- Abstract
- 1. Introduzione
- 2. Materiale e metodi
- 2.1. Materiale vegetale
- 2.2. Estrazione del DNA
- 2.3. Analisi dei microsatelliti
- 2.4. Analisi statistica
- 3. Risultati e discussione
- 3.1. Sviluppo di sistemi di test basati su SSR per l’identificazione del genotipo in Aspen
- 3.2. Analisi della struttura clonale nei popolamenti nativi di Aspen
- 3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
- 4. Conclusioni
- Conflitto di interessi
- Riconoscimenti
- Materiale supplementare
Abstract
Sistemi di test per l’identificazione molecolare dei genotipi d’élite di aspen (Populus tremula L.) micropropagati sono stati sviluppati sulla base di loci microsatelliti (SSR). Dei 33 loci microsatelliti testati, 14 sono stati selezionati a causa dell’amplificazione PCR sostenibile e della sostanziale variabilità nei cloni d’élite di pioppo tremulo destinati alla creazione di piantagioni forestali a rotazione rapida. Tutti gli otto cloni testati avevano diversi genotipi multilocus. Su 114 alberi di tre popolamenti autoctoni di riferimento situati vicino alle piantagioni stabilite, sono stati identificati 80 aplotipi, mentre alcuni genotipi ripetuti sono stati attribuiti a cloni naturali apparsi in seguito alla germinazione. La serie selezionata di marcatori SSR ha mostrato un’identificazione individuale affidabile con una bassa probabilità di comparsa di genotipi identici di pioppo tremulo (un minimo di e 1 × 10-4 per gli individui non imparentati e correlati, rispettivamente). Sono descritti casi di studio che dimostrano le applicazioni pratiche del sistema di test, compresa l’analisi della struttura clonale e dei livelli di diversità genetica in tre popolamenti naturali di pioppo tremulo che crescono nelle regioni in cui sono state stabilite piantagioni composte da cloni d’élite.
1. Introduzione
Il continuo degrado delle foreste native in tutto il mondo dovuto all’eccessivo sfruttamento richiede l’introduzione di forme intensive di silvicoltura che favoriscano non solo l’effetto economico ma anche la conservazione delle risorse genetiche delle piante legnose. Questo compito richiede l’ottenimento e il mantenimento di genotipi d’élite di alberi forestali destinati alle piantagioni forestali a rotazione rapida. Nuove cultivar e varietà altamente produttive e sostenibili a fattori abiotici, parassiti e patogeni appaiono come risultato del breeding, della selezione di mutazioni e/o dell’ingegneria genetica. La propagazione clonale di tali individui eccezionali assicura la fissazione dei loro tratti utili sia per ulteriori esperimenti di breeding che per la creazione di piantagioni forestali mirate. In particolare, la propagazione microclonale tramite coltura in vitro permette la clonazione rapida, su larga scala ed economica di individui con i tratti desiderati, specialmente quando la gemmazione o l’innesto tradizionali sono impossibili o richiedono sforzi particolari.
Siccome i cloni di piante morfologicamente e anatomicamente diverse possono sembrare simili, è essenziale identificare in modo affidabile quelli che comprendono la discriminazione tra loro e dagli individui conspecifici o rappresentanti di altre specie strettamente correlate. In silvicoltura, il problema dell’identificazione individuale è particolarmente cruciale poiché l’aspetto esterno degli alberi è altamente dipendente dai parametri ambientali. In particolari fasi dell’ontogenesi naturale degli alberi forestali, per esempio, piantine e alberelli, e soprattutto come callosità o espianti in coltura cellulare in vitro, gli individui possono essere indistinguibili non solo individualmente ma anche per quanto riguarda la diagnosi delle specie. Il lungo tempo di generazione e la maturazione ontogeneticamente tardiva rendono reale il compito della passerella genetica dei cloni d’élite nelle piante legnose. Il complesso processo multistadio di ottenimento, propagazione e introduzione di cultivar d’élite tramite breeding o ingegneria genetica aumenta la probabilità di vari errori.
I marcatori genetici molecolari (MGM) si sono dimostrati strumenti molto efficienti per l’identificazione individuale. Tra le diverse classi di MGM i microsatelliti o le ripetizioni di sequenza semplici (SSR) si adattano meglio ai requisiti dei sistemi di test per l’identificazione grazie alla loro specificità, codominanza, neutralità selettiva, sufficiente ricchezza allelica ed eterozigosi causata da un alto tasso di mutazione. Inoltre, a causa del relativo conservatorismo del genoma all’interno dei generi e delle famiglie di piante, i marcatori SSR e i primer PCR per la loro amplificazione possono essere trasferibili da un taxon all’altro.
