Abstract
ミクロプロパゲーションのアスペンの遺伝子型を識別するテストシステムは、SSR遺伝子に基づいて開発したもので、アスペンのエリート遺伝子型を識別する。 試験した33のマイクロサテライト遺伝子座のうち、PCR増幅が持続可能で、速植林を目的としたアスペンのエリートクローンに大きな変異があることから、14の遺伝子座が選択された。 8 つのクローンはすべて異なる多座標遺伝子型を有していた。 また、植林地の近くにある3つの参考林から採取した114本の木から80のハプロタイプを同定したが、いくつかの繰り返し遺伝子型は、萌芽の結果現れた自然クローンに起因するものであった。 SSRマーカーは、同一のアスペン遺伝子型が出現する確率が低く、信頼性の高い個体識別を示した（非関連個体と関連個体で、それぞれ最小値と1×10-4であった）。 また、エリートクローンの植林が行われた地域に生育する3つの天然アスペンのクローン構造や遺伝的多様性のレベルの分析など、本試験システムの実用化を示すケーススタディが紹介されている
1. はじめに
乱開発により世界中で原生林の劣化が続いているため、経済効果だけでなく木本植物遺伝資源の保全にも有利な集約的林業の導入が必要である。 本課題では、高速回転植林を目指した林木のエリート遺伝子型の取得と維持を宣言している。 育種、突然変異の選択、遺伝子操作の結果、生産性が高く、生物的要因や害虫・病原菌に対して持続可能な新しい品種やカルチャーの出現があります。 このような優れた個体をクローン増殖することで、有用形質を固定化し、育種実験や目標とする森林プランテーションの確立に役立てることができます。 特に、インビトロ培養によるマイクロクローナル増殖は、特に従来の出芽または接ぎ木が不可能であるか、または特別な努力を要する場合に、所望の形質を有する個体の迅速、大規模、および費用効果の高いクローニングを可能にする。
形態学的および解剖学的に異なる植物クローンは、類似して見えることがあるので、互いに、および共種の個人または他の近縁種の代表から識別を含むそれらの確実な識別が不可欠である。 林業では、樹木の外観が環境条件に大きく依存するため、個体識別の問題は特に重要である。 林木の自然発生の特定の段階、例えば実生や苗木、また特に体外細胞培養におけるカルスや摘出物では、個体だけでなく種の診断に関しても見分けがつかないことがある。 長い世代交代期間と体細胞学的に遅い成熟が、木本植物におけるエリートクローンの遺伝的移植の作業を現実的なものにしている。
分子遺伝マーカー（MGM）は個体識別のための非常に有効なツールであることが証明された。 マイクロサテライトやSSRは、その特異性、共優性、選択的中立性、十分な対立遺伝子の豊富さ、高い突然変異率によるヘテロ接合性から、異なるMGMクラスの中でも同定のための検査システムの要件に最も適合している。 さらに、植物の属や科の中でも比較的ゲノムの保存性が高いため、SSRマーカーやその増幅用PCRプライマーは、分類群間で移植可能である。
ポプラのいくつかの種では、SSR遺伝子座を含む分子マーカーによって、DNAフィンガープリントとクローン、栽培種、品種の区別に成功したことが実証された。
この論文では、アスペン（Populus tremula L. ）のマイクロプロパゲーションのエリート遺伝子型の分子遺伝的同定のためのSSRベースの検査システムの開発について報告した。
本論文では、ロシア連邦のいくつかの地域において、成長の早い目標森林プランテーションの確立を目的としたアスペンの微小繁殖エリート遺伝子型を識別するためのSSRベースの検査システムの開発について報告し、個々の遺伝子型の識別、自然のアスペンのスタンドにおけるクローン構造の研究、集団における遺伝的変動の推定に適用した結果を示すものである。 材料と方法
エリート遺伝子型の識別のためのテストシステムの開発は、クローンの高解像度識別の要件に適合する特定のマーカーセットの選択と、エリート遺伝子型のセットと研究種の十分な数の代表でその信頼性と識別力をテストすることで構成されています
2.1. 植物材料
分子識別のための試験システムの開発に使用されるエリートアスペンとハイブリッドクローンは、ロシア科学アカデミー、生物有機化学のシェムヤキンとオヴチニコフ研究所（プシュチノ、ロシア）のプシュチノ支店で維持されるマイクロプロパゲート細胞培養から得られている。 Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.
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Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.
