Een geslachtelijke voortbrenging van genetisch identieke organismen staat bekend als klonen. Het gaat om de deling van één enkel embryo, waarbij ofwel de nucleaire genen en het kleine aantal mitochondriale genen “identiek” zijn, ofwel een nucleaire overdracht plaatsvindt, in welk geval alleen de nucleaire genen “identiek” zouden zijn. Na een strijd van vele jaren hebben wetenschappers in 1995 twee lammeren “Megan en Morag” gekloond in het “Roslin Institute” in Schotland en zij werden gekloond uit cellen van een vroeg embryo,1 hoewel amfibieën reeds in de jaren vijftig met succes waren gekloond. Daarna werd gemeld dat een aantal lammeren door klonen was geboren. In februari 1997 werd na 277 pogingen een lam gekloond dat de naam “Dolly” kreeg en waarvan de levensduur veel langer was dan die van andere gekloonde lammeren.2 Het klonen van Dolly luidde het begin in van een nieuwe periode in de landbouw met de mogelijkheid tot bescherming en snelle vermeerdering van geselecteerde genotypen.3 Tot nu toe zijn veel dieren gekloond door middel van kerntransplantatie in zoogdieren zoals schapen, geiten, runderen, konijnen en muizen.4 Klonen heeft veel toepassingen en maakt het gemakkelijk om gewenste dieren snel te vermeerderen, transgene dieren te vermeerderen, gerichte genetische veranderingen in huisdieren aan te brengen en bedreigde soorten in stand te houden.1 Maar sommige problemen zijn nog steeds niet opgelost, zoals ethische en morele kwesties, en de lage succespercentages bij de overdracht van somatische celkernen als gevolg van epigenetische fouten door onnauwkeurige kernprogrammering,5 al deze factoren hebben de tevredenheid en toepasbaarheid van klonen in de landbouw beperkt.
De beperking van klonen is te wijten aan een complexe interactie van vele redenen, zoals dierenwelzijn en gebrek aan vertrouwen in de gezondheid van gekloonde dieren op de lange termijn.6 Bij het gebruik van kloontechnieken mislukken de meeste embryo’s van ogenschijnlijk goede kwaliteit tijdens de zwangerschap of na de geboorte.7 De belangrijkste oorzaak van het mislukken is de herprogrammering van de gedoneerde celkern, die van belang is voor het juiste genexpressiepatroon tijdens de daaropvolgende embryogenese.8 Deze herprogrammering moet binnen een kort tijdsbestek plaatsvinden, in een andere cellulaire context dan bij normale ontwikkeling, en is foutgevoelig. Er zijn steeds meer gegevens die afwijkingen in epigenetische herprogrammering documenteren.9
Het mislukkingspercentage bij klonen is zeer hoog,10 veel gekloonde embryo’s kunnen zich tot het preimplantatiestadium ontwikkelen, maar de overgrote meerderheid zal niet resulteren in een levensvatbare zwangerschap.11 Ondanks het gebruik van gezonde, vruchtbare synchrone wijfjes als ontvangers werd gemeld dat 50% van de embryo’s verloren ging in het eerste trimester en bijna 80% in het tweede trimester, meestal als gevolg van afwijkingen aan de placenta.12 Volgens onderzoek bij koeien en schapen treedt het foetale verlies het meest dramatisch op op het moment dat de placenta wordt gehecht.4 Na voltooiing van de zwangerschap hebben gekloonde dieren meer moeite om zich aan te passen aan het leven buiten de baarmoeder13 , zien ze er normaal uit maar zijn ze genetisch anders, en die verschillen zijn te wijten aan epigenetische afwijkingen die tijdens de nucleaire herprogrammering zijn ontstaan10. Veel zwangerschaps- en neonatale afwijkingen worden gevonden in gekloonde dieren,12 dat kan te wijten zijn aan onregelmatige expressie en waarschijnlijk onvolledige herprogrammering van ingeprente genen.14 Volgens sommige andere rapporten is het verschil te wijten aan afwijkingen in telomeerlengte, genexpressie of methyleringspatronen.4
Een ander probleem dat wordt aangetroffen in gekloonde dieren zijn placenta-abnormaliteiten. Volgens veel wetenschappers is vroegtijdige dood van het embryo te wijten aan een slechte ontwikkeling van de placenta. Bij gekloonde dieren is een abnormale ontwikkeling van het allontoïsmembraan en een verminderde ontwikkeling van de placenta-bloedvaten gerapporteerd; het aantal placenta’s is bij gekloonde dieren aanzienlijk lager15 en het vermogen van de placenta om gassen uit te wisselen blijkt aanzienlijk te zijn verminderd, aangezien laat in de zwangerschap gekloonde foetussen hypoxisch bleken te zijn16.
