Gap Junctions in Cardiovascular Disease

Gap Junctions, strutture di membrana specializzate costituite da array di canali intercellulari, collegano cellule adiacenti in molti tessuti e organi, fornendo così la comunicazione chimica ed elettrica. Nel cuore, le gap junctions forniscono le vie per il flusso di corrente intercellulare, permettendo la propagazione coordinata del potenziale d’azione. Recentemente, numerosi rapporti sono stati pubblicati suggerendo che i cambiamenti nella distribuzione di gap junction, densità e proprietà possono essere coinvolti nella iniziazione e persistenza di varie aritmie cardiache. Nella presente revisione, riassumiamo i dati presentati in questi rapporti e discutiamo le implicazioni funzionali.

Struttura e proprietà dei canali di giunzione gap

Negli ultimi dieci anni, la struttura e le proprietà dei canali di giunzione gap sono state ampiamente documentate, come discusso in diverse recensioni recenti.1234

I canali di giunzione gap mammiferi sono costruiti da connexine codificate da una famiglia di geni strettamente correlati. Tutte le connexine sono costituite da 4 segmenti α-elici altamente conservati che attraversano la membrana, separati da 2 loop extracellulari e 1 intracellulare. I terminali amminico e carbossilico sono situati intracellularmente. Sono stati identificati quindici membri della famiglia delle connexin dei mammiferi. Essi differiscono principalmente nella sequenza dei loro loop intracellulari e dei terminali carbossilici. Tra i cardiomiociti, 3 connexine sono state rilevate a livello proteico: connexin40 (Cx40), connexin43 (Cx43), e connexin45 (Cx45) (denominati dalla loro massa molecolare putativa in kilodaltons).

Un canale gap junction è formato dall’aggancio testa a testa di 2 emicanali (connexons), ciascuno composto da 6 molecole di connexin disposte esagonalmente attorno a un poro acquoso. Poiché il docking è mediato da loop extracellulari relativamente conservati, molti connexon composti da un tipo di connexin possono combinarsi con connexon composti da altre connexin per formare canali eterotipici di gap junction. Un connexon può anche essere composto da diverse connexine5 (connexon eteromerico). Nel cuore, diverse connexine colocalizzano nelle placche di gap junction, ma non si sa se i canali di gap junction eterotipici e/o eteromerici esistono nel sistema cardiovascolare.

I canali di gap junction sono permeabili a sostanze con un peso molecolare di <≈1 kDa. La permeabilità dipende dal tipo di connexin e dalla carica della molecola permeante. I canali di giunzione gap si comportano come canali ionici gated. Nei cardiomiociti, le conduttanze dei singoli canali vanno da 20 pS per i canali omotipici Cx45 a 75 pS per i canali Cx43 e a 200 pS per i canali Cx40. La conduttanza della giunzione di gap è modulata dalla tensione transgiuntiva, da i6 e i, dallo stato di fosforilazione delle connexine e dalla composizione extracellulare degli acidi grassi.

Anche l’espressione delle connexine è modulata. Gli ormoni possono upregolare o downregolare il contenuto delle connexine. Nelle cellule cardiache neonatali di ratto in vitro, il cAMP può aumentare notevolmente l’espressione di Cx43 con un aumento concomitante della velocità di conduzione del potenziale d’azione. Il turnover delle connexine è notevolmente veloce. Nel cuore di ratto adulto, per esempio, l’emivita è di 1,3 ore.7

Distribuzione delle giunzioni nel miocardio normale

Nel miocardio, le connexine sono espresse a livello regionale: Cx43 si trova in tutto il cuore, con la possibile eccezione dei tessuti nodali e di parti del sistema di conduzione.4 Nei mammiferi, Cx40 è espressa nel tessuto atriale (ad eccezione del cuore di ratto) e nel sistema di conduzione prossimale (ad eccezione del cuore di cavia).89 L’espressione di Cx45 sembra essere limitata ai tessuti nodali e al sistema di conduzione,1011 ma alcuni rapporti1213 affermano una distribuzione molto più diffusa, probabilmente a causa dell’uso di un anticorpo anti-Cx45 non completamente specifico.14 Non sono state rilevate altre connexine tra i cardiomiociti fino ad oggi.

