Uma produção sexual de organismos geneticamente idênticos é conhecida como clonagem que envolve a divisão de um único embrião, ou os genes nucleares e o pequeno número de genes mitocondriais seriam “idênticos”, ou pode envolver transferência nuclear, caso em que apenas os genes nucleares seriam “idênticos”. Após luta de muitos anos em 1995, cientistas clonaram dois cordeiros “Megan e Morag” no “Roslin Institute” na Escócia e foram clonados a partir de células de um embrião inicial,1 embora os anfíbios já tivessem sido clonados com sucesso nos anos 50. Depois disso, foi relatado que vários cordeiros tinham nascido por clonagem. Em fevereiro de 1997, após 277 tentativas, um cordeiro foi clonado com o nome de “Dolly”, o tempo de vida desse cordeiro era bastante superior ao de outros cordeiros clonados.2 A clonagem da Dolly anunciou o início de um novo período na agricultura, com a possibilidade de proteção e rápida multiplicação de genótipos selecionados.3 Até agora muitos animais foram clonados por transferência nuclear em mamíferos como ovelhas, cabras, bovinos, coelhos, ratos.4 A clonagem tem muitas aplicações e facilita a rápida propagação de estoques de animais desejáveis, a propagação de animais transgênicos, alterações genéticas direcionadas em animais domésticos e a conservação de espécies ameaçadas de extinção.1 Mas algumas questões ainda não foram resolvidas, como questões éticas e morais, e as baixas taxas de sucesso com a transferência nuclear de células somáticas devido a erros epigenéticos como resultado de uma programação nuclear incorreta,5 todos os fatores têm restringido a satisfação e aplicabilidade da clonagem na agricultura.
A limitação da clonagem deve-se à complexa interação de muitas razões como o bem-estar animal e a falta de confiança na saúde a longo prazo do animal clonado.6 Durante o uso da técnica de clonagem, a maioria dos embriões de boa qualidade aparentemente não florescem durante a gravidez ou após o nascimento.7 A falha na reprogramação do núcleo doado é a principal causa do fracasso devido à sua importância no padrão correto de expressão gênica a ocorrer durante a embriogênese subsequente.8 Esta reprogramação deve ocorrer em um curto período de tempo, em um contexto celular diferente em relação ao desenvolvimento normal, e é propensa a erros. Há uma quantidade crescente de dados documentando desvios na reprogramação epigenética.9
A taxa de falha de clonagem é muito alta,10 muitos embriões clonados podem se desenvolver até a fase de pré-implantação, mas a grande maioria não resultará em uma gravidez viável.11 Apesar do uso de fêmeas saudáveis e férteis síncronas como receptoras, foi relatado que 50% da perda ocorreu durante o início do first trimestre e cerca de 80% abortam até o segundo trimestre, principalmente devido a anormalidades placentárias.12 De acordo com estudos realizados em vacas e ovelhas, o período mais dramático de perda fetal é no momento da fixação placentária.4 Após completar a gestação, os animais clonados enfrentam maiores dificuldades de adaptação à vida extra-uterina,13 parecem normais, mas são geneticamente diferentes e que as diferenças são devidas a anormalidades epigenéticas adquiridas durante a reprogramação nuclear.10 Muitas anormalidades gestacionais e neonatais são encontradas no animal clonado,12 o que pode ser devido à expressão irregular e provável reprogramação incompleta dos genes impressos.14 De acordo com alguns outros relatos, a diferença é devida a anormalidades no comprimento do telômero, expressão gênica ou padrões de metilação.4
Um outro problema que é encontrado no animal clonado são as anormalidades placentárias. De acordo com muitos cientistas, a morte precoce do embrião é devida ao fraco desenvolvimento da placenta. Em animais clonados o desenvolvimento anormal da membrana alontóica e o desenvolvimento reduzido do vaso sanguíneo placentário tem sido relatado, o número de placentomas é menor no animal clonado15 e parece que a capacidade de troca gasosa da placenta é significantly reduzida, uma vez que os fetos clonados de gestação tardia têm sido encontrados hipóxicos.16
A viabilidade pós-natal da descendência clonada é menor no animal clonado, mas depende do animal.17 No pós-natal, a maioria dos bezerros apresentou problemas respiratórios18 , problemas cardiovasculares, esqueléticos e do sistema nervoso central.7 O potencial de erros epigenéticos na composição de animais clonados, por isso a segurança dos produtos alimentares derivados teve grande obstáculo na obtenção de aprovação regulatória para entrada na cadeia alimentar.
