetvények létrehozását célozza, és bemutatjuk a rendszer alkalmazásának eredményeit az egyes genotípusok megkülönböztetésére, a természetes nyárfaállományok klonális szerkezetének vizsgálatára és a populációk genetikai variabilitásának becslésére.
2. Anyag és módszerek
Az elit genotípusok azonosítására szolgáló tesztrendszer kifejlesztése magában foglalta a klónok nagy felbontású megkülönböztetésének követelményeinek megfelelő specifikus markerkészlet kiválasztását, valamint megbízhatóságának és azonosítási képességének tesztelését egy sor elit genotípuson és egy vizsgált faj megfelelő számú képviselőjén.
2.1. Az elit genotípusok azonosítására szolgáló tesztelési rendszer kifejlesztése Növényi anyag
A molekuláris azonosítás tesztrendszerének kifejlesztéséhez használt elit nyárfa- és hibridklónokat az Orosz Tudományos Akadémia Shemjakin és Ovcsinnikov Bioorganikus Kémiai Intézetének puscsinói fiókjában (Puscsino, Oroszország) fenntartott mikroszaporított sejtkultúrákból nyertük. Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.
Prisady. Prisady településtől 1 km-re nyugatra található kísérleti parcella a Moszkvai terület (Oroszország) Serpukhovsky Raion (körzet) területén. Referenciapopulációként 52 fiatal vagy középkorú (kb. 10-25 éves) nyárfa levelét használták, amelyek egy, a kísérleti terület közvetlen közelében (1 km) található természetes, többéves állományból származnak.
Voronyezs. Tizenhét fából vettek mintát a Voronyezsi területen létrehozott kísérleti parcellával szomszédos állományban. További 13 fát a Voronyezs folyó partja mentén gyűjtöttünk Voronyezs városán belül, az ültetvény közelében.
Joshkar-Ola. A Mari-El Köztársaság Yoshkar-Ola városának közelében található kísérleti parcellához referenciapopulációként használt fák forrása a fiatal, őshonos nyárfaállomány volt. 32 fáról gyűjtöttük a leveleket.
A vegetatív eredetű (hajtás révén) egyedek alkalmi mintavételének minimalizálása érdekében a leveleket egymástól legalább 15-20 m távolságra lévő fákról gyűjtöttük. Ezt a megközelítést alkalmaztuk, hogy a maximális genetikai diverzitással rendelkező, túlnyomórészt nyílt beporzású csemetékből álló referenciamintákba felvegyük. Kizárólag a fák külső megjelenése és a köztük lévő távolság alapján azonban nem lehetett elkerülni a hajtásképződés következtében megjelenő hajtások mintavételét, amit a későbbi genetikai elemzés is megerősített.
A leveles hajtásokat alumínium teleszkópos árboccal ellátott mechanikus vágóeszközzel vágtuk le. A begyűjtött leveles hajtásokat a feldolgozásig legfeljebb 6 napra műanyag zacskókba helyeztük +4 °C-on. A minta előkészítése magában foglalta a DNS kivonását és a tartalék levélszövetdarabok szilikagéllel ellátott, felcímkézett zip-zacskókba helyezését a hosszú távú tárolás érdekében. Az aktív vegetációs időszakon kívül a szunnyadó vegetatív rügyek is sikeresen felhasználhatók DNS-kivonásra.
2.2. DNS-kivonás. DNS-kivonás
A DNS-kivonáshoz Petri-csészékben, speciális táptalajon (REF) in vitro növő explantátumokból vett kb. 350-500 mg-os levéltöredékeket használtunk.
A honos populációkból származó fák esetében a DNS-t 350-500 mg friss vagy 200-300 mg szilikaszénnel szárított levélszövetből módosított metil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB) módszerrel vontuk ki.
2.3. A DNS-kivonás az őshonos fákból történt. Mikroszatellit-elemzés
A mikroszatellitek vagy SSR-ek a tandemszerűen ismétlődő DNS-szekvenciák egy osztályát képviselik, amelyek rövid (1-6 nukleotidpár, bp) motívumokkal rendelkeznek, és a magas mutációs ráta miatt az egyedek között eltérő példányszámúak. Az általában a kodomináns mikroszatellita lokuszokban található többszörös allélok az egyedi genotípusos kombinációk nagy változatosságát hozzák létre, ami biztosítja megbízható azonosításukat, különösen, ha elegendő számú lokuszt alkalmaznak. Technikailag az SSR-polimorfizmus elemzése csak polimeráz láncreakciót (PCR) és azt követő elektroforézist (gél vagy kapilláris) igényel a fragmentumok elemzéséhez. A vizsgálati rendszer kifejlesztéséhez a módszer azon változatát választottuk, amely csak alapfelszerelést és egyszerű reagenseket használ. Ez biztosította az eljárások nagyobb reprodukálhatóságát bármely PCR-laboratóriumban, és lehetővé tette az elemzés nagy költséghatékonyságának elérését, ami kulcsfontosságú a nagyszabású gyakorlati klónazonosításhoz.
