Characterization of the anti-inflammatory Lactobacillus reuteri BM36301 and its probiotic benefits on aged mice

Characterization of probiotic lactic acid bacteria

We isoleren al jaren melkzuurbacteriën (LAB) uit verschillende bronnen, waaronder mensen, dieren, planten en voedingsproducten. Deze Benebios Microorganismen (BM) collecties bestaan uit meer dan 500 stammen, met probiotische potentie die uit hun eerste screenings naar voren zijn gekomen. In deze studie hebben we vier menselijke commensale stammen uit ontlastingsmonsters gekozen en in detail bestudeerd (tabel 1). De specifiek onderzochte stammen waren twee Lactobacillus reuteri stammen (BM36301 en BM36304), een L. gasseri stam (BM33601), en een Bifidobacterium animalis subsp. lactis stam (BM10307).

We onderzochten de bacteriën met betrekking tot hun algemene kwalificaties als probiotica (tabel 1). Allereerst toonden deze BM-stammen resistentie tegen zuren (pH 2,5) en galzouten (0,3 %), met een overlevingspercentage van 43 % tot 98,5 % na 1 uur behandeling bij 37 °C, wat redelijk hoge scores zijn . Vervolgens testten we de antimicrobiële activiteiten tegen enterische bacteriën. Terwijl L. gasseri BM33601 een minimale remming vertoonde van de tester stam E. coli, vormden alle anderen duidelijke remmingszones (0.5-3 mm afstand van de randen van het LAB). Deze remmende effecten worden gewoonlijk veroorzaakt door bacteriocines, organische zuren (melkzuur of azijnzuur), waterstofperoxide, of ethanol van het LAB . Tenslotte hebben we gekeken naar hun vermogen om zich in vitro te binden aan humane darmepitheelcellen (IECs). Daartoe kweekten we menselijke darmkankercellen, HT-29, gedurende 15 dagen op dekglaasjes en brachten er gedurende 1 uur levende LAB-culturen op aan (Methoden). Na uitgebreid wassen werden de resterende bacteriecellen gevisualiseerd door Gramkleuring voor telling onder de microscoop. De L. reuteri stammen BM36301 en BM36304 vertoonden hoge retentie scores (5.5-7.4 bacteriën per HT-29), terwijl L. gasseri BM33601 matige (1.7 bacteriën per HT-29) en B. animalis subsp. lactis BM10307 lage (0.3 bacteriën per HT-29) scores had. Een sterkere hechting van LAB aan IECs is bijzonder belangrijk omdat ze lang genoeg in de darmslijmvlieslaag moeten blijven om de voordelen op de gastheer te laten inwerken. Uit deze primaire experimenten bleek dat de twee L. reuteri-stammen een hoger potentieel hebben als probiotica van hoge kwaliteit.

Regulatie van TNF-α productie door melkzuurbacteriën in vitro

We wilden LAB screenen op hun potentieel om darmontsteking te onderdrukken. Daartoe pasten we een in vitro weefselkweeksysteem aan waarbij de menselijke myeloïde cellen (THP-1) TNF-α afscheiden na activering van hun Toll-like receptoren (TLR) door bacterieel lipopolysaccharide (LPS) . Eerst hebben we geverifieerd dat THP-1 cellen van 5 × 104 in 1 ml cultuur, behandeld met LPS in een dosis van 150 ng/ml gedurende 3,5 uur, gewoonlijk resulteerden in een productie van 200-300 pg/ml TNF-α (Fig. 1a, lanes 1 en 2). Vervolgens verzamelden we de supernatanten van bacterieculturen die gedurende 24 uur waren gekweekt, vacuümdroogden deze en reconstitueerden het geconditioneerde medium (CM) (Methodes). Dit CM bevat complexe activiteiten om zowel TNF-α te onderdrukken als te induceren, afhankelijk van het LAB en de kweekomstandigheden. We zagen inderdaad een lichte productie van TNF-α door de CMs van BM36304 en BM36301 zonder LPS, maar deze hoeveelheid was minder dan 20 % van de door LPS gestimuleerde inductie (data niet weergegeven). Tenslotte voegden we elke CM toe tot 5 % van de THP-1 kweek (v/v) in aanwezigheid van LPS (Fig. 1a, lanes 3-6). De TNF-α productie met LPS (208 ± 49 pg/ml, laan 2) werd tot 40 % onderdrukt met de CM van L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, laan 3), en tot 52 % met de CM van B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, laan 6). Voor onze screening beschouwden we de onderdrukking van TNF-α dichtbij of minder dan 50% van de expressie door LPS-behandeling als anti-inflammatoir. De CMs van L. reuteri BM36304 en L. gasseri BM33601 waren echter niet in staat om de TNF-α productie tot dat punt te onderdrukken. We controleerden deze inerte activiteit door deze CM’s onder verschillende kweekomstandigheden te bereiden (gegevens niet weergegeven).