In diverse specie di pioppo, il fingerprinting del DNA e la differenziazione di cloni, cultivar e varietà sono stati dimostrati con successo da marcatori molecolari tra cui i loci SSR.
In questo articolo riportiamo lo sviluppo di un sistema di analisi basato su SSR per l’identificazione genetica molecolare di genotipi elitari micropropagati di aspen, Populus tremula L., finalizzato alla creazione di piantagioni forestali di destinazione a crescita rapida in diverse regioni della Federazione Russa e presentiamo i risultati della sua applicazione per la discriminazione dei singoli genotipi, gli studi della struttura clonale nei popolamenti naturali di pioppo tremulo e la stima della variabilità genetica nelle popolazioni.
2. Materiale e metodi
Lo sviluppo del sistema di test per l’identificazione dei genotipi d’élite comprende la selezione di un set di marcatori specifici che soddisfano i requisiti di discriminazione ad alta risoluzione dei cloni e il test della sua affidabilità e potere di identificazione su un set di genotipi d’élite e un numero sufficiente di rappresentanti di una specie studiata.
2.1. Materiale vegetale
I cloni d’élite di pioppo tremulo e ibridi utilizzati per lo sviluppo dei sistemi di test per l’identificazione molecolare sono stati ottenuti da colture cellulari micropropagate mantenute nella filiale di Pushchino dell’Istituto Shemyakin e Ovchinnikov di chimica bioorganica, Accademia Russa delle Scienze (Pushchino, Russia). Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.
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Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.
Prisady. Appezzamento sperimentale situato a 1 km a ovest dell’insediamento di Prisady in Serpukhovsky Raion (distretto) dell’oblast’ di Mosca (Russia). Come popolazione di riferimento sono state utilizzate le foglie di 52 alberi di pioppo giovani o di media età (circa 10-25 anni) provenienti da un popolamento naturale multistadio situato nelle immediate vicinanze (1 km) di questo appezzamento.
Voronezh. Diciassette alberi sono stati campionati in uno stand adiacente al lotto sperimentale stabilito a Voronezh Oblast. Altri 13 alberi sono stati raccolti lungo la riva del fiume Voronezh nella città di Voronezh vicino alla piantagione.
Yoshkar-Ola. Il giovane popolamento nativo di pioppo tremulo è stato la fonte degli alberi usati come popolazione di riferimento per un lotto sperimentale situato vicino alla città di Yoshkar-Ola, Repubblica di Mari-El. Sono state raccolte le foglie di 32 alberi.
Al fine di ridurre al minimo il campionamento occasionale di individui di origine vegetativa (attraverso la germinazione) abbiamo raccolto le foglie dagli alberi ad una distanza non inferiore a 15-20 m l’uno dall’altro. Questo approccio è stato utilizzato per l’inclusione in campioni di riferimento di piantine prevalentemente ad impollinazione aperta con la massima diversità genetica. Tuttavia, basandosi esclusivamente sull’aspetto esterno degli alberi e sulla distanza tra loro, non è stato possibile evitare il campionamento dei rametti che compaiono a seguito della germinazione, e la successiva analisi genetica lo ha confermato.
I germogli con foglie sono stati tagliati per mezzo di una fresa meccanica con un albero telescopico in alluminio. I germogli raccolti con le foglie sono stati messi in sacchetti di plastica per non più di 6 giorni a +4°С fino alla lavorazione. La preparazione dei campioni comprendeva l’estrazione del DNA e il posizionamento dei frammenti di tessuto fogliare di riserva in sacchetti etichettati con gel di silice per la conservazione a lungo termine. Al di fuori del periodo di vegetazione attiva, le gemme vegetative dormienti possono essere utilizzate con successo per l’estrazione del DNA.
2.2. Estrazione del DNA
Frammenti di foglie di circa 350-500 mg presi da espianti che crescono in vitro su un mezzo speciale (REF) in piastre di Petri sono stati utilizzati per l’estrazione del DNA.