Mivel a nyárfákra vonatkozó nukleáris SSR-lókuszok jelentős számát találtuk az irodalomban és a primer-adatbázisokban, úgy döntöttünk, hogy több publikációból választunk és olyan primereket tesztelünk, amelyek nagyon egyszerű berendezésekkel, DNS-analizátorok használata nélkül, rutinszerű genotípus-azonosításra használhatók. Az SSR-primerek kezdeti készlete a nyárfa molekuláris azonosításának tesztelési rendszerében való potenciális felhasználásuk elemeként a szakirodalmi adatbázisokban (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) és a Molecular Ecology Resources Primer Database-ben (http://tomato.bio.trinity.edu/) végzett keresés eredménye volt.
A DNS-amplifikációt PCRCore kitekkel végeztük (Isogen Laboratories, Ltd., Moszkva, Oroszország) a BioRad Inc. (USA) Dyad Thermociklere segítségével végeztük. Az ORPM és WPMS sorozatból származó mikroszatellita lokuszokat (a 2. táblázatban felsoroltak) specifikus primerekkel amplifikáltuk 1 mmol/mL koncentrációban és 5-10 ng cél-DNS-sel, a következő hőmérsékleti profil alkalmazásával: (1) kezdeti denaturáció 94 °C-on 3 percig; (2) 30 ciklus, amely 30 másodperces 94 °C-os denaturációból, változó hőmérsékletű és idejű primer lágyításból (az eljárás beállítása után ajánlott végső lágyítási hőmérsékletet lásd a 3. táblázatban) és 1,5 perces 72 °C-os elongációból áll, majd (3) 10 perces 72 °C-os végső elongáció és (4) a PCR-keverék 4 °C-ra hűtése.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Comments: 1Tuskan et al., 2004 ; 2Smulders et al., 2001 ; 3by literature data in different Populus species (P. tremula, P. x canescens, and P. alba). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1P: polymorphic, M: monomorphic, and N: no PCR amplification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A PCR-termékeket 6%-os poliakrilamid gélblokkokban Tris-EDTA-borát pufferrendszerrel elektroforézisnek vetettük alá. Miután az elektroforézis géleket etídium-bromid oldatban megfestettük és UV-fényben vizualizáltuk, grafikus képeket készítettünk és mentettünk a Doc-Print II Vilber Lourmat géldokumentációs rendszerrel, majd grafikus szerkesztőkben feldolgoztuk. A fragmentumok méretét speciális szoftverrel (Photo-Capt) becsültük meg. A HpaII endonukleázzal korlátozott E. coli pBR322 plazmid DNS-ét molekulatömeg-markerként használtuk.
2.4. A molekulatömeg-markereket a HpaII endonukleázzal módosítottuk. Statisztikai elemzés
A klónazonosságot a kodomináns adatokra vonatkozó multilokuszi egyezések elemzésével határoztuk meg. A genotípus valószínűségét (GP), amely egy adott multilokusz kombináció populációban való megjelenésének valószínűségét jelenti, és az azonosság valószínűségét, amely két nem rokon (PI) vagy rokon (PIsib) egyed véletlen egyezésének valószínűségét becsüli meg egy adott lókuszcsoport alapján, a populációs minták allélfrekvenciáinak eloszlása alapján számoltuk.
A megfigyelt genotípus-eloszlások megfelelését az egyes SSR-lókuszok esetében a Hardy-Weinberg-egyensúly szerint várhatóval a chi-négyzet kritériummal vizsgáltuk. Az allélszámot, valamint a megfigyelt és a várt heterozigozitásokat minden egyes natív mintára kiszámítottuk. A vizsgált populációs minták közötti genetikai felosztás értékelésére a Wright-féle F-statisztikát alkalmaztuk. Az összes fent említett számítást az MS Excelhez készült GenAlEx 6.5 kiegészítő programban végeztük el.