Anomalias epigenéticas
Epigenética significa “o estudo de alterações mitóticas e/ou meiolíticas hereditárias na função gênica que não podem ser explicadas por alterações na sequência de DNA.19 De acordo com a teoria clone e o animal doador devem ter o mesmo genoma, mas não é provável que os mamíferos clonados ocasionalmente apresentem anomalias de desenvolvimento devido a erros epigenéticos.20 Outras anomalias incluem problemas respiratórios, grandes anomalias cardiovasculares e aumento dos órgãos são comumente observados em ruminantes clonados21 , por isso a aplicabilidade da clonagem na agricultura é muito limitada.22
O resultado prático é que existem muitos animais clonados que se comportam e parecem normais, enquanto investigações mais atentas revelaram que mesmo alguns destes animais aparentemente normais são sutilmente diferentes da população naturalmente produzida.23 Na clonagem, quando a célula somática é transferida do doador para o receptor naquele momento, o núcleo da célula somática deve ser rapidamente reprogramado para presumir sua nova vida de uma célula embrionária.24 Em qualquer caso, se a célula incapaz de reprogramar ou em reprogramação completa levar ao desenvolvimento abortivo e possivelmente a anormalidades não letais nos clones sobreviventes.4 Alguns genes são corretamente expressos em embriões clonados, como enzimas metabólicas importantes, mas a expressão de algum outro gene, na maioria das vezes anormal, que afeta a vida futura do clone. Em tais condições, a maioria dos clones aparentemente teve uma gravidez e período neonatal normais, as perspectivas para uma vida normal parecem boas, mas o desenvolvimento placentário e o ambiente intra-uterino de muitos clones é subótimo e isto por si só pode impactar na sua saúde em vida posterior.25
A metilação do DNA desempenha um papel importante na expressão gênica que controla o desenvolvimento animal.5 É relatado que os erros epigenéticos principalmente nos padrões de metilação do DNA e na organização da cromatina no embrião clonado.19 Frequentemente, o padrão celular doador da metilação do DNA é mantido durante o desenvolvimento pré-implantação14 , o que leva a uma reprogramação efetiva e que causa uma placentação anormal.26 Secundariamente, esta é uma razão importante para a baixa taxa de nascimento.24
Anormalidades placentárias
Placenta é o principal órgão de contato materno-fetal, desempenha um papel vital na manutenção da gravidez e mantém o feto ao satisfazer a partição positiva de nutrientes e funções endócrinas críticas. A sobrevivência e desenvolvimento fetal durante a gravidez depende do desenvolvimento morfológico e funcional adequado da placenta. A clonagem está sempre associada a anomalias placentárias e as indicações de falência placentária em gravidezes de transferência nuclear incluem anomalias como a síndrome dos descendentes grandes, alterações das proteínas da membrana placentária e fetal, aumento do peso da placenta e aumento e edema da placenta no gado.27 Hydroallantois foi classified por Farin como uma condição da síndrome da descendência anormal Tipo II nesta condição placentária patológica fetal fluid aumenta e cria dificuldades em localizar o feto dentro do corno uterino.27
Na gravidez precoce do animal clonado a taxa de mortalidade fetal está próxima de 80%26 , o que se deve principalmente ao mau funcionamento e subdesenvolvimento da placenta.15 Tipicamente, em bovinos, 50-70% das gestações no 50º dia são perdidas durante o resto da gestação e até o termo devido à falta de vascularização placentária e locais de fixação que são importantes para a troca de nutrientes e previnem o feto da condição hipóxica.7 No terceiro trimestre de gravidez de vacas com fetos clonados; algumas anormalidades placentárias, como edema e hidroalantois com chance de ocorrer perto de 45%, também foram relatadas.28 A condição de hidroalantois mais comumente observada entre os dias 150 e 180 de gravidezes clonadas.28 De acordo com pesquisas, a disfunção e aumento da placenta pode ser devida às proteínas da placenta que mostraram uma sobreexpressão de TIMP-229, mas de acordo com algumas outras pode ser devida à alteração da expressão gênica no trofoblasto da placenta clonada.30