Postnatale levensvatbaarheid van gekloonde nakomelingen is lager bij gekloonde dieren, maar dit is afhankelijk van het dier.17 Postnataal vertoonden kalveren meestal ademhalingsproblemen18 cardiovasculaire problemen, problemen met het skelet en problemen met het centrale zenuwstelsel.7 Het potentieel voor epigenetische fouten effecten op de samenstelling van gekloonde dieren dat is de reden waarom de veiligheid van levensmiddelen afgeleid had grote belemmering in het verkrijgen van wettelijke goedkeuring voor binnenkomst in de voedselketen.
Epigenetische afwijkingen
Epigenetica betekent ”de studie van mitotically en/of meiotically overerfbare veranderingen in gen functie die niet kan worden verklaard door veranderingen in de DNA-sequentie.19 Volgens de theorie zouden kloon en donordier hetzelfde genoom moeten hebben, maar het is niet waarschijnlijk dat gekloonde zoogdieren af en toe ontwikkelingsafwijkingen vertonen ten gevolge van epigenetische fouten.20 Soms vertonen de placenta en de foetus een te grote groei, het zogenaamde “grote nakomelingen syndroom “15. Andere afwijkingen, zoals ademhalingsmoeilijkheden, grote cardiovasculaire afwijkingen en vergroting van organen, worden vaak gezien bij gekloonde herkauwers.21 Daarom is de toepasbaarheid van klonen in de landbouw zeer beperkt.22
Het praktische resultaat is dat er veel gekloonde dieren zijn die zich normaal gedragen en er normaal uitzien, terwijl nader onderzoek heeft uitgewezen dat zelfs sommige van deze ogenschijnlijk normale dieren subtiel verschillen van de natuurlijk geproduceerde populatie.23 Wanneer bij klonen een somatische cel van de donor naar de ontvanger wordt overgebracht, moet de kern van de somatische cel snel worden geherprogrammeerd om het nieuwe leven van een embryonale cel aan te nemen.24 Als de cel niet of niet volledig kan worden geherprogrammeerd, leidt dit tot een abortieve ontwikkeling en mogelijk tot niet-dodelijke afwijkingen bij overlevende klonen.4 Sommige genen komen in gekloonde embryo’s correct tot expressie, zoals belangrijke stofwisselingsenzymen, maar de expressie van sommige andere genen is meestal abnormaal, wat van invloed is op het verdere leven van de kloon. In dergelijke omstandigheden hebben de meeste klonen een normale zwangerschap en neonatale periode doorgemaakt en lijken de vooruitzichten op een normaal leven goed, maar de ontwikkeling van de placenta en de intra-uteriene omgeving zijn voor veel klonen suboptimaal en dit alleen al kan gevolgen hebben voor hun gezondheid op latere leeftijd.25
DNA-methylering speelt een belangrijke rol bij de expressie van genen die de ontwikkeling van dieren bepalen.5 Er is gemeld dat epigenetische fouten vooral optreden in de patronen van DNA-methylering en de chromatine-organisatie in gekloonde embryo’s.19 Vaak wordt het donorcel patroon van DNA methylering gehandhaafd tijdens de pre implantatie ontwikkeling14 die leiden tot effect herprogrammering en die abnormale placentatie veroorzaken.26 Secundaire dat is een belangrijke reden voor het lage geboortecijfer.24
Placenta afwijkingen
Placenta is belangrijkste orgaan van materno-foetale contact, het speelt een vitale rol in het behoud van de zwangerschap, en het onderhoudt de foetus door te voldoen aan positieve voedingsstoffen partitie en kritische endocriene functies. De overleving en ontwikkeling van de foetus tijdens de zwangerschap hangt af van de juiste morfologische en functionele ontwikkeling van de placenta. Klonering wordt altijd geassocieerd met placenta-afwijkingen en Indicaties van placenta-falen in nucleaire transferzwangerschappen zijn anomalieën zoals het grote nakomelingssyndroom, veranderde placenta- en foetale membraanproteïnen, verhoogd placentagewicht, en placentoomvergroting en oedeem bij runderen.27 Hydroallantois is door Farin geclassificeerd als een type II abnormale nakomelingen syndroom in Deze pathologische placenta conditie foetale fluid verhoogt en creëren problemen bij het lokaliseren van de foetus in de baarmoeder hoorn.27