3. Eredmények és megbeszélés
3.1. Eredmények és megbeszélések
3.1. SSR-alapú vizsgálati rendszerek kifejlesztése a nyárfa genotípus-azonosítására
A kezdeti teszteléshez 33 heterológiai tri-, tetra-, penta- és hexanukleotid mikroszatellita lókuszt választottunk ki két sorozatból; az ORPM sorozatot először a Populus trichocarpa-ra, a WPMS sorozatot pedig a Populus nigra-ra terveztük . E lókuszok jellemzőit a 2. táblázat tartalmazza. A kezdeti vizsgálatokat három klón (47-1, PtV22 és С-kontroll) DNS-mintáján végeztük el, amelyek az Orosz Tudományos Akadémia Shemjakin és Ovcsinnikov Bioorganikus Kémiai Intézetének puscsinói fiókjában (Puscsino, Moszkvai terület, Oroszország) tárolt és szaporított in vitro gyűjteményből származnak. Ebben a szakaszban a variabilitásukat Novoszibirszki területről (Nyugat-Szibéria, Oroszország) és Krasznojarszki területről (Közép-Szibéria, Oroszország) származó vadnyárfák 20-24 példányán is tesztelték.
A tesztelés első szakaszának eredményeként 24 lókuszt sikerült felerősíteni, kilenc másik lókuszt pedig nem sikerült PCR-terméket előállítani. A 24 lókuszból, amelyek PCR-fragmentumokat hoztak létre, 20 lókusz variábilisnak bizonyult, kettőtől kilencig terjedő allélszámmal, míg négy sikeresen amplifikált lókusz monomorf volt (3. táblázat). További, változó PCR-rendszeren végzett vizsgálatokat követően végül 14 megbízhatóan amplifikálódó és jelentős polimorfizmus-szintű lókuszt választottunk ki a molekuláris genetikai azonosítás tesztrendszerébe való felvételre. A kiválasztott mikroszatellita lokuszok nyárfa variabilitásának példái a 2. a) és 2. b) ábrán láthatók.
(a)
(b)
(a)
(b)
A nyolc elit klón és az őshonos állományokból származó vadfák referencia genotípusainak kapott multilokusz genotípusait a Kiegészítő anyag S1. táblázata tartalmazza, amely online elérhető a http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518 oldalon. A mikroklonális szaporítás különböző fázisaiban vett mintákból legfeljebb 8 ramet elemeztünk. A klónokon belül a genotípusok stabilak voltak és egyértelműen reprodukálódtak a ramettek között, függetlenül a szaporítás szakaszától. Az azonos genetikájú ramettek kizárása után mind az elit klónok, mind a referencia mintákban szereplő őshonos populációkból származó nyárfa genotípusok 100%-ban különböztek egymástól. A genotípusok megjelenési valószínűsége (GP: genotípus valószínűség) az elit klónok között 2,4 – 10-21 és 1,7 – 10-11 között, a referencia mintákban szereplő fák között 4,0 – 10-24 és 5,8 – 10-9 között változott. Két nem rokon genotípus esetenkénti egybeesésének valószínűsége (PI: az azonosság valószínűsége) a Yoshkar-Ola-ban 4,8 – 10-10-10 és a Prisady-ban 4,3 – 10-13 között változott. Az összehasonlított egyedek azonos ősöktől való leszármazásának elméleti valószínűségéhez igazítva konzervatívabb becslés (PIsibs) 1,0 – 10-4 között volt a Yoshkar-Olában és 9,3 – 10-6 között Voronyezsben. Valamennyi érték meglehetősen alacsony, így a különböző ivarsejtek magszaporodás során történő rekombinációjából eredő ismétlődő genotípusok megjelenésének elméleti gyakorisága nem haladta meg a 10000 összehasonlításból véletlenül talált 1 azonos allélkombinációt. A PI és a PIsibs összefüggése a felhasznált lókuszok számával a 3. ábrán látható, és gyakorlatilag elhanyagolható valószínűségét mutatja az azonos genotípusok megjelenésének a vizsgálati rendszerbe való felvételre kiválasztott első 7-8 lókusz használata során. Mind a 14 lókusz használata biztosítja az eljárás további megbízhatóságát és robusztusságát.