Per gli alberi provenienti da popolazioni native, abbiamo estratto il DNA da frammenti di 350-500 mg di tessuti fogliari freschi o 200-300 mg di silice essiccati con un metodo modificato di bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB).
2.3. Analisi dei microsatelliti
I microsatelliti, o SSR, rappresentano una classe di sequenze di DNA ripetute in tandem con motivi brevi (1-6 coppie di nucleotidi, bp) che differiscono in numero di copie tra gli individui a causa dell’alto tasso di mutazione. Gli alleli multipli che si trovano di solito nei loci microsatelliti codominanti creano una grande varietà di combinazioni genotipiche uniche che assicurano la loro identificazione affidabile, specialmente quando viene impiegato un numero sufficiente di loci. Tecnicamente, l’analisi del polimorfismo SSR richiede solo la reazione a catena della polimerasi (PCR) e la successiva elettroforesi (gel o capillare) per l’analisi dei frammenti. Per lo sviluppo del sistema di analisi abbiamo scelto la variante del metodo che utilizza solo attrezzature di base e reagenti semplici. Questo ha garantito una maggiore riproducibilità delle procedure in qualsiasi laboratorio di PCR e ha permesso di raggiungere un’elevata economicità dell’analisi che è cruciale per l’identificazione pratica dei cloni su larga scala.
Siccome il numero sostanziale di loci SSR nucleari per i pioppi è stato trovato nella letteratura e nei database dei primer, abbiamo deciso di selezionare da diverse pubblicazioni e testare i primer che possono essere utilizzati per l’identificazione di routine del genotipo basato su attrezzature molto semplici senza l’uso di analizzatori di DNA. Un primo set di primer SSR per il loro potenziale utilizzo come elementi del sistema di test di identificazione molecolare in pioppo tremulo è stato il risultato della ricerca nei database bibliografici (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) e nel Molecular Ecology Resources Primer Database (http://tomato.bio.trinity.edu/).
L’amplificazione del DNA è stata eseguita utilizzando i kit PCRCore (Isogen Laboratories, Ltd., Mosca, Russia) in BioRad Inc. (USA) Dyad Thermo cycler. I loci microsatelliti (elencati nella tabella 2) delle serie ORPM e WPMS sono stati amplificati con primer specifici alla concentrazione di 1 mmol/mL e 5-10 ng di DNA target utilizzando il seguente profilo di temperatura: (1) denaturazione iniziale a 94°С per 3 minuti; 2) 30 cicli composti da 30 secondi di denaturazione a 94°С, ricottura del primer a temperatura e tempo variabili (vedi tabella 3 per la temperatura di ricottura finale raccomandata dopo la regolazione della procedura), e allungamento a 72°С per 1,5 minuti seguito da 3) allungamento finale a 72°С per 10 minuti e 4) raffreddamento della miscela PCR a 4°С.
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| Comments: 1Tuskan et al., 2004 ; 2Smulders et al., 2001 ; 3by literature data in different Populus species (P. tremula, P. x canescens, and P. alba). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 1P: polymorphic, M: monomorphic, and N: no PCR amplification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
I prodotti della PCR sono stati sottoposti a elettroforesi in blocchi di gel di poliacrilammide al 6% utilizzando il sistema tampone Tris-EDTA-borato. Dopo l’elettroforesi i gel sono stati colorati in soluzione di bromuro di etidio e visualizzati alla luce UV, le immagini grafiche sono state catturate e salvate utilizzando Doc-Print II Vilber Lourmat gel documentation system ed elaborate in editor grafici. La dimensione dei frammenti è stata stimata per mezzo di un software specializzato (Photo-Capt). Il DNA del plasmide pBR322 di E. coli, limitato dall’endonucleasi HpaII è stato usato come marker di peso molecolare.
2.4. Analisi statistica
L’identità dei cloni è stata determinata utilizzando l’analisi delle corrispondenze multilocus per i dati codominanti. La probabilità del genotipo (GP), che significa probabilità di comparsa di una particolare combinazione di multilocus nella popolazione, e la probabilità di identità, che stima la probabilità di corrispondenza casuale di due individui non imparentati (PI) o imparentati (PIsib) da un particolare insieme di loci, sono state calcolate sulla base della distribuzione delle frequenze alleliche nei campioni della popolazione.