In het begin van de zwangerschap van gekloonde dieren ligt de foetale sterfte in de buurt van 80%26 , wat meestal te wijten is aan een slechte werking en onderontwikkeling van de placenta.15 Bij runderen gaat 50-70% van de zwangerschappen op dag 50 verloren tijdens de rest van de dracht en tot het einde van de zwangerschap wegens gebrek aan placentale vascularisatie en aanhechtingsplaatsen die belangrijk zijn voor de uitwisseling van nutriënten en om te voorkomen dat de foetus in een hypoxische toestand geraakt.7 In het derde trimester van koeien die zwanger zijn van gekloonde foetussen zijn ook enkele placenta-afwijkingen gemeld, zoals oedeem en hydroallantois met een kans van ongeveer 45%.28 De hydroallantois-aandoening wordt het vaakst waargenomen tussen dag 150 en 180 van gekloonde zwangerschappen.28 Volgens onderzoek kan de disfunctie en vergroting van de placenta het gevolg zijn van placenta eiwitten die een over expressie van TIMP-229 vertoonden, maar volgens sommige andere kan het te wijten zijn aan verandering van genexpressie in trofoblasten van gekloonde placenta’s.30
Problemen bij de baring
Op dit moment is de efficiëntie van klonen over het algemeen laag door een groot aantal factoren, zoals de herprogrammering van de celkern, de differentiatie van donorcellen en de situatie van de eicel.31 De herprogrammeringsperiode is de belangrijkste fase voor het optimaliseren van klonen.32 Als de herprogrammering op dat moment niet goed plaatsvindt, leidt dit tot epigenetische afwijkingen en neemt het sterftecijfer toe. En somatisch gekloonde kalveren zijn blijkbaar zwaarder dan embryonale klonen33 , wat ook een voorbeeld is van epigenetische afwijkingen die de geboortecomplicaties vergroten.13 Grote foetussen met alle neonatale afwijkingen als gevolg van een epigenetische fout worden het “grote kalversyndroom” genoemd.34 Het is gebruikelijk dat de zwangerschapsduur in kerntransplantatiezwangerschappen lang is, wat te wijten is aan het falen van de placenta om het foetale cortisol tegen het einde van de zwangerschap af te breken of aan een gebrek aan ACTH-afgifte door de foetus.26 Hormonale onevenwichtigheid en grote omvang van de foetus zijn de stap in de richting van dystocie, naast gerelateerde post-partum problemen kunnen ook ernstige negatieve gevolgen hebben voor de gezondheid van het moederdier, evenals haar toekomstige productie en reproductieve prestaties in de kudde.7
Pre- en postnatale levensvatbaarheid
Embryo wordt als van goede kwaliteit beschouwd als het aantal cellen vrij goed is, omdat het een belangrijk criterium is om de haalbaarheid van het embryo na overbrenging naar een draagmoeder te verifiëren, zodat het lage aantal cellen in het gekloonde embryo in verband zal worden gebracht met een laag overlevingspercentage na embryotransplantatie bij verschillende diersoorten.35 Gekloonde runderembryo’s met een hoger percentage apoptotische blastomeren vertoonden na 90 dagen embryotransfer een lager zwangerschapspercentage en vervolgens een lager afkalfpercentage.36
ostnatale levensvatbaarheid is bij veel gekloonde dieren duidelijk lager.37 Het aandeel van de geboren gekloonde kalveren dat op langere termijn overleeft, varieert van 47% tot 80%.38 Bij de geboorte vertonen gekloonde kalveren en lammeren vaak tekenen van een stressvolle baarmoederomgeving; de placentareservecapaciteit is hoogstwaarschijnlijk beperkt als gevolg van een inadequate ontwikkeling.7 Het is duidelijk dat de levensvatbaarheid van foetussen bij gekloonde dieren verschilt per experiment en per soort, waarbij gekloonde muizen en geiten na de geboorte een betere levensvatbaarheid vertonen die mogelijk te wijten is aan de techniek, de dierenstam of het type placenta.26 Er zijn ook gevallen bekend van een vale navelstreng bij gekloonde kalveren, wat een mogelijke doodsoorzaak na de geboorte kan zijn.39 Bij gekloonde kalveren zijn vergrote naveladers en slagaders ook een belangrijke oorzaak van sterfte na de geboorte als gevolg van sepsis in de navelstrengstructuren.39
Volgens nieuw onderzoek zijn vasculaire problemen ook een oorzaak van sterfte na de geboorte, zoals pulmonale hypertensie, laesies, oedeem en pleurale effusies, naast capillaire congestie van de alveolaire septa en pulmonale trombose die hemodynamische stoornissen veroorzaken. Deze veranderingen remden waarschijnlijk de volledige alveolaire expansie en verklaarden de pulmonale insufficiëntie die bijdroeg aan de lage overlevingskans van gekloonde kalveren na de geboorte.40 Deze vasculaire ontwikkelingsproblemen waren de voornaamste of belangrijkste veranderingen als gevolg van epigenetische wijzigingen die door klonen werden veroorzaakt.