Volgende onderzochten we het TNF-α inductievermogen van de bacteriecellen zelf, omdat cellulaire componenten van de Gram-positieve bacteriën ontstekingsreacties kunnen induceren. Daartoe kweekten wij bacteriën tot een exponentiële fase (16 h), oogstten en wasten deze levende bacteriële cellen vervolgens en voegden ze in overmaat (250-voudig aantal cellen) toe aan de THP-1 cultuur. De metabolische activiteiten van de bacteriële cellen werden geminimaliseerd door toevoeging van antibiotica in het THP-1 medium. Na 6 uur incubatie werd de uitgescheiden TNF-α kwantitatief gemeten (Fig. 1b). Hoewel alle vier de LAB cellen TNF-α bleken te induceren, produceerde BM36301 een aanzienlijk kleinere hoeveelheid (609 pg/ml) dan de anderen: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml), en BM10307 (7141 pg/ml). Tijdens deze 6 uur durende co-incubatie, zagen we dat THP-1 cellen een variabele celdood ondervonden, afhankelijk van het gebruikte LAB (Additional file 1). Met name BM36301, de laagste TNF-α inducer, veroorzaakte de minste THP-1 sterfte (9.7 %), terwijl de andere hogere TNF-α inducerende stammen aanzienlijk meer sterfte veroorzaakten (24-38 %). Het is dus niet zo dat BM36301 een lage TNF-α induceerde door het verlies van THP-1 levensvatbaarheid op zich. Voor onze screening beschouwden we LAB met een actieve TNF-α productie van meer dan 1000 pg/ml als pro-inflammatoir.

Samenvattend werden de in vitro immunomodulerende activiteiten ingedeeld als anti-inflammatoir met de suppressieve CM (BM36301 en BM10307) en pro-inflammatoir met de inductieve levende cellen (BM36304, BM33601, en BM10307). Aangezien BM10307 beide activiteiten vertoonde, hebben we het aangewezen als een stof met dubbele functionaliteit (Fig. 1c). Het was interessant om te zien dat de twee L. reuteri stammen verschillende activiteiten vertoonden. Bij de eerste screening van onze uitgebreide BM-collecties bleken de ontstekingsremmende stammen vrij zeldzaam te zijn, met een ontdekkingspercentage van minder dan 5 % (gegevens niet aangetoond). Ook vertoonden sommige stammen geen van beide activiteiten, waardoor ze in de categorie ‘neutraal’ vielen (data niet getoond).

Onstekingsremmende moleculen in de CM’s zijn stabiel tegen hitte en trypsine

Omdat de CM van LAB is samengesteld uit verschillende bacteriële metabolieten en cellulaire componenten, probeerden we de ontstekingsremmende aard van de CM beter te begrijpen. De expressie van TNF-α verminderde kwantitatief met toenemende concentraties van de CMs van L. reuteri BM36301 (Fig. 2a) en B. animalis subsp. lactis BM10307 (Fig. 2b). Interessant is dat een kleinere hoeveelheid CM van BM36301 (0,5× input of 2,5 % v/v) TNF-α juist verder induceerde, consistent met de waarneming dat deze CM tot op zekere hoogte TNF-α-inducerend materiaal bevat (Fig. 2a, lanen 2 en 3). Niettemin werden de onderdrukkende effecten dominant bij grotere hoeveelheden CM, wat suggereert dat de ontstekingsremmende stoffen kwantitatief additief zijn en dat de corresponderende receptoren op het THP-1 celoppervlak overvloedig genoeg zijn om gemakkelijk te reageren op toenemende CM behandeling. Al met al suggereren deze waarnemingen dat de CM’s actieve metabolieten bevatten die verantwoordelijk zijn voor de onderdrukking van TNF-α, ondanks hun complexe aard.

We onderzochten verder de fysisch-chemische eigenschappen van ontstekingsremmende stoffen in de CMs. Het koken van de CMs van elke stam gedurende 10 min bleek niet effectief in het veranderen van hun TNF-α remmende functies in vergelijking met natieve CMs (Fig. 2c, lanen 3 en 4). Ook trypsinebehandeling had geen effect op hun activiteiten (Fig. 2c, laan 5). Deze waarnemingen suggereren dat de belangrijkste remmende factoren in deze CMs noch eiwitten, noch hittegevoelige moleculen zijn.