La corrispondenza delle distribuzioni di genotipi osservate per ogni locus SSR con quelle previste secondo l’equilibrio di Hardy-Weinberg è stata testata con il criterio del chi-quadro. Il numero di alleli e le eterozigosità osservate e previste sono state calcolate per ogni campione nativo. Abbiamo impiegato la statistica F di Wright per valutare la suddivisione genetica tra i campioni della popolazione studiata. Tutti i calcoli di cui sopra sono stati eseguiti nell’add-in per MS Excel, GenAlEx 6.5.
3. Risultati e discussione
3.1. Sviluppo di sistemi di test basati su SSR per l’identificazione del genotipo in Aspen
Per i test iniziali, abbiamo selezionato 33 loci microsatelliti eterologici tri-, tetra-, penta- ed esanucleotidici da due serie; la serie ORPM è stata progettata per Populus trichocarpa e la serie WPMS per Populus nigra. Le caratteristiche di questi loci sono riportate nella tabella 2. I test iniziali sono stati fatti su campioni di DNA di tre cloni (47-1, PtV22 и С-control) da una collezione in vitro conservata e propagata nel ramo Pushchino dell’Istituto Shemyakin e Ovchinnikov di chimica bioorganica, Accademia Russa delle Scienze (Pushchino, Mosca Oblast, Russia). In questa fase, la loro variabilità è stata testata anche su 20-24 esemplari di pioppo selvatico provenienti da Novosibirsk Oblast (Siberia occidentale, Russia) e Krasnoyarsk Krai (Siberia centrale, Russia).
Come risultato della prima fase di test, 24 loci sono stati amplificati con successo e altri nove loci non hanno prodotto prodotti PCR. Dei 24 loci che hanno prodotto frammenti PCR, 20 loci si sono dimostrati variabili con un numero di alleli da due a nove, mentre quattro loci che sono stati amplificati con successo erano monomorfi (tabella 3). Dopo ulteriori test a regimi di PCR variabili, abbiamo infine selezionato 14 loci con amplificazione affidabile e livello di polimorfismo sostanziale da includere nel sistema di test per l’identificazione genetica molecolare. Esempi della variabilità dei loci microsatelliti selezionati in aspen sono mostrati nelle figure 2(a) e 2(b).
(a)(a)
(b)
(a)
(b)
I genotipi multilocus ottenuti di otto cloni d’élite e i genotipi di riferimento di alberi selvatici provenienti da popolazioni native sono elencati nella tabella S1 nel materiale supplementare disponibile online su http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. Abbiamo analizzato fino a 8 rametti campionati in diverse fasi della propagazione microclonale. All’interno dei cloni, i genotipi erano stabili e riprodotti senza ambiguità tra i rametti indipendentemente dalla fase di propagazione. Dopo l’esclusione dei rametti dello stesso genotipo, sia i cloni d’élite che i genotipi di aspen delle popolazioni native incluse nei campioni di riferimento erano diversi al 100%. La probabilità di comparsa dei genotipi (GP: genotype probability) tra i cloni d’élite variava da 2,4 – 10-21 a 1,7 – 10-11, tra gli alberi in un campione di riferimento da 4,0 – 10-24 a 5,8 – 10-9. La probabilità della coincidenza occasionale di due genotipi non correlati (PI: probabilità di identità) variava da 4,8 – 10-10 in Yoshkar-Ola a 4,3 – 10-13 in Prisady. Adattata alla probabilità teorica di discendenza degli individui confrontati dagli stessi antenati, la stima più conservativa (PIsibs) era compresa tra 1,0 – 10-4 a Yoshkar-Ola e 9,3 – 10-6 a Voronezh. Tutti i valori sono abbastanza bassi, in modo che la frequenza teorica di comparsa di genotipi ripetibili a causa della ricombinazione di diversi gameti nel corso della riproduzione dei semi non superava circa 1 combinazione allelica identica trovata accidentalmente su 10000 confronti. Il rapporto di PI e PIsibs dal numero di loci utilizzati è mostrato nella Figura 3 e dimostra una probabilità praticamente trascurabile di comparsa di genotipi identici quando si usano i primi 7-8 loci selezionati per l’inclusione nel sistema di test. L’utilizzo di tutti i 14 loci assicura un’ulteriore affidabilità e robustezza della procedura.