Hoewel deze specifieke epigenetische afwijkingen van ondergeschikt belang zijn en geen probleem vormen voor het welzijn van het dier, kunnen zij sommige praktische toepassingen van de technologie beperken omdat zij de potentiële uniformiteit van gekloonde dieren verminderen.41 Een kloonfenotype dat diagonaal bekend is, is de bevestiging van een gecompromitteerd immuunsysteem, met thymische aplasie bij gekloonde runderen en een lagere antilichaamproductie bij gekloonde muizen.26 Een gecompromitteerd immuunsysteem kan hun neiging tot infectie en ziekte vergroten.9
Postnataal van Bloedmonsters die na de geboorte van de gekloonde lammeren zijn afgenomen, vertoonden een breed scala aan afwijkingen die duidden op nier- en leverfunctiestoornissen.32 Verdere verliezen gedurende de postnatale periode zijn meestal te wijten aan afwijkingen van het cardiovasculaire systeem, het skelet en het centrale zenuwstelsel, navel- en longinfecties, samen met spijsverterings- en nierstoornissen.7 Postnatale verliezen bij schapen zijn groter dan bij runderen.26
Fenotypes van volwassen klonen
Als de expressiepatronen van genen abnormaal zijn op het moment van pre-implantatie en in de vroege implantatiestadia, zal de morfologie van de kloon ook abnormaal zijn.42 In de meeste gevallen zien de klonen er normaal uit en hebben ze een normale fysiologie, maar toch zijn er veel meldingen die afwijkingen vertonen die geassocieerd zijn met het fenotype,41 zoals het “grote nakomelingen syndroom”.9 Dat is te wijten aan een fout in de genexpressie van de foetale groei en ontwikkeling.43 De incidentie van deze afwijkingen kan variëren naar gelang van de soort, het genotype, het geslacht, het celtype of specifieke aspecten van het nucleaire overdrachtsprotocol.4
Hoog mislukkingspercentage
Een belemmering voor het praktische gebruik van technieken met somatische celkerntransplantatie is de lage kans op gekloonde embryo’s; slechts een paar procent van de gereconstrueerde eicellen is altijd in staat zich te ontwikkelen.43 Tot nu toe is het succespercentage bij het klonen van intra species 1%44 , ondanks het gebruik van gezonde en gesynchroniseerde ontvangers en de goede kwaliteit van het gebruikte embryo. Bij de meeste zoogdiersoorten blijft de beoordeling van de morfologie van het embryo de selectiemethode voor de selectie van verschillende bruikbare embryo’s vóór de overdracht. Het is de meest realistische en klinisch bruikbare manier om de levensvatbaarheid van het embryo te bepalen.14 Maar nog steeds de meeste gevallen aanzienlijk verlies van zwangerschap wordt gemeld in de vroege ontwikkelingsstadia ongeveer op de leeftijd van 30-90 dagen van de zwangerschap45 als gevolg van falen van placenta membraan en verminderen placenta vaten ontwikkeling,39 wordt gemeld dat Vroege firste trimester zwangerschap tarieven zijn minder dan 1/2 die normaal verwacht, embryonale verlies is zeer hoog en in de buurt ongeveer 80% miskraam door het tweede trimester bovendien laat dracht hoog niveau van de kans op de ontwikkeling placenta en fatale afwijkingen dan normaal.7 De belangrijkste oorzaken van verlies in het derde trimester zijn hydroallantois en foetale hydrops, die meestal