Regulatie van TNF-α in muizen met probiotische bacteriën

De ultieme vraag met betrekking tot in vitro TNF-α regulatie op basis van onze LAB screening was hoe relevant dit zou zijn voor de in vivo toepassingen. We trachtten deze vraag rechtstreeks te beantwoorden door de geselecteerde L. reuteri-stammen toe te passen op een muismodel systeem. Wij prepareerden 20 weken oude, inteelt C57BL/6 muizen van 6 mannetjes en 8 wijfjes per groep. Dan over een periode van 20 weken, werd een groep behandeld met de anti-inflammatoire BM36301, een andere groep werd behandeld met de pro-inflammatoire BM36304, en de controlegroep werd behandeld met dextrose (Methodes). Als een middel om ongerief op de dieren te minimaliseren, werden de LAB culturen toegediend via het drinkwater om te voldoen aan de dagelijkse consumptie dosering van 1 × 106 bacteriën per muis. Wij verstrekten ook een standaarddieet zodat het verouderingsproces tijdens de periode natuurlijk verliep. Aan het einde van de 20 weken durende incubatie (in totaal 40 weken oud), euthanaseerden we de muizen en namen bloed af voor serum bereiding om cytokines en testosteron te meten met behulp van kwantitatieve ELISA methoden. Bij de necropsie vonden we geen grove morfologische afwijkingen.

In samenvatting zagen we een verlaging van serum TNF-α met de ontstekingsremmende BM36301, met een meer uitgesproken effect waargenomen bij de vrouwtjes. De pro-inflammatoire BM36304 leidde tot een toename van TNF-α bij mannen, maar niet bij vrouwen. Deze bevindingen suggereren dat onze in vitro screening betekenisvolle relevantie heeft met in vivo behoud van TNF-α in deze muizenproeven.

L. reuteri BM36301 handhaafde verminderde lichaamsgewichtstoename en hoog testosteron bij mannelijke muizen

Veroudering is de bron van veel gezondheidsproblemen bij mensen, waaronder diabetes en obesitas. Om dergelijke verouderingsproblemen in het diermodel te verergeren, worden vaak vetrijke diëten gebruikt. De interpretatie van die versnelde experimenten kan echter gecompliceerd zijn, omdat veroudering bij de mens niet mag worden aangedreven door een doelbewust vetrijk dieet. Wij kweekten alle muizen met een standaard dieet, zodat hun verouderingsproces zo natuurlijk mogelijk kon verlopen. In de experimentele periode van 20 weken vanaf de leeftijd van 20 weken oud, wonnen de mannetjes van de controlegroep ongeveer 8 g gewicht (7,83 ± 1,2 g) en de vrouwtjes van de controlegroep ongeveer 5 g gewicht (4,8 ± 0,94 g). Opmerkelijk was dat de gewichtstoename bij mannetjes gevoed met het ontstekingsremmende BM36301 significant lager was dan bij de controlegroep (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040) met 36 % (Fig. 4a, lanen 1 en 2). De gewichtstoename van de met BM36304 behandelde mannetjes (7,53 ± 0,74 g) was echter niet significant verschillend van de controle (p = 0,67). De gewichtstoename van de vrouwelijke groepen verschilde statistisch niet van elkaar.

Een ander significant verschil was het serum insuline gehalte van met BM36304 behandelde mannetjes (Fig. 4b). Terwijl de controle mannelijke groep 3,18 ± 0,65 ng/ml insuline toonde, toonde de BM36304-gevoede mannelijke groep 4,91 ± 0,63 ng/ml insuline (p = 0,027). Echter, consistent met de bevinding dat de gewichtstoename van deze groep niet veel verschilde van de controle (Fig. 4a), hebben we geen meer prominente abdominale vetophoping waargenomen in BM36304-behandelde mannetjes (data niet getoond). Op 40 weken oud, kan de insuline piek niet hebben veroorzaakt klinisch waarneembare diabetes in de muizen, maar de ziekte kan zijn geworden meer uitgesproken als de muizen ouder verder. De insuline variatie tussen de vrouwelijke groepen was niet significant verschillend van elkaar.

Finitief, richtten we ons op de testosteron niveaus van de mannetjes. Zoals getoond in Fig. 4c, behielden de met BM36301 gevoede anti-inflammatoire mannetjes significant hogere niveaus van serum testosteron (5,18 ± 0,87 ng/ml) dan de controlegroep (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). De met BM36304 behandelde groep was echter niet statistisch verschillend (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) van de controlegroep. Om de testosteron resultaten verder te begrijpen, onderzochten we de testikels van elke muis. Het gewicht van de gepaarde testikels van de met BM36301 gevoede mannetjes was 0.579 ± 0.075 g, 10 % zwaarder dan die van de controle (0.525 ± 0.05 g, p = 0.049). Gezien de kleinere gewichtstoename in de BM36301 groep (Fig. 4a), is dit verschil in grootte van de testikels duidelijker; de verhouding van testikels-gewicht tot lichaamsgewichtstoename (TW/WG) van de controle was slechts 67 % van die van de BM36301 groep. We konden echter geen microscopische verschillen waarnemen in de weefsels van de testes, zoals de diameter van de zaadbuisjes tussen deze twee groepen (156,03 ± 6,65 μm van de controle versus 153,95 ± 18,66 μm van de met BM36301 behandelde mannetjes, p = 0,51). We hebben geen andere studies uitgevoerd zoals het vergelijken van spermatogenese of Leydig cel gebied.