Lo sviluppo dei loci microsatelliti per le specie del genere Populus è iniziato alla fine del XX secolo insieme alle tecnologie dei marcatori genetici molecolari. Nel 1998, uno dei primi set di primer per l’amplificazione dei loci SSR dinucleotidici è stato progettato per il pioppo tremulo americano, Populus tremuloides. In questo lavoro è stata dimostrata una riuscita amplificazione incrociata degli stessi marcatori per diverse altre specie di pioppo, P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis, e P. maximowiczii. Gli autori hanno anche postulato l’ampio spettro di applicazioni dei loci SSR per diversi scopi tra cui l’identificazione dei cloni, l’analisi degli accoppiamenti controllati, la mappatura del genoma, la selezione assistita da marcatori, i saggi di diversità genetica e il supporto dei programmi di conservazione e gestione sostenibile delle risorse genetiche forestali. Studi successivi hanno fornito altri otto loci SSR dinucleotidici per Populus tremuloides. Da allora, i loci microsatelliti sono stati sviluppati per altre specie tra cui P. nigra. Alcuni di questi loci sono stati amplificati anche in P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans, e P. lasiocarpa. Per Populus euphratica sono stati progettati primer specifici per i loci SSR. In seguito, questo set è stato utilizzato per lo sviluppo di pannelli multiplex utilizzati per la stima della diversità genetica in questa specie.
Il sequenziamento di nuova generazione è stato il modo più efficiente per rilevare le ripetizioni tandem nel genoma del pioppo e progettare sulla loro base primer SSR trasferibili come è stato dimostrato nel caso del pioppo balsamico, Populus trichocarpa. Tali loci universali cross-amplificati sono utilizzati per l’identificazione di specie e ibridi e per la stima della differenziazione genetica tra specie congeneriche.
I microsatelliti sono anche utili per il controllo della diversità somaclonale all’interno di un pool di rametti ottenuti per propagazione microclonale da un singolo albero donatore, per l’identificazione di singoli cloni in un aspetto della loro tolleranza a fattori ambientali. Non abbiamo osservato alcuna variazione nei modelli SSR tra i rametti della stessa stirpe clonale d’élite. I microsatelliti nucleari insieme ad altre classi di marcatori molecolari sono impiegati anche per la determinazione del livello di ploidia nei pioppi, e indicazioni di triploidia sono state trovate da noi rispetto a diversi genotipi. Gli ibridi triploidi di pioppo dimostrano spesso un maggior vigore e resistenza ai patogeni, quindi questa questione dovrebbe essere ulteriormente studiata per mezzo di analisi cariografiche e di citometria fluttuante.
3.2. Analisi della struttura clonale nei popolamenti nativi di Aspen
Fin dal momento del campionamento in campo del materiale nei popolamenti selvatici abbiamo cercato di evitare l’inclusione di rametti clonali sorti come germogli che è comune per l’aspen. In tutti i popolamenti studiati è stato applicato lo stesso schema di campionamento mantenendo almeno 15-20 m tra gli alberi. Tuttavia, in tutte le popolazioni naturali studiate sono stati trovati rametti dello stesso clone che indicano la presenza comune di propagazioni vegetative (Tabella S1).
Prisady. Tra i 52 alberi studiati, abbiamo trovato 41 aplotipi diversi; un genotipo multilocus è stato trovato nove volte e uno è stato trovato tre volte. Abbiamo concluso che queste combinazioni multilocus ripetute sono il risultato del campionamento dei germogli che sono rametti dello stesso clone.
Voronezh. Tra 17 alberi raccolti nelle immediate vicinanze del sito della piantagione sperimentale non sono stati trovati individui clonali. Tredici alberi raccolti sulla riva del fiume Voronezh erano rappresentati da otto genotipi: quattro di loro erano in una replica, tre sono risultati essere due rametti dello stesso clone, e un genotipo è stato trovato in tre copie evidentemente originato da germinazione di progenitori sempre esistenti. In totale, abbiamo identificato 25 aplotipi diversi in questo campione di popolazione di riferimento.
Yoshkar-Ola. Trentadue alberi analizzati si sono combinati in 13 diversi aplotipi identificati dall’analisi delle corrispondenze multilocus; un genotipo è apparso due volte, un genotipo è apparso cinque volte, un genotipo è apparso sette volte e un genotipo è apparso nove volte. I genotipi ripetuti corrispondevano evidentemente ai rametti risultanti dalla germinazione.
