A PCR-klónozásnak (1) számos alternatív megközelítését dolgozták ki, beleértve a TA-klónozást (2), a ligációtól független klónozást (LIC) (3-4), a rekombináz-függő klónozást (5-7) és a PCR-mediált klónozást (8-10). Bármelyik klónozási módszer gyakorlati hasznosságát a megbízhatósága határozza meg, nem pedig a kényelme, az ára vagy az optimális körülmények közötti hatékonysága. A legkönnyebben ellenőrizhető és optimalizálható módszerek bizonyulnak végül a legmegbízhatóbbnak. A TA-klónozás és a LIC olyan végmódosításokat igényel, amelyek gélelektroforézissel nem ellenőrizhetők. A rekombinázokat általában a klónozási készletek védett összetevőiként árulják, így kevés fogyasztó optimalizálja az in vitro rekombinációs reakciókat. Az itt ismertetett overlap extension PCR-klónozás nem az első PCR-közvetített klónozási forma (8-10). Viszonylag egyszerű, hatékony és megbízható.
A két PCR közül az első (1A. ábra) egy lineáris inszert hoz létre plazmidszekvenciákkal a két végén (lásd a Kiegészítő anyagokban a módszereket és a primertervezésre vonatkozó utasításokat). Ezek a nyúlványok ezt követően lehetővé teszik, hogy a PCR-termék szálai (1A. ábra) túlméretezett primerpárként működjenek a vektorfragmentumon (1B. ábra). Denaturálást és lágyítást követően az inzert szálak hibridizálódnak a vektorhoz, és új, kettős szálú plazmidot alkotva meghosszabbodnak. A technika végrehajtásához elengedhetetlen Phusion DNS-polimeráz (kat. sz. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) nem rendelkezik száleltolódási aktivitással. Ezért a reakció végterméke egy kétszálú fúziós plazmid, amely két bevágással rendelkezik (mindkét szálon egy-egy). Ezt a lazított kettősszálú plazmidot ezután kompetens Escherichia coli sejtekbe transzformáljuk, amelyek DNS-javító enzimekkel zárják le a réseket (1C. ábra). Ugyanazt a termosztálható polimerázt alkalmazzuk mindkét PCR-hez, így a tapasztalatlan felhasználók hatékonyan klónozhatnak anélkül, hogy elsajátítanák a többféle restrikciós enzim, polimeráz, glikoziláz, rekombináz és ligáz sajátosságait.
(A) Először az inszertet PCR-amplikáljuk a kiméra primerekkel, hogy a végső PCR termék átfedő régiókkal rendelkezzen a vektorral. (B) Ezután a vektort és az inszert összekeverjük, denaturáljuk és lágyítjuk; a hibridizált inszert ezután a Phusion DNS-polimerázzal meghosszabbítjuk a vektort templátként használva, amíg a polimeráz el nem éri az inszer 5′ végét. Több PCR-ciklus után termékként felhalmozódik az új plazmid, amely két bevágást tartalmaz (egyet-egyet mindkét szálon). (C) Az új plazmid transzformálható E. coliba, miután a szülői plazmidot DpnI emésztéssel megsemmisítettük.
Először gfp-t használtunk az elvi kísérletek bizonyítására. A gfp gént PCR-amplifikáltuk (1A. ábra) a kiméra primerekkel (5′ vége komplementer a pQE30 plazmidhoz; 3′ vége komplementer a gfp-hez). Az overlap extension PCR-t (1B. ábra) öt különböző DNS-polimerázzal végeztük (S1. kiegészítő táblázat). Az inzert magas koncentrációja és a reakció viszonylag alacsony annealing hőmérséklete (5-10°C-kal a primer/plazmid komplex számított olvadási hőmérséklete alatt) fontos a hatékony átfedéses hosszabbításhoz. A PCR-termékek egy része megfelel a kívánatos vektor relaxált formájának, amint azt az agarózgél-elemzés kimutatta (2A. ábra). Az eredeti pQE30 vektor a DpnI restrikciós endonukleázzal végzett reakciókban megsemmisült (1C. ábra). Minden reakcióból egy kis aliquotot használtunk E. coli sejtek transzformálásához.
(A) Az overlap extension PCR klónozási reakció termékei 0, 5, 10, 15, 20, 25 és 30 ciklus után agaróz gélelektroforézissel. Három nanogramm pQE30 vektort kevertünk 175 ng inzerthez (250 mólos felesleg) 10 μL össztérfogatban; a reakció 4 μL-es aliquotját 0,8%-os agaróz gélen választottuk szét. M2, 1 kb-os DNS létra; M1, összeállított plazmid zárt cirkuláris és lazított cirkuláris formában. (B) A gfp gén overlap extension PCR klónozásának hatékonysága a PCR-ciklusok számának függvényében. Húsz mikroliter kompetens E. coli sejtet transzformáltunk 1 μL pQE30/insert overlap extension PCR-rel. A zöld kolóniák számát minden egyes lemez esetében a PCR-ciklusok számának függvényében ábrázoltuk. (C) Az overlap extension PCR klónozási hatékonysága az inszerthossz függvényében. A Phusion DNS-polimerázt különböző méretű PCR-termékek PCR-amplifikálásához használtuk: GFP (gfp) gén, β-D-glükuronidáz (gusA) gén, β-galaktozidáz (lacZ) gén és a luxABCDE operon a hordozó pIMBB plazmidból. Ezeket a termékeket géltisztítottuk, és a pQE30 vektorral végzett átfedéses hosszabbító PCR-reakcióban használtuk fel. Három nanogramm pQE30 vektort 175-500 ng inzerthez kevertünk 10 μL összreakciótérfogatban, és 18 PCR-ciklusnak vetettük alá. A DpnI-kezelést követően az overlap extension PCR-termékeket kompetens E. coli sejtek transzformálására használtuk. A lemezenkénti telepek számát az inzert méretének függvényében ábrázoltuk.