Dificuldades no parto
Na atualidade, a clonagem geralmente tem baixa efficiency, como de muitos fatores, como reprogramação do núcleo, diferenciação das células doadoras e situação do oócito.31 O período de reprogramação é o estágio chave para a otimização da clonagem.32 Nesse momento, se a reprogramação não ocorrer adequadamente, então ela leva a anormalidades epigenéticas e aumenta a taxa de mortalidade. e os bezerros clonados somáticos são aparentemente mais pesados que os clones embrionários33 , que também é um exemplo de anormalidades epigenéticas que aumentam a complicação do nascimento.13 Feto de grande porte incluindo todas as anormalidades neonatais devido a erro epigenético denominado “síndrome do bezerro grande”.34 É comum que a duração da gestação em gestações de transferência nuclear seja prolongada, ou seja, devido a falha da placenta para o cortisol fetal a curto prazo ou a falta de liberação de ACTH do feto.26 O desequilíbrio hormonal e o grande tamanho do feto são o passo para a distócia, além de problemas pós-parto relacionados podem também ter sérios efeitos negativos sobre a saúde da mãe, bem como sua produção futura e desempenho reprodutivo no rebanho.7
viabilidade pré e pós-parto
Embrião é considerado de boa qualidade se o número de células for bastante bom, pois é um critério importante que verifica a viabilidade do embrião após a transferência para uma mãe substituta, de modo que o baixo número de células no embrião clonado estará ligado a um baixo percentual de sobrevivência após a transferência do embrião em várias espécies.35 Os embriões bovinos clonados com uma porcentagem maior de blastômeros apoptóticos mostraram uma taxa de gravidez menor após 90 dias de transferência embrionária e, posteriormente, uma taxa de parição mais baixa.36A proporção de bezerros clonados nascidos que são sobreviventes a longo prazo varia entre 47% e 80%.38 Ao nascimento, bezerros clonados e cordeiros geralmente mostram sinais de um ambiente uterino estressante; a capacidade de reserva placentária é muito provavelmente limitada devido ao desenvolvimento inadequado.7 É evidente que a viabilidade fetal em animais clonados varia entre experimentos e entre espécies, com ratos e cabras clonados apresentando melhor viabilidade pós-natal que pode ser devida à técnica, à linhagem animal ou ao tipo placentário.26 Alguns outros casos também são relatados sobre o cordão de sebo de bezerros clonados que pode ser uma rota potencial de morte pós-natal.39 Em bezerros clonados, veias e artérias umbilicais aumentadas são também importantes causas de morte pós-natal devido à sepse em estruturas umbilicais.39
De acordo com novas pesquisas, problemas vasculares também são uma causa de morte pós-natal como hipertensão pulmonar, lesões, edema e derrames pleurais, além de congestão capilar dos septos alveolares e trombose pulmonar causando distúrbios hemodinâmicos. Estas alterações provavelmente inibiram a expansão alveolar completa e explicaram a insuficiência pulmonar que contribuiu para a baixa sobrevida pós-natal de bezerros clonados.40 Estes problemas de desenvolvimento vascular resultaram como as alterações primárias ou fundamentais devido às modificações epigenéticas causadas pela clonagem.