Prisadyです。 モスクワ州のSerpukhovsky Raion（地区）の集落Prisadyの西方1kmにある実験プロット（ロシア）。 このプロットに近接（1km）した自然の多年生林から、52本の若いまたは中年（約10～25歳）のアスペンの木の葉が参照集団として使用されました。 Voronezh Oblastに設置された実験プロットに隣接するスタンドで17本の木がサンプリングされた。 さらに13本の木が、植林地に近いヴォロネジ市内のヴォロネジ川岸で採取された。
Yoshkar-Ola. マリエル共和国、ヨシュカル・オラ市の近くにある実験プロットでは、アスペンの若い原生林が基準集団として使用された木々の源です。
植物由来（萌芽）の個体のサンプリングを最小限にするため、互いに15-20 m以上離れた樹木から葉を採取した。 この方法は、遺伝的多様性が最も高い開放受粉の苗木を参照試料に含めるために採用された。 しかし、樹木の外観と樹木間の距離のみから、萌芽の結果として現れるラメットのサンプリングは避けることができず、その後の遺伝子解析で確認された。
葉の付いた枝は、アルミニウム製の伸縮マストを備えた機械式カッターで切断された。 収集した葉付きシュートはビニール袋に入れ、処理まで+4°Cで6日以内保管した。 サンプル調製には、DNA抽出と予備葉の組織片を長期保存のためにシリカゲルを入れたラベル付きジッパーバッグに入れることが含まれる。 植生が活発な時期以外では、休眠中の植物の芽をDNA抽出にうまく利用することができる。 DNA抽出
ペトリ皿に入れた特殊培地（REF）上で試験管内生育した摘出子から採取した約350～500mgの葉片をDNA抽出に用いた。
自生集団の木については、修正臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）法により新鮮葉組織350～500mgまたはシリカドライ200～300mgからDNA抽出を行なった。 マイクロサテライト分析
マイクロサテライト（SSR）は、短い（1-6対のヌクレオチド、bp）モチーフのタンデム反復DNA配列のクラスを示しており、高い突然変異率のために個体間でコピー数が異なっている。 マイクロサテライトは、通常、共優性遺伝子座に見られる複数の対立遺伝子の組み合わせにより、非常に多様でユニークな遺伝子型を作り出すため、特に十分な数の遺伝子座を使用した場合は、確実に同定することができます。 SSR多型の解析は、技術的にはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とその後の電気泳動（ゲルまたはキャピラリー）だけで断片解析が可能であり、また、SSR多型の解析は、技術的には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とその後の電気泳動（ゲルまたはキャピラリー）だけで可能である。 検査システムの開発にあたっては、基本的な機器と簡単な試薬のみを使用する方法のバリエーションを選択しました。
ポプラの核SSR遺伝子座は文献やプライマーデータベースでかなりの数が見つかっているため、いくつかの文献から、DNA分析器を使わずに非常に簡単な装置で日常的に遺伝子型を特定するのに使用できるプライマーを選び、テストすることにした。 アスペンにおける分子識別の試験システムの要素として使用できるSSRプライマーの初期セットは、文献データベース（Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/ ）とMolecular Ecology Resources Primer Database（http://tomato.bio.trinity.edu/ ）での検索の結果得られたものである。 Moscow, Russia）を用い、BioRad Inc. (USA) Dyad Thermo cyclerで行った。 シリーズORPMおよびWPMSからのマイクロサテライト遺伝子座（表2に記載）は、以下の温度プロファイルを用いて、1 mmol/mLの濃度と5〜10 ngの標的DNAで特異的プライマーを用いて増幅された。 (1) 94°Cで3分間の初期変性；(2) 94°Cでの30秒間の変性、可変温度と時間でのプライマーアニーリング（手順調整後の推奨最終アニーリング温度は表3を参照）、72°Cでの1.5分間の伸長からなる30サイクル、(3) 72°Cでの10分間の最終伸長；(4) PCR混合物を4°Cに冷却した後、4サイクル。
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| Comments: 1Tuskan et al., 2004 ; 2Smulders et al., 2001 ; 3by literature data in different Populus species (P. tremula, P. x canescens, and P. alba). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 1P: polymorphic, M: monomorphic, and N: no PCR amplification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PCR産物はトリス-エチルタービン酸緩衝系を用いて6％ポリアクリルアミドゲルブロック中で電気泳動した． 電気泳動ゲルを臭化エチジウム溶液で染色し、紫外線で可視化した後、グラフィック画像をDoc-Print II Vilber Lourmatゲル記録システムで撮影・保存し、グラフィックエディターで処理した。 フラグメントサイズは専用ソフトウェア(Photo-Capt)を用いて推定した。 エンドヌクレアーゼHpaIIによって制限された大腸菌プラスミドpBR322のDNAは、分子量マーカーとして使用された。 統計解析
クローン同一性は、共優性データに対してマルチローカスマッチ解析を用いて決定した。