A mikroszatellita lókuszok kifejlesztése a Populus nemzetség fajaira a 20. század végén kezdődött a molekuláris genetikai markerek technológiáival együtt. 1998-ban az amerikai remegő nyárfa, Populus tremuloides számára tervezték az egyik első primer készletet a dinukleotid SSR lokuszok amplifikálására. Ebben a tanulmányban bemutatták ugyanezen markerek sikeres keresztamplikációját több más nyárfajra, a P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis és P. maximowiczii esetében. A szerzők az SSR-lókuszok széles körű alkalmazási lehetőségeit is bemutatták különböző célokra, beleértve a klónok azonosítását, a kontrollált párosítások elemzését, a genomtérképezést, a markerekkel támogatott szelekciót, a genetikai diverzitás vizsgálatát, valamint az erdei genetikai erőforrások megőrzésére és fenntartható kezelésére irányuló programok támogatását. Későbbi tanulmányok nyolc másik dinukleotid SSR-loccsal szolgáltak a Populus tremuloides számára. Azóta más fajok, köztük a P. nigra számára is kifejlesztettek mikroszatellita lókuszokat. E lókuszok közül néhányat a P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans és P. lasiocarpa esetében is amplifikáltak. A Populus euphratica számára specifikus SSR-loci primereket terveztek. Később ezt a készletet használták fel a faj genetikai diverzitásának becslésére szolgáló multiplex panelek kifejlesztésére.
Az újgenerációs szekvenálás volt a leghatékonyabb módja a tandem ismétlődések kimutatásának a nyárfa genomjában, és a bázisukon átvihető SSR-primerek tervezésének, amint azt a balzsamos nyárfa, a Populus trichocarpa esetében bebizonyosodott. Az ilyen univerzális keresztamplikált lókuszokat faj- és hibridazonosításra és a rokon fajok közötti genetikai differenciálódás becslésére használják .
A mikroszatellitek hasznosak az egyetlen donorfából mikroklonális szaporítással nyert rameteken belüli szomaklonális diverzitás ellenőrzésére is, az egyes klónok azonosítására a környezeti tényezőkkel szembeni tűrőképességük szempontjából. Nem tapasztaltunk eltérést az SSR-mintázatokban az azonos elit klónvonalba tartozó ramettek között. A nukleáris mikroszatelliteket a molekuláris markerek más osztályaival együtt a nyárfák ploidia szintjének meghatározására is alkalmazzák, és több genotípus esetében triploiditásra utaló jeleket találtunk. A triploid nyárfa hibridek gyakran mutatnak fokozott vitalitást és a kórokozókkal szembeni ellenállóképességet, ezért ezt a kérdést tovább kell vizsgálni kariológiai és lebegő citometriás elemzésekkel.
3.2. A kariológiai és lebegő citometriás vizsgálatokat a nyárfa hibridek esetében is folytatni kell. A klonális struktúra elemzése az őshonos nyárfa-állományokban
A vadon élő állományok anyagának terepi mintavételezése óta igyekeztünk elkerülni a nyárfa esetében gyakori, hajtásként keletkezett klonális ramettek felvételét. Minden vizsgált állományban ugyanazt a mintavételi sémát alkalmaztuk, legalább 15-20 m távolságot tartva a fák között. Ennek ellenére minden vizsgált természetes populációban találtunk azonos klónból származó, vegetatív szaporodásra utaló fürtöket (S1. táblázat).
Prisady. A vizsgált 52 fa között 41 különböző haplotípust találtunk; egy multilokusz genotípus kilencszer, egy pedig háromszor fordult elő. Arra a következtetésre jutottunk, hogy ezek az ismétlődő multilókusz-kombinációk abból adódtak, hogy a mintavételezett hajtások ugyanazon klón rametjei voltak.
Voronyezs. A kísérleti ültetvény helyszínének közvetlen közelében gyűjtött 17 fa között nem találtunk klón egyedeket. A Voronyezs folyó partján gyűjtött tizenhárom fát nyolc genotípus képviselte: közülük négyet egy ismétlésben, hármat ugyanazon klón két ramettjének találtak, egy genotípust pedig három példányban találtak, amelyek nyilvánvalóan valaha létező ősfák hajtásából származtak. Összesen 25 különböző haplotípust azonosítottunk ebben a referenciapopulációs mintában.
Yoshkar-Ola. Harminckét elemzett fa kombinálódott 13 különböző haplotípussá, amelyeket a multilokális egyezések elemzésével azonosítottunk; egy genotípus kétszer, egy genotípus ötször, egy genotípus hétszer és egy genotípus kilencszer jelent meg. Az ismétlődő genotípusok nyilvánvalóan a csírázásból származó rameteknek feleltek meg.
Azt a következtetést vontuk le, hogy a csírázás és a magas szintű klonalitás széles körben elterjedt jelenség az őshonos nyárfaállományokban. A nyárfában, csakúgy, mint sok más nyárfában, a vegetatív klónok képesek nagy területeket elfoglalni. Ezért az ismétlődő klonális genotípusoktól mentes minta gyűjtéséhez a fák közötti távolságokat legalább 40-50 m-re kell növelni, azonban egy-egy klón maximális elterjedésének pontosabb becslése az állomány területén szintén speciális feltárást igényel.