A fúziós DNS-polimeráz jobban alkalmas volt az overlap extension PCR klónozásra, mint az általunk vizsgált versenytársak (S1 kiegészítő táblázat), talán a jobb feldolgozhatóságának és hűségének köszönhetően (11-12). A Phusion DNS-polimeráz 10× processzívabb, mint a natív Pfu-polimeráz (Cat. no. 600135; Stratagene, La Jolla, CA, USA), és 46× több kolóniát hozott létre (Kiegészítő S1 táblázat). Ugyancsak 35× több kolóniát termelt, mint az Expand Long Template DNS-polimeráz keverék (kat. sz. 11681834001; Roche, Basel, Svájc), amely főként Taq DNS-polimeráz. Zuo és Rabie hasonló módszert dolgozott ki kizárólag Taq DNS-polimerázzal, és hasonlóan szerény klónozási hatékonyságról számoltak be (8). A Taq DNS-polimeráz viszonylag gyors (60%-a a Phusionénak), de a keverék teljes hűsége csak 3,8%-a a Phusionénak. A Phusion DNS-polimerázzal előállított DNS-sel transzformált kolóniák több mint 98%-a láthatóan zöld volt, ami minimális klónozási hibára vagy az eredeti vektor átvitelére utal.
Mértük az átfedési hosszabbító PCR-klónozás hatékonyságát a hőmérsékleti ciklusok függvényében; a rekombináns klónok száma az első 15 ciklus alatt geometrikusan nőtt, és 17-18 ciklusnál érte el a csúcsot (2B ábra). A további ciklusok a keletkezett klónok mennyiségének enyhe (~30%-os) csökkenését eredményezték, ami az agaróz gélekben megfigyelt nagy molekulatömegű DNS-termékek felhalmozódásával függött össze (2A. ábra). Az inzert/plazmid arány is jelentős hatással lehet a reakció eredményére. Három különböző vektor:inzert arányt (1:5; 1:50 és 1:250) hasonlítottunk össze a Phusion DNS-polimerázzal végzett overlap extension PCR klónozási reakcióban. Mindhárom arány a plazmid bevágott formájának megjelenését eredményezte (agaróz gélelektroforézissel megítélve, nem látható) és rekombináns klónok megjelenését (transzformációval és zöld kolóniák növekedésével megítélve). Az 1:250 arány hozta létre a legtöbb rekombináns klónt.
Ezután átfedéses hosszabbító PCR klónozást alkalmaztunk a GFP (gfp, 1 kb), β-D-glükuronidáz (gusA, 1,9 kb) és β-galaktozidáz (lacZ, 3,2 kb) génjeinek, valamint a teljes luxABCDE operon (6 kb) klónozására. Az összes rekombináns vektor helyes szerkezetét restrikciós elemzéssel és riporterfehérje-funkcióval igazoltuk. A módszerünkkel kapcsolatos nyilvánvaló hibaarány, a teljes riporteraktivitást nem mutató telepek töredéke alapján megítélve, <3% volt, függetlenül az inszert méretétől (az adatok nem láthatóak). Ugyanakkor a transzformációt követően a lemezeken megfigyelt telepek száma jelentősen csökkent az inzert hosszának növekedésével (2C ábra). A grafikon szinte lineáris, ami arra utal, hogy a 6,7 kb az inzertek felső határa ezzel a technikával.
Minden klónozási projekt eredménye nagyban függ a dolgozó erőfeszítéseitől és a részletekre való odafigyelésétől. Az itt leírt átfedési hosszabbításos PCR-klónozási reakció ugyanolyan könnyen ellenőrizhető és optimalizálható, mint bármely más hosszú PCR-protokoll (13). Általánosságban elmondható, hogy a PCR-eredmény gyenge, ha a reakciókörülmények túl szigorúak (a primerek nem kapcsolódnak) vagy túl lazák (nem specifikus primerelés). Mindkettő üres sávokban nyilvánul meg az agarózgéleken, bár az utóbbi is eredményezhet elkenődést vagy nem kívánt sávokat (a primertervezés és a PCR-reakció optimalizálásának részleteit lásd a Kiegészítő anyagoknál). A PCR szigorúsága szabályozható a reaktánsok koncentrációjának (primerek, templát), a lágyítási hőmérsékletnek, a puffer összetevőinek (magnézium, pH, DMSO) vagy a hőmérsékleti ciklusok számának változtatásával. Összességében ez a klónozási megközelítés érzéketlennek bizonyult a belső ismétlődő elemek jelenlétére (a részleteket lásd a Kiegészítő anyagoknál). A Phusion DNS-polimeráz használható mind az inzert PCR-amplifikációjának, mind az átfedési hosszabbítási reakciók katalizálására, így a gyakorlati szakembereknek csak egyetlen enzim sajátosságaival kell megismerkedniük.