各SSR座で観測された遺伝子型分布とハーディーワインバーグ平衡による期待値との対応関係をカイ二乗基準で検定した。 また、各原産地サンプルについて、対立遺伝子数、観察されたヘテロ接合度と期待されるヘテロ接合度を算出した。 研究対象集団のサンプル間の遺伝的細分化を評価するためにライトのF統計量を用いた。 上記の計算はすべてMS ExcelのアドインであるGenAlEx 6.5で行った。
3. 結果と考察
3.1. アスペンにおける遺伝子型同定のためのSSRベースのテストシステムの開発
最初のテストのために、我々は2つのセットから33の異種トライ、テトラ、ペンタ、およびヘキサヌクレオチドのマイクロサテライト座を選んだ；シリーズORPMは最初にポプシストリコカルパ用に、シリーズWPMSはポプラスニグラ用に設計されていた。 これらの遺伝子座の特徴を表2に示す。 最初のテストは、ロシア科学アカデミー、生物有機化学のShemyakin and Ovchinnikov Institute of Pushchino branch (Pushchino, Moscow Oblast, Russia) で保存・増殖されたin vitroコレクションから3つのクローン（47-1、PtV22 и С-control) のDNAサンプルで行われた。 この段階で、ノボシビルスク州（ロシア、西シベリア）とクラスノヤルスク州（ロシア、中シベリア）の野生アスペンの20～24の標本でそれらの変動性も試験した。
第一段階の試験の結果、24座が正常に増幅され、他の9座はPCR産物を生成することができなかった。 PCR断片を生成した24座位のうち、20座位は2〜9の対立遺伝子数を持つ可変性を示し、増幅に成功した4座位は単形性であった（表3）。 可変PCRレジームでの追加試験の後、我々は最終的に、信頼できる増幅と実質的な多型レベルを持つ14の遺伝子座を選択し、分子遺伝学的同定のための試験システムに組み込んだ。 図2(a)と(b)にアスペンにおけるマイクロサテライト遺伝子座の変異の例を示す。
(a)
(b)
(a)
(b)
得られた8つのエリートクローンの多座遺伝子型と自生地の野生木の参照遺伝子型はhttp://dx.doi.org/10.1155/2015/261518 でオンライン利用できる補足資料の表S1中にリストされています。 マイクロクローン増殖の異なる段階で採取された最大8つのラメットを分析した。 クローン内では、増殖の段階とは無関係に、ラメット間で遺伝子型が安定的に、かつ明確に再現された。 同じ遺伝子を持つラメットを除外した結果、エリートクローンと基準サンプルに含まれる在来個体群のアスペンの遺伝子型はともに100%異なっていた。 遺伝子型の出現確率（GP：genotype probability）は、エリートクローンでは2.4 – 10-21 – 1.7 – 10-11、参考標本樹では4.0 – 10-24 – 5.8 – 10-9と変化した。 2つの無関係な遺伝子型が偶然に一致する確率（PI: probability of identity）は、Yoshkar-Olaの4.8 – 10-10からPrisadyの4.3 – 10-13まで変動した。 比較した個体が同じ祖先から子孫を残す確率を理論的に調整すると、より保守的な推定値（PIsibs）はYoshkar-Olaで1.0 – 10-4、Voronezhで9.3 – 10-6の範囲に収まることが示された。 いずれの値も非常に低く、種子繁殖の過程で異なる配偶子の組換えによって再現性のある遺伝子型が出現する理論上の頻度は、1万回の比較のうち偶然に見つかった同一対立遺伝子の組み合わせが約1個を超えないことがわかった。 図3は、使用する遺伝子座の数によるPIとPIibsの関係を示したもので、試験系に含めるために選択した最初の7〜8個の遺伝子座を使用している間は、同一遺伝子型の出現確率が実質的に無視できることを示している。
ポプラ属の種に対するマイクロサテライト座の開発は、分子遺伝マーカーの技術とともに20世紀末に始まった。 1998年には，アメリカのポプラ（Populus tremuloides）のために，ジヌクレオチドSSR遺伝子座を増幅するための最初のプライマーセットの一つが設計された。 この論文では、P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis, P. maximowicziiといった他のポプラ種についても、同じマーカーを交差増幅することに成功したことが示されています。 また、クローン同定、コントロールドマッティングの解析、ゲノムマッピング、マーカーアシスト選抜、遺伝的多様性検定、森林遺伝資源の保全と持続的管理のためのプログラム支援など、SSR遺伝子座の幅広い用途を想定している。 その後の研究により、Populus tremuloidesの他の8つのジヌクレオチドSSR遺伝子座が提供された。 それ以来、Populus nigraを含む他の種についても、マイクロサテライト遺伝子座が開発された。 これらの遺伝子座のいくつかは，P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans, P. lasiocarpa でも増幅された。 Populus euphratica に特異的な SSR 遺伝子座プライマーが設計された。
次世代シーケンサーは、ポプラのゲノムからタンデムリピートを検出し、その塩基に転写可能なSSRプライマーを設計する最も効率的な方法であることが、バルサミコポプラのケースで実証された。
マイクロサテライトは、単一のドナー樹からマイクロクローナル増殖によって得られたラメットプール内の体細胞多様性の確認、環境要因への耐性の側面から個々のクローンの識別にも有用である。 また、同じエリートクローン系統のラメット間では、SSRパターンの変動は観察されなかった。 ポプラの倍数体判定には、核マイクロサテライトや他の分子マーカーが用いられ、いくつかの遺伝子型では3倍体であることが示唆された。 アスペンの3倍体雑種はしばしば樹勢や病原体に対する抵抗力を高めるので、核酸学やフローティングサイトメトリー分析によって、この問題をさらに研究する必要がある。 アスペンの自生地におけるクローン構造の分析