Nei ventricoli adulti, le gap junctions contengono esclusivamente Cx438 e si trovano prevalentemente nella regione del disco intercalato (ID) tra le cellule. Le proprietà conduttive anisotrope del miocardio ventricolare dipendono dalla geometria delle cellule interconnesse e dal numero, dalle dimensioni e dalla posizione delle placche di gap junction tra di esse.15 Molti studi (immuno)-istochimici ed al microscopio (elettronico) hanno affrontato questi problemi. Le placche della giunzione di gap consistono in matrici di particelle più o meno strettamente imballate da 9 a 10-nm, che rappresentano i singoli canali. In condizioni normali, le placche di gap junction di ratto sembrano contenere ≈15% di spazio senza particelle,16 mentre le particelle delle placche di gap junction di coniglio sono contigue.17 In termini di conduttanza di giunzione, c’è poca differenza, perché il minor numero di canali per micrometro quadrato è ampiamente compensato dalla diminuzione della resistenza di accesso18 (vedi sotto). L’area media della placca di gap junction varia da 0,21 μm2 nel ventricolo umano19 a ≈0,45 μm2 nel ventricolo di ratto2021 e a ≈4 μm2 nel ventricolo canino.22 In quest’ultimo caso, quest’area era ≈1,5 μm2 per circa metà delle placche e ≈6,6 μm2 per l’altra metà. Dalla valutazione (elettronica)microscopica212223 e (immuno)istochimica,1921242526 sembra che le placche di gap junction più grandi si trovino nelle regioni interplicate dell’ID (cioè, nelle regioni che corrono più o meno parallele all’asse lungo delle cellule) e che quelle più piccole si trovino nelle regioni plicate. Hoyt et al22 hanno stimato che l’80% dell’area totale della gap junction per cellula si trova nelle regioni interplicate, dove le gap junctions possono servire sia alla conduzione longitudinale che trasversale.

I miociti ventricolari sono collegati da ID a ≈10 cellule vicine.2226 La velocità di conduzione è determinata dall’area della placca della gap junction in ciascuno di questi ID. L’area totale della placca di gap junction per ID va da 47 a 94 μm2 nei ratti,27 42 o 13,6 μm2 nei cani,2223 e ≈10 μm2 negli esseri umani.26

Nell’atrio, le placche di gap junction contengono sia Cx43 che Cx40.913 Il più delle volte, Cx43 e Cx40 sono localizzate nelle stesse placche, senza una localizzazione preferenziale di una delle due connexine nei bordi cellulari laterali o nelle placche ID.9 Non sono disponibili dati per calcolare l’area delle placche di gap junction per ID nell’atrio.

Nel miocardio ventricolare, l’espressione di Cx40 è limitata al sistema di conduzione.8 Nella maggior parte delle specie di mammiferi, Cx43 non è presente nella parte prossimale (fascio di His, rami del fascio), mentre nelle regioni più distali dei rami del fascio e delle fibre di Purkinje, Cx40 e Cx43 sono coespressi.28 Negli ovociti di Xenopus, Cx43 e Cx40 non possono formare canali di giunzione di gap eterotipici funzionali,29 ed è stato suggerito che la distribuzione di connexin nel sistema di conduzione prossimale serva a propagare rapidamente il potenziale d’azione alle parti distali senza perdita di corrente attraverso le giunzioni di gap ai miociti settali circostanti. Tuttavia, nelle cellule dei mammiferi, l’incompatibilità dei connexon Cx40 e Cx43 sembra meno chiara.30 Nei cuori di topo, Cx45 è espresso in tutto il nodo atrioventricolare, il fascio di His e i rami del fascio.10 L’espressione di Cx40 è limitata al nucleo del fascio di His e dei rami del fascio.10