A többi alkalmazás mellett a nukleáris SSR-lókuszok hasznosak voltak a klonális szerkezet és a klonális genotípusok közötti genetikai kapcsolatok vizsgálatához natív állományokban vagy natív és mesterséges állományok között . Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.
3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| s.e.: standard error. : sample size. : mean number of alleles. : effective number of alleles. : observed heterozygosity. : expected heterozygosity. : unbiased expected heterozygosity. : fixation index (intrapopulation coefficient of inbreeding). |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| s.e.: standard error. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . Az általunk a natív nyárfaállományokban megfigyelt populáción belüli genetikai diverzitás szintjei a nyárfáknál általánosan megfigyelt és SSR lókuszok elemzésével becsült értékek tartományán belül voltak ( és az ottani hivatkozások).
A mikroszatellita technikát alkalmazó tanulmányok jelentős része a hibridizáció kimutatására összpontosított a nyárfák természetes vagy mesterséges állományaiban. Az SSR-lókuszok segítenek feltárni a fajok közötti kereszteződés és a reproduktív izoláció mechanizmusait . Ebben a tanulmányban nem a fajok közötti különbségekre, hanem az egyedek és a populációk közötti eltérésekre koncentráltunk, de néhány vizsgált elit klón esetében a hibrid eredetüket genetikai vizsgálatnak kell alávetni egy komplex, de nukleáris és citoplazmatikus lokalizációjú markercsoport segítségével. Az interspecifikus hibridek és ipari klónok nagy pontosságú azonosításáról jelentős számú publikációban számoltak be . Egy figyelemre méltó publikáció a korábban különbözőként kezelt nyárfák néhány ipari klónjának genetikai azonosságáról számol be .
A kereskedelmi klónok in vitro gyűjteményekben történő azonosságellenőrzésének gyakorlati feladata hasonló volt a jelen kutatásban alkalmazotthoz. Minden olyan alkalmazásban, ahol megbízható egyedi azonosításra volt szükség, az SSR-ek nagy hatékonyságot mutattak.
4. Következtetés
A nukleáris mikroszatellita lókuszok alkalmazása genetikai azonosításra és a genetikai variabilitás értékelésére nyárfa elitklónokban és őshonos állományokban a kifejlesztett, alacsony költségű SSR-alapú vizsgálati rendszer nagy hatékonyságát mutatta. A klónok megbízható hitelesítése biztosítja a mikroklonális szaporítás genetikai nyomon követését, és lehetővé teszi a klonalitás feltárását az őshonos állományokban. Kimutattuk, hogy ugyanaz a mikroszatellita lókuszkészlet sikeresen alkalmazható a nyárfa populáción belüli és populációk közötti genetikai variabilitás szintjének becslésére. Az egyes elit klónok közötti rokonsági viszonyok rekonstrukciója vagy a természetesen párosodó populációk genetikai kapcsolatainak rekonstrukciója olyan perspektivikus feladatok, amelyek a jövőben ugyanezen markerek felhasználásával megvalósíthatók.
Érdekütközés
A szerzők kijelentik, hogy e cikk publikálásával kapcsolatban nem áll fenn érdekellentét.
Megköszönések
Ez a kutatás az Orosz Föderáció Oktatási és Tudományos Minisztériumának támogatásával készült (14.607.21.0044 számú projekt 2014.08.22-től; egyedi azonosító RFMEFI60714X0044). A szerzők köszönetet mondanak továbbá E. M. Romanovnak, A. I. Shurginnak, R. V. Sergeevnek (Volgai Állami Műszaki Egyetem, Yoshkar-Ola, Mari El Köztársaság, Oroszország), M. V. Drapaluknak, A. V. Tzaralungának, A. A. Reshetnikovnak, E. O. Kolesnikova (Voronyezsi Állami Erdészeti Mérnöki Egyetem, Voronyezs, Oroszország) és G. B. Kolganikhina (Institute of Forest Science RAS, Uspenskoe, Moszkvai terület, Oroszország), az őshonos állományokban végzett mintavételben nyújtott segítségükért. A szerzők hálásak továbbá M. Zepsnek, D. Auzenbahának és A. Gailisnak (Lett Állami Erdészeti Kutatóintézet “Silava”, Salaspils, Lettország) a biológiai anyagok és a nyárfa elit klónokra vonatkozó információk megosztásáért.