PCRクローニング（1）に対して、TAクローニング（2）、ligation independent cloning (LIC) (3-4), recombinase-dependent cloning (5-7), and PCR-mediated cloning (8-10) など数多くの代替アプローチが開発されてきた。 クローニング法の実用性は、利便性、価格、最適条件下での効率性よりも、その信頼性によって決定される。 モニタリングと最適化が最も容易な方法が、最終的に最も信頼できる方法となる。 TAクローニングやLICでは、ゲル電気泳動では確認できない末端修飾が必要である。 リコンビナーゼは一般にクローニングキットの専用成分として販売されているため、in vitroの組換え反応を最適化する消費者はほとんどいない。 ここで説明するオーバーラップエクステンションPCRクローニングは、PCRを介したクローニングの最初の形態ではない(8-10)。
2回のPCRのうち最初のPCR（図1A）は、両端にプラスミド配列を有する線状挿入物を作成する（方法およびプライマー設計の指示については補足資料を参照のこと）。 これらの延長は、その後、PCR産物（図1A）の鎖が、ベクター断片（図1B）上で一対の特大プライマーとして作用することを可能にする。 変性とアニーリングの後、インサート鎖はベクターにハイブリダイズし、伸長して新しい二本鎖プラスミドを形成する。 本技術の実行に不可欠なPhusion DNA polymerase (Cat. No. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) は、鎖置換活性を有していない。 したがって、反応の最終生成物は、2つのニック（各鎖に1つずつ）を有する2本鎖融合プラスミドである。 この緩和された二本鎖プラスミドをコンピテント大腸菌に形質転換し、DNA修復酵素でニックを封じ込める（図1C）。
(A) まず、インサートをキメラプライマーでPCR増幅し、最終PCR産物がベクターと重なる領域を持つようにする。 (B) 次に、ベクターとインサートを混合し、変性させ、アニーリングする。ハイブリダイズしたインサートは、ベクターを鋳型としてPhusion DNA polymeraseによりインサートの5′末端に達するまで伸長させる。 数回のPCRサイクルの後、2つのニック（各鎖に1つずつ）を持つ新しいプラスミドが産物として蓄積される。 (C)親プラスミドをDpnI消化で破壊した後、新しいプラスミドを大腸菌に形質転換できる。
我々はまず原理検証のためにgfpを使用しました。 gfp遺伝子をキメラプライマー（pQE30プラスミドに相補的な5′端；gfpに相補的な3′端）を用いてPCR増幅した（図1A）。 オーバーラップエクステンションPCR（図1B）を5種類のDNAポリメラーゼで行った（補足表S1）。 挿入物の高濃度および反応中の比較的低いアニーリング温度（プライマー／プラスミド複合体の計算融解温度より5〜10℃低い）は、効率的なオーバーラップ伸長には重要である。 PCR産物のいくつかは、アガロースゲル分析によって明らかにされるように、望ましいベクターの緩和型に対応する（図2A）。 元のpQE30ベクターは、DpnI制限エンドヌクレアーゼとの反応において破壊された（図1C）。
(A) 0、5、10、15、20、25、30サイクル後のオーバーラップ伸長PCRクローニング反応の産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果である。 3ナノグラムのpQE30ベクターを175ngのインサート（250モル過剰）と総量10μLで混合した；反応の4-μLアリコートを0.8%アガロースゲル上で分離した。 M2、1kbのDNAラダー；M1、閉じた円形および弛緩した円形の形態で組み立てられたプラスミド。 (B) gfp遺伝子のオーバーラップ伸長PCRクローニング効率をPCRサイクル数の関数として示した。 20マイクロリットルのコンピテント大腸菌を1μLのpQE30/insertオーバーラップエクステンションPCRで形質転換させた。 各プレートについて、PCRサイクル数に対する緑色のコロニー数をプロットした。 (C) オーバーラップエクステンションPCRのクローニング効率をインサート長の関数として示した。 Phusion DNAポリメラーゼを使用して、様々なサイズの産物をPCR増幅させた。 GFP（gfp）遺伝子、β-D-グルクロニダーゼ（gusA）遺伝子、β-ガラクトシダーゼ（lacZ）遺伝子、およびpIMBBプラスミドからのluxABCDEオペロンである。 これらの産物をゲル精製し、pQE30ベクターとのオーバーラップ伸長PCR反応に使用した。 3ナノグラムのpQE30ベクターを175-500ngのインサートと全反応量10μLで混合し、18サイクルのPCRに供した。 DpnI処理後、オーバーラップエクステンションPCR産物を用いて、コンピテント大腸菌を形質転換した。