Distribuzione delle giunzioni di gap nel miocardio malato

In quasi tutte le malattie cardiache che predispongono alle aritmie, sono stati riportati cambiamenti nella distribuzione e nel numero delle giunzioni di gap (rimodellamento delle giunzioni di gap). Nella malattia ischemica avanzata, una stretta zona costituita da ≈5 strati di cellule che confinano con infarti miocardici guarito è stato rilevato.24 In questa zona, la normale distribuzione delle giunzioni gap in end-to-end-located IDs è stato interrotto con uno spostamento di Cx43 contenenti macchie ai bordi laterali delle cellule senza cambiamenti nelle dimensioni spot. Normale, ischemico, e ipertrofizzato ventricoli sinistri umani hanno mostrato placche di uguale dimensione di anti-Cx43 colorazione, ma la quantità totale di Cx43 è stato ridotto del 40% nei cuori malati.26 Il numero di ID per cella non era diverso nei cuori normali e malati, il che implica che la geometria cellulare non era drammaticamente cambiato. D’altra parte, nel ventricolo umano reversibilmente ischemico e ibernante, una riduzione delle dimensioni della placca Cx43 del 23% e 33%, rispettivamente, è stato osservato nelle regioni colpite,19 con nessun cambiamento nel miocardio normale. In questi esperimenti, è stato osservato uno spostamento delle macchie Cx43 da una posizione end-to-end a una posizione laterale; questo spostamento è stato riportato anche nella cardiomiopatia ipertrofica.25

In un modello di cavia di insufficienza cardiaca congestizia, una riduzione complessiva di Cx43 del 37% è stata osservata allo stadio di insufficienza cardiaca congestizia dopo 6 mesi di bendaggio aortico, mentre allo stadio di ipertrofia compensata, non sono stati visti cambiamenti.31 Recentemente, è stata riportata una diminuzione del 35% dell’area di gap junction per ID32 dopo 4 settimane di ipertrofia ventricolare destra causata da ipertensione polmonare indotta da monocrotalina nel ratto, in concomitanza con una diminuzione del 30% della velocità di conduzione longitudinale (ΘL). Allo stesso tempo, numerose macchie Cx43-positive sono apparse lungo i bordi laterali delle cellule. La velocità di conduzione in direzione trasversale (ΘT) e il contenuto totale di Cx43, come giudicato dall’immunoblotting, non erano interessati. Gli autori hanno concluso che la ridistribuzione delle placche di gap junction può spiegare il ridotto rapporto di anisotropia (ΘL/ΘT). Tuttavia, l’aumento del 55% osservato nel diametro delle cellule può anche giocare un ruolo. Peters et al33 dimostrato una stretta correlazione tra l’inducibilità della figura di-8 aritmie rientranti nel tessuto epicardico confinante 4 giorni-vecchio infarti in ventricoli canini e la rottura della distribuzione gap junction. Soprattutto le cellule vitali vicine e talvolta interdigitanti con le cellule necrotiche della regione infartuata hanno mostrato un’estesa etichettatura di Cx43 sui bordi laterali delle cellule.

Sembra che la lateralizzazione delle gap junction sia una caratteristica importante del miocardio malato. Non è completamente chiaro, tuttavia, fino a che punto questa lateralizzazione può contribuire a proprietà di conduzione alterate, perché è stato recentemente dimostrato34 che nelle cellule ventricolari di ratto che confinano con infarti guariti, molte delle placche di gap junction laterali si trovano in invaginazioni del sarcolemma all’interno delle cellule, non contribuendo così alla comunicazione cellula-cellula. Un’osservazione simile è stata fatta nell’ipertrofia ventricolare destra.32

Anche se i dati quantitativi sono scarsi, un altro dato comune nel miocardio malato è una riduzione dal 30% al 40% dell’area della gap junction per ID. Nei ventricoli (post)ischemici, questa riduzione è limitata a pochi strati cellulari intorno alla zona interessata, mentre nei ventricoli ipertrofici, la riduzione è più diffusa. Da questa osservazione da sola o insieme ad una maggiore densità di placche di giunzione gap laterale, si potrebbe prevedere un rapporto ridotto anisotropia. In uno studio,23 un aumento del rapporto di anisotropia è stato suggerito per verificarsi nelle zone di confine infartuale. Questo aumento è stato in parte dovuto ad una riduzione della densità laterale (interplesso) gap junction e in parte ad una diminuzione del numero di cellule che hanno connessioni side-to-side con le cellule vicine.