自生地における材料のフィールドサンプリングの瞬間から、アスペンによくある新芽として発生したクローン性ラメットを含めないようにした。 また、すべての調査対象林において、少なくとも15-20 mの木々の間隔を保ちながら、同じサンプリングスキームを適用した。 それでも、植生伝播の共通性を示す同一クローンのラメットが、調査したすべての自然集団で見つかった（表S1）。 調査した52本のうち、41種類のハプロタイプが見つかり、1つの多座遺伝子型が9回、1つの多座遺伝子型が3回見つかった。 これらの繰り返される多座標の組み合わせは、サンプリングした新芽が同じクローンのラメットであることに起因すると結論付けた。
ボロネジ。 実験農園の敷地に近い場所で採取した17本のうち、クローン個体は発見されなかった。 ヴォロネジ川岸で採取された13本の木には8つの遺伝子型があった。そのうち4つは1つの複製で、3つは同じクローンの2つのrametであり、1つの遺伝子型は明らかに既存の前駆体の発芽に由来する3複製で発見された。
Yoshkar-Ola（ヨシュカル・オラ）：この参照集団のサンプルでは、合計で25種類のハプロタイプが確認された。 32本の樹木を解析した結果，1つの遺伝子型が2回，1つの遺伝子型が5回，1つの遺伝子型が7回，1つの遺伝子型が9回出現し，13種類のハプロタイプが確認された。
アスペンの自生地では萌芽と高いクローナリティが広く見られると結論づけた。 アスペンでは，他の多くのポプラと同様に，植生クローンが広い面積を占めることができる。
特に核SSR遺伝子座は、自生林や自生林と人工林の間のクローン構造やクローン遺伝子型間の遺伝的関係の研究に有効であった。 Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.
3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).
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| s.e.: standard error. : sample size. : mean number of alleles. : effective number of alleles. : observed heterozygosity. : expected heterozygosity. : unbiased expected heterozygosity. : fixation index (intrapopulation coefficient of inbreeding). |
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The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.
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| s.e.: standard error. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species .
マイクロサテライトを用いた研究の多くは、ポプラの自然林や人工林における交雑を検出することに主眼が置かれている。 SSR遺伝子は，種間交雑や生殖的隔離のメカニズムを明らかにするのに役立つ。 本研究では、種間差よりも個体間および個体群間の変異に焦点を当てたが、いくつかのエリートクローンについては、核および細胞質局在の複雑なマーカーセットを用いて、その雑種起源を遺伝学的に検証する必要があると思われる。 種間雑種や産業用クローンの高忠実度同定は、かなりの数の出版物で報告されている。
試験管内コレクションにおける商業クローンの同一性監視という実際的な課題は、本研究で採用したものと同様であった。
4.結論
アスペンのエリートクローンと自生地の遺伝的変異の識別と評価のための核マイクロサテライト遺伝子座の応用は、開発した低コストなSSRベースの検査システムの高い有効性を示した。 クローンの信頼性の高い認証は，マイクロクローナル増殖の遺伝的監視を保証し，自生地のクローナリティを明らかにすることを可能にした。 また、アスペンの集団内・集団間の遺伝的変異の推定には、同じマイクロサテライト遺伝子座のセットをうまく利用できることが示された。
利益相反
著者は本論文の発表に関して利益相反がないことを宣言する。
謝辞
本研究は、ロシア連邦教育科学省（Project no.14.607.21.0044 from 22.08.2014; unique identifier RFMEFI60714X0044）により支援されたものである。 また、E. M. Romanov, A. I. Shurgin, R. V. Sergeev (Volga State University of Technology, Yoshkar-Ola, Republic of Mari El, Russia), M. V. Drapaluk, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikov, E. O. Kolesnikova (Voronezh State Forestry Engineering University, Voronezh, Russia), and G. B. Kolganikhina (Institute of Forest Science RAS, Uspenskoe, Moscow region, Russia), for their help with sample collection in native stands. また，M. Zeps, D. Auzenbaha, A. Gailis (Latvian State Forest Research Institute “Silava,” Salaspils, Latvia) には生物試料とアスペン・エリートクローンに関する情報を提供していただき，感謝している。