Embora estas aberrações epigenéticas particulares possam ser menores e não um problema de bem-estar para o animal, elas podem limitar algumas aplicações práticas da tecnologia porque diminuem a uniformidade potencial do gado clonado.41 Um fenótipo clonal de espécie diagonal conhecida é a confirmação de sistemas imunológicos comprometidos, com aplasia tímica em bovinos clonados e menor produção de anticorpos em ratos clonados.26 Sistemas imunológicos comprometidos podem aumentar sua propensão a infecções e doenças.9
Em pós-parto de amostras de sangue coletadas dos cordeiros clonados após o nascimento revelou uma ampla gama de anormalidades indicativas de disfunção renal e hepática.32 Outras perdas ao longo do período pós-natal são devidas principalmente a anormalidades dos sistemas cardiovascular, esquelético e nervoso central, infecções umbilicais e pulmonares, juntamente com distúrbios digestivos e renais.7 Perdas pós-natais em ovinos são maiores do que em bovinos.26
Fenótipos de clones adultos
Se os genes dos padrões de expressão são anormais no momento do pré-implante e nos estágios iniciais de implantação, a morfologia do clone também será anormal.42 Na maioria dos casos, os clones parecem normais e têm fisiologia normal, mas ainda assim muitos relatos estão presentes que mostram as anormalidades associadas ao fenótipo,41 como a “síndrome da descendência grande”.9 Isso se deve a erros na expressão gênica do crescimento e desenvolvimento fetal.43 A incidência dessas anomalias pode variar de acordo com a espécie, genótipo, sexo, tipo de célula ou aspectos specific do protocolo de transferência nuclear.4
Alta taxa de falhas
Uma barreira ao uso prático de técnicas envolvendo transferência nuclear de células somáticas é a baixa possibilidade de embriões clonados; apenas alguns poucos por cento dos oócitos reconstruídos são sempre capazes de se desenvolver.43 Até agora, a taxa de sucesso se a clonagem intra-específica for de 1%44 , apesar do uso de receptores saudáveis e sincronizados, além da boa qualidade do embrião utilizado. Na maioria das espécies de mamíferos, a avaliação da morfologia do embrião continua sendo o método de seleção para a transferência de uma variedade de embriões praticáveis mais cedo. É a forma mais realista e clinicamente útil para avaliar a viabilidade do embrião.14 Mas ainda assim a maioria dos casos de perda significativa de gravidez é relatada em estágios iniciais de desenvolvimento aproximadamente na idade de 30-90 dias de gestação45 devido a falha da membrana placentária e redução do desenvolvimento dos vasos placentários,39 é relatado que no início do first trimestral as taxas de gravidez são inferiores a 1/2 do que normalmente esperado, a perda embrionária é muito alta e próxima de 80% de aborto até o segundo trimestre, além de que no final da gestação as chances de desenvolver anormalidades placentárias e fatais são altas e normais.7 A principal causa das perdas no terceiro trimestre são hidropisia e hidropisia fetal, geralmente atribuídas à placentação inadequada.16 Está também presente na literatura que a perda do feto clone também é devida à condição hipóxica porque no animal clonado o número de placentomas é menor, o que é capaz de trocar menos nutrientes da mãe para o feto e tornar uma condição desfavorável para o desenvolvimento do feto.15
A alta taxa de perda de gravidez e morte neonatal de bezerros clonados é devida à reprogramação nuclear incompleta; vários autores têm confirmado de forma persuasiva que a célula somática doadora é reprogramada de tal forma que o padrão de expressão no estágio blastocisto é significativamente diferente daquele da célula somática antes da transferência nuclear.46 De acordo com Arnold et al.A expressão de genes críticos para o desenvolvimento normal da placenta é malformada em embriões bovinos clonados, o que pode causar diferenciação trofoblástica anormal e aumentar a perda de gravidez. Mesmo os descendentes em desenvolvimento têm grandes placentas e aumento do peso ao nascer, conhecido como síndrome dos descendentes grandes14 e alguns com aparência aparentemente saudável sofrem de disfunção imunológica, levando ao aumento da mortalidade.24
De acordo com um relato de Marfil et al.48 em bezerros clonados. Um cordão umbilical aumentado 37%, hiper/hipotermia 17% e recumbência deprimida/prolongada 20% são as causas mais comuns de morte entre 24h e 60dias após o nascimento. Os problemas que podem diminuir a sobrevivência destes bezerros no momento do nascimento ou por volta do mesmo incluem o aumento da duração da gestação, distócia grave, desenvolvimento e função placentária insuficientes e falhas nas vias metabólicas necessárias para a vida extra-uterina e alguns problemas congênitos, como hipoplasia cerebelar, angústia respiratória e aumento do coração.4
Pode ser normal que os clones tenham uma sensibilidade diferente ao estresse quando comparados a animais conservadores, pois são mais propensos a patógenos que também podem aumentar a taxa de morte dos clones.23 Para prevalecer sobre a baixa eficiência da clonagem, vários métodos diferentes foram experimentados, como o uso de diferentes tipos de linhas de células doadoras, uma variedade de sistemas de cultivo, diferentes métodos de fusão e produtos químicos.35 Alguns desses esforços de pesquisa levaram a uma pequena melhoria na qualidade dos embriões clonados, que está intimamente relacionada com o desenvolvimento embrionário e a produtividade da prole.