Cambiamenti nella densità e distribuzione gap junction nel tessuto atriale malato sono meno ben documentati. In atri di cane rapidamente stimolati, è stato riportato un aumento dei punti Cx43-positivi,35 soprattutto ai bordi laterali delle cellule. Nell’atrio di capra, nessun cambiamento apparente nella densità Cx43 e la distribuzione dopo 16 settimane di fibrillazione atriale sostenuta (AF) sono stati trovati,3637 anche se alcuni dephosphorylation si era verificato. Cx40 proteina era assente in 0.15- a 0.6-mm patch di tessuto atriale dopo 16 settimane di AF senza una riduzione di Cx40 mRNA. La riduzione patchy della proteina Cx40 era evidente dopo 2 settimane di AF, circa lo stesso tempo che AF è diventato sostenuto. Se questa riduzione di Cx40 è causalmente correlata alla persistenza della FA rimane da determinare.

I dati sul coinvolgimento del rimodellamento della gap junction nelle aritmie che hanno origine nel sistema di conduzione o nel tessuto nodale stanno appena iniziando ad essere riportati.383940

Gap Junctions e velocità di conduzione

Gj efficace

Abbiamo effettuato alcune semplici simulazioni al computer per verificare gli effetti dei cambiamenti nella densità e nella distribuzione delle gap junctions sulla velocità di conduzione del potenziale d’azione. In primo luogo, abbiamo determinato la conduttanza effettiva delle gap junctional (gj, corretta per gli effetti del campo elettrico causati dalla resistenza di accesso citoplasmatica) utilizzando il nostro modello precedentemente pubblicato18 e assumendo che la conduttanza del singolo canale Cx43 sia 75 pS a 37°C41 e che tutti i canali siano nel loro stato di conduzione (ma vedi riferimento 42). Figura 1A mostra che gli effetti della resistenza di accesso citoplasmatico sono già evidenti per giunzioni gap relativamente piccolo e diventano più importanti con l’aumento delle dimensioni della giunzione gap. Per giunzioni gap > 0.5 μm2, la conduttanza effettiva è <50% del valore ottenuto semplicemente sommando le conduttanze individuali di tutti i canali in una data area (conduttanza non corretta), e per le gap junctions >4 μm2, la conduttanza effettiva è addirittura <20%. Di conseguenza, gj per unità di superficie non è costante, ma diminuisce con l’aumentare della dimensione della giunzione gap (Figura 1B). La conduttanza effettiva è da 0,3 a 0,5 μS/μm2 per giunzioni di gap di piccole e moderate dimensioni (da 0,3 a 1,5 μm2) e <0,2 μS/μm2 per giunzioni di gap di grandi dimensioni (>5 μm2). Come discusso in precedenza, la superficie delle giunzioni di gap varia comunemente tra 10 e 40 μm2 per ID. Se si utilizza una conduttanza media effettiva di 0,3 μS/μm2, il gj effettivo per ID tra cellule vicine è da 3 a 12 μS.

Velocità di conduzione

In seguito, abbiamo valutato l’importanza del gj per la velocità di conduzione. Abbiamo stimolato la cellula più a sinistra in un filone lineare di 50 cellule ad una frequenza di 1 Hz e calcolato la velocità di conduzione attraverso il terzo medio del filone. Le cellule sono state disposte fine a fine o fianco a fianco, e le cellule vicine sono state collegate attraverso una costante (efficace) gj (Figura 2A). Abbiamo usato il modello umano cella ventricolare di Priebe e Beuckelmann43 in una rappresentazione numerica dell’equazione cavo simile a quello esplorato da Shaw e Rudy,44 con un valore di 150 Ω cm per resistività citoplasmatica.45