Abbiamo concluso che la germinazione e l’alto livello di clonalità sono un fenomeno diffuso nei popolamenti di pioppo nativo. Nel pioppo tremulo, così come in molti altri pioppi, i cloni vegetativi sono in grado di occupare grandi aree. Pertanto, per la raccolta di un campione privo di genotipi clonali ripetuti le distanze tra gli alberi dovrebbero essere aumentate fino ad almeno 40-50 m. Tuttavia, una stima più precisa della diffusione massima di un singolo clone sul territorio del popolamento richiede anche un’esplorazione speciale.
Tra le altre applicazioni, i loci SSR nucleari sono stati utili per gli studi della struttura clonale e delle relazioni genetiche tra genotipi clonali in popolamenti nativi o tra popolamenti nativi e artificiali. Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.
3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).
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| s.e.: standard error. : sample size. : mean number of alleles. : effective number of alleles. : observed heterozygosity. : expected heterozygosity. : unbiased expected heterozygosity. : fixation index (intrapopulation coefficient of inbreeding). |
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The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.
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| s.e.: standard error. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . I livelli di diversità genetica intrapopolazione da noi osservati nei popolamenti nativi di pioppo erano all’interno della gamma di valori comunemente osservati nei pioppi e stimati dall’analisi dei loci SSR (e riferimenti ivi).
Un numero sostanziale di studi che impiegano la tecnica dei microsatelliti si sono concentrati sul rilevamento dell’ibridazione in popolamenti naturali o artificiali di pioppi. I loci SSR aiutano a rivelare i meccanismi di incrocio interspecifico e di isolamento riproduttivo. In questo studio ci siamo concentrati sulla variazione tra individui e tra popolazioni piuttosto che sulle differenze interspecifiche, ma per quanto riguarda alcuni dei cloni d’élite studiati la loro origine ibrida dovrebbe essere testata geneticamente utilizzando un insieme complesso di marcatori ma di localizzazione nucleare e citoplasmatica. L’identificazione ad alta fedeltà di ibridi interspecifici e cloni industriali è stata riportata in un numero considerevole di pubblicazioni. Una pubblicazione degna di nota riporta l’identità genetica di alcuni cloni industriali di pioppi precedentemente trattati come diversi.
Il compito pratico del monitoraggio dell’identità dei cloni commerciali nelle collezioni in vitro è stato simile a quello impiegato nella presente ricerca. In tutte le applicazioni in cui era richiesta un’identificazione individuale affidabile, gli SSR hanno mostrato un’elevata efficacia.
4. Conclusioni
L’applicazione dei loci microsatelliti nucleari per l’identificazione genetica e la valutazione della variabilità genetica nei cloni di aspen elite e nei popolamenti nativi ha mostrato un’elevata efficacia del sistema di analisi a basso costo basato sugli SSR sviluppato. L’autenticazione affidabile dei cloni assicura il monitoraggio genetico della propagazione microclonale e permette di rivelare la clonalità nei popolamenti nativi. Abbiamo dimostrato che lo stesso set di loci microsatelliti può essere impiegato con successo per la stima dei livelli di variabilità genetica intra- e interpopolazione nel pioppo tremulo. La ricostruzione della parentela tra i singoli cloni d’élite o le relazioni genetiche di popolazioni che si accoppiano naturalmente sono compiti prospettici che possono essere realizzati in futuro utilizzando gli stessi marcatori.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi riguardo alla pubblicazione di questo articolo.
Riconoscimenti
Questa ricerca è sostenuta dal Ministero dell’Istruzione e della Scienza della Federazione Russa (Progetto n. 14.607.21.0044 dal 22.08.2014; identificatore unico RFMEFI60714X0044). Gli autori ringraziano anche E. M. Romanov, A. I. Shurgin, R. V. Sergeev (Volga State University of Technology, Yoshkar-Ola, Repubblica di Mari El, Russia), M. V. Drapaluk, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikov, E. O. Kolesnikova (Voronezh State Forestry Engineering University, Voronezh, Russia), e G. B. Kolganikhina (Institute of Forest Science RAS, Uspenskoe, regione di Mosca, Russia), per il loro aiuto nella raccolta di campioni in stand nativi. Gli autori sono anche grati a M. Zeps, D. Auzenbaha, e A. Gailis (Latvian State Forest Research Institute “Silava,” Salaspils, Lettonia) per aver condiviso materiale biologico e informazioni sui cloni elitari di pioppo tremulo.