Phusion DNAポリメラーゼは、おそらくその優れた処理能力と忠実性により、試験した競合他社（補足表S1）よりもオーバーラップ伸長PCRクローニングに適していた（11-12）。 Phusion DNAポリメラーゼは、ネイティブなPfuポリメラーゼ（Cat. No. 600135; Stratagene, La Jolla, CA, USA）よりも10×処理能力が高く、46×多くのコロニーを生成した（Supplementable Table S1）。 また、Taq DNA ポリメラーゼを主体とする Expand Long Template DNA polymerase mix (Cat. No. 11681834001; Roche, Basel, Switzerland) に比べて、35×多くのコロニーを形成した。 ZuoとRabieは、Taq DNA polymerase単独で同様の方法を開発し、同様に控えめなクローニング効率を報告している(8)。 Taq DNAポリメラーゼは比較的処理能力が高いが（Phusionの60％）、混合物の全体的な忠実度はPhusionの3.8％に過ぎない。
オーバーラップ伸長PCRクローニングの効率を温度サイクルの関数として測定したところ、最初の15サイクルの間に組換えクローンの数が幾何学的に増加し、17-18サイクルでピークに達した(図2B)。 それ以上のサイクルでは、アガロースゲルで観察される高分子量DNA産物の蓄積と関連して、生成されるクローン量がわずかに(~30%)減少した(Figure 2A)。 インサートとプラスミドの比率もまた、反応の結果に顕著な影響を与える可能性がある。 Phusion DNA ポリメラーゼを用いたオーバーラップ伸長PCRクローニング反応において、3種類のベクター：インサートの比率（1:5; 1:50 and 1:250）を比較した。 3つの比率とも、プラスミドのニックフォームの出現（アガロースゲル電気泳動で判断、図示せず）と組換えクローンの出現（形質転換と緑色のコロニーの成長で判断）をもたらした。
次にオーバーラップ伸長PCRクローニングを行い、GFP（gfp、1kb）、β-D-グルクロニダーゼ（gusA、1.9kb）、β-ガラクトシダーゼ（lacZ、3.2kb）の遺伝子と、luxABCDEオペロン全体（6kb）のクローンを作製した。 すべての組換えベクターが正しい構造であることは、制限分析およびレポータータンパク質の機能によって確認された。 完全なレポーター活性を示さなかったコロニーの割合から判断すると、我々の方法に関連する見かけのエラー率は、挿入物のサイズに関係なく<3%であった（データは示さず）。 同時に、形質転換後にプレート上で観察したコロニーの数は、インサートの長さが長くなるにつれてかなり減少した（図2C）。 このグラフはほぼ直線的であり、この技術によるインサートの上限は6.7kbであることを示唆している。
いかなるクローニングプロジェクトの結果も、作業者の努力と注意に大きく左右されるものである。 ここで述べたオーバーラップエクステンションPCRクローニング反応は、他のロングPCRプロトコルと同様にモニタリングと最適化が容易である(13)。 一般に、反応条件が厳しすぎる(プライマーがアニールしない)、あるいは緩すぎる(非特異的プライミング)と、PCRの収量は悪くなる。 どちらもアガロースゲルの空レーンに現れるが、後者はスミアや望ましくないバンドを生じることもある(プライマー設計とPCR反応の最適化に関する詳細は補遺を参照)。 PCRの強さは反応物濃度(プライマー、鋳型)、アニーリング温度、バッファーの成分(マグネシウム、pH、DMSO)、温度サイクルの数を変えることにより制御することが可能である。 全体として、このクローニング法は内部の繰り返し要素の存在に鈍感であることが証明された（詳細は補足資料を参照）。 Phusion DNAポリメラーゼは、挿入物のPCR増幅とオーバーラップ伸長反応の両方を触媒するために使用できるので、実務者は単一の酵素の特質に精通する必要があるだけである。