Per ottenere valori ΘL di ≈70 cm / s come riportato per ventricoli umani,46 una conduttanza di 7,0 μS è necessario (Figura 2B). Questo è d’accordo con il valore di cui sopra di 3 a 12 μS stimato dai dati morfometrici. La stessa conduttanza di 7.0 μS risultati in ΘT di 30 cm / s. In condizioni normali, ΘL è abbastanza insensibile ai cambiamenti di gj: diminuisce solo di 9 cm/s (13%) dopo aver dimezzato la conduttanza. ΘT è più sensibile ai cambiamenti di gj: diminuisce del 36% dimezzando la conduttanza. La relativa insensibilità di ΘL ai cambiamenti di gj può essere spiegata in termini di resistività della giunzione di gap, che abbiamo calcolato da gj e dalle dimensioni delle cellule (Figura 2C). Per la conduzione longitudinale (linea solida con i cerchi pieni in Figura 2C), la resistività della giunzione a fessura cade sotto la resistività citoplasmatica di 150 Ω cm (linea tratteggiata orizzontale) a valori di gj piccoli come 2.5 μS, mentre per la conduzione trasversale, la resistività della giunzione a fessura è molto più grande della resistività citoplasmatica a tutti i valori di gj (linea tratteggiata con quadrati aperti). Così, concludiamo che la velocità di conduzione, in particolare ΘL, è solo moderatamente sensibile ai cambiamenti di gj effettivo. Inoltre, le dimensioni delle cellule (rapporto tra lunghezza e larghezza delle cellule) possono giocare un ruolo importante nel determinare la velocità di conduzione (anisotropia). Questo è coerente con la conclusione di Spach et al47 che la dimensione delle cellule può essere più importante della distribuzione delle gap junction.

Implicazioni funzionali

I risultati della simulazione costituiscono importanti caveat per l’interpretazione dei dati quantitativi da studi (immuno)istochimici o (elettroni)microscopici. Una riduzione del contenuto totale di gap junction fino al 40% senza cambiamenti nella dimensione delle placche di gap junction, come osservato nei cuori umani malati,26 può avere di per sé solo effetti moderati sulla velocità di conduzione. Se gj normale tra le cellule è 5 μS, una riduzione del 40% a 3 μS risultati in una diminuzione del 11% in ΘL da 65 a 58 cm / s e una diminuzione del 27% in ΘT da 24 a 18 cm / s (Figura 2B). Il rapporto di anisotropia associato aumenta del 22% da 2,7 a 3,3. In altri casi, il contenuto complessivo di gap junction è rimasto invariato, ma si è verificato uno spostamento verso i bordi laterali delle cellule.2532 Uno spostamento del 40% ridurrebbe ΘL dell’11% e aumenterebbe ΘT del 25%, con una conseguente diminuzione del 29% del rapporto di anisotropia. Se le nuove giunzioni di gap laterali sono situate intracellularmente,3234 ΘT potrebbe non cambiare affatto.

Osservazioni conclusive

In molti studi che coinvolgono il rimodellamento delle giunzioni di gap nel tessuto ventricolare malato, gli autori hanno concluso che una diminuzione della velocità di conduzione può aumentare la propensione alle aritmie rientranti. Tuttavia, la presente analisi dei limitati dati disponibili indica che la riduzione della velocità di conduzione o i cambiamenti nel rapporto di anisotropia possono essere effettivamente moderati. Certamente, i cambiamenti osservati non porterebbero il substrato nel regno della conduzione lenta come affrontato in diversi recenti studi sperimentali484950 e teorici4451. La nostra analisi indica che la resistività citoplasmatica e la geometria cellulare sono molto più importanti di quanto comunemente realizzato, una conclusione sostenuta anche da Spach e colleghi.15475253

Non abbiamo incorporato nella nostra analisi i cambiamenti indotti dalla malattia nelle proprietà dei canali ionici e di gap junction della membrana. Indubbiamente, tali cambiamenti fisiopatologici complicano ulteriormente la comprensione di aritmogenesi in ischemia acuta, infarto miocardico cronico, ipertrofia e insufficienza cardiaca.

Note