Ethnics
Clonagem de animais é a chave do desenvolvimento no campo da agricultura e da medicina, mas é aceitável somente quando os objetivos e métodos são justificados eticamente e quando é realizada sob condições éticas. Os cientistas estão fazendo uma extensa pesquisa em clonagem animal, mas agora muitas questões éticas são levantadas. A notável ineficiência da clonagem representa sérias ameaças ao bem-estar animal.49 Muitas vezes, menos de um por cento das tentativas de clonagem resulta num nascimento bem sucedido e, das que nascem, apenas uma percentagem relativamente pequena é suficientemente saudável para viver durante mais de alguns dias ou semanas.35 De acordo com uma pesquisa, 64% das pessoas nos EUA são contra a clonagem e acham que é contra o bem-estar animal que é moralmente errado.50
O resultado ético mais grave da clonagem é a dor que os animais sofrem durante esse processo, além de que a clonagem também tem efeito sobre outras populações de animais. Devido a isso, os seres humanos também podem ser muito afectados pela clonagem de animais ao comprometerem a segurança do gado utilizado na produção de alimentos.51 A clonagem tem um efeito negativo tanto sobre a doadora como sobre a receptora porque na clonagem primeiro é feita uma cirurgia para remover o óvulo da doadora e depois novamente uma cirurgia da receptora para implantar o óvulo com menos chances de conseguir um objetivo além dele se o animal completar com sucesso a sua gestação o devido a algum motivo desconhecido o peso elevado da prole17 , pois a maior parte precisa de uma cesariana devido ao qual o animal sofre novamente de dor.
Algum outro problema também é relatado em que o animal sofre de dor e que é contra o bem-estar animal como Hydroallantois, a condição tipicamente fatal em que o animal grávido incha de líquido ao ponto de parecer que está prestes a explodir.48 É evidente que embriões produzidos por transferência nuclear podem levar, em alguns casos, ao desenvolvimento instável do feto e ao aumento da incidência de Distocia, Sectio caesarea e morte perinatal, o que pode ter efeitos negativos no receptor e na prole, o que cumulativamente levanta dificuldades morais.52 A biodiversidade é uma rede de segurança que protege contra a propagação de doenças em animais, mas a clonagem é um esforço para fixar com um conjunto de genes desejáveis e criar cópias exatas do animal de origem, o que é oposto à diversidade, também levanta uma série de questões éticas.53
Segurança alimentar
Todos os países têm um departamento especial para lidar com o produto alimentar produzido por uma biotecnologia. Entretanto, os produtos biotecnológicos animais têm que passar por avaliações de segurança que são realizadas antes da aceitação pública e governamental de seu uso para consumo humano.23 A possibilidade de erros epigenéticos na capacidade de alterar a composição dos alimentos é a razão pela qual os produtos alimentícios derivados de animais clonados têm sido um grande obstáculo na obtenção de aprovação regulatória para a entrada de produtos clonados na cadeia alimentar. Além disso, um ensaio de alimentação em ratos confirmou que a utilização de carne de animais clonados não teve efeito no crescimento corporal, ingestão de alimentos, condição geral, atividade locomotora, reflexes, ciclo sexual, urinálise, hematologia, bioquímica sanguínea ou histologia.23 Dada a tecnologia ainda é considerada nova e desconhecida, além da falta de quaisquer produtos com benefits direto para o consumidor de hoje, não é chocante que a aceitação atual seja baixa. Entretanto, o amadurecimento da tecnologia e a disponibilidade de tais produtos em combinação com o envelhecimento das populações do mundo ocidental desenvolvido, com um forte desejo de permanecer saudável por mais tempo, poderia eventualmente aumentar a aceitação.54