Samenvattend, het ontstekingsremmende BM36301 hielp mannetjes om een lagere gewichtstoename te behouden met grotere testikels en meer testosteron als ze ouder werden. Verminderde testosteron productie bij oudere mannen is in verband gebracht met leeftijdsafhankelijke laesies in de testes, vermoedelijk als gevolg van inflammatoire insult. Ondertussen heeft de pro-inflammatoire BM36304 een toename van insuline teweeggebracht, echter zonder veranderingen in gewichtstoename of testosteron bij mannen.

Gezonde vrouwenhuid door ontstekingsremmer BM36301

Een interessante eigenschap van bepaalde probiotica is dat ze de gezondheid van de huid kunnen bevorderen op een manier die afhankelijk is van immuunregulatie. Aangezien BM36301 ook ontstekingsremmende effecten vertoonde in vitro en in vivo, stelden we de vraag of deze stam dergelijke gezondheidsvoordelen kan uitlokken in de huid. Op de 18de week van de behandeling, scheerden we een gebied op 2 muizen van elke groep en onderzochten hen na 1 week. Interessant is dat BM36301 gevoede vrouwelijke muizen een snellere hergroei van het haar vertoonden, hoewel geen volledig herstel, op het geschoren gebied (Fig. 5a). In tegenstelling, vertoonden de controle of BM36304 groepen niet zo’n snel tempo van herstel. Geen van de behandelde mannen toonde haar hergroei merkbaar sneller dan de controle, wat aangeeft dat deze versnelde haargroei kan duidelijk zijn in alleen vrouwen. Een andere manier om de gezondheid van de huid te evalueren is de glans van de vacht te onderzoeken. We hebben echter geen significante verschillen waargenomen tussen elke groep door middel van sensorische of lichtmetermetingen, voornamelijk als gevolg van de relatief glanzende vacht van de controles (gegevens niet weergegeven).

We beoordeelden verder de gezondheid van de huid door het onderzoeken van doorsneden van de huid onder de microscoop na kleuring met Hematoxyline en Eosine. Zoals getoond in Fig. 5b en c, ontdekten we dat de met BM36301 behandelde vrouwelijke muizen een hoger aantal onderhuidse haarfollikel (HF) vertoonden dan de vrouwelijke controle muizen. De HF tellingen per microscopische weergave bij 400× resolutie waren 3,50 ± 0,52 voor de controle vrouwelijke groep, terwijl de tellingen waren 4,80 ± 0,61 van BM36301-gevoede vrouwtjes met een betekenisvol verschil (p = 0,023). De met BM36304 behandelde wijfjes vertoonden echter slechts een geringe verandering (4,15 ± 1,73, p = 0,55 vs. controle). Bij een meer gedetailleerde analyse van de haarfollikels, vonden we dat de met BM36301 gevoede wijfjes marginaal meer actieve haarcyclus stadia vertoonden dan de controle (anageen + catageen: telogeen was 81:19 van de controle vs. 95:5 van de met BM36301 gevoede wijfjes). Ondertussen waren de HF tellingen van de mannelijke groepen niet veel verschillend van elkaar (Fig. 5b). Tenslotte hebben we ook de huiddikte gemeten, gemeten als de diepte van de epidermis tot de panniculus carnosus (Fig. 5c, Additional file 1). Er was niet veel verschil in huiddikte tussen de controle en de met BM36301 behandelde wijfjes. Echter, de huidlagen van de met BM36301 gevoede muizen bleken marginaal dieper dan die van de controles, en het vetweefsel van de met BM36301 behandelde muizen was ondieper dan dat van de controle. De meeste subcutane HFs werden gevonden in de dermis.

Over het geheel genomen suggereren deze observaties dat de behandeling met ontstekingsremmer BM36301 een gezondere huid bevorderde, zoals blijkt uit de hergroei van haren en het aantal HFs bij de vrouwtjes. Echter, de microscopische verschillen van de huidmonsters tussen de controle en de BM36301 groepen bleken eerder marginaal. Deze voordelen voor de gezondheid van de huid werden niet waargenomen bij mannen. Ook het pro-inflammatoire BM36304 veroorzaakte geen nadelige effecten op de huid op het moment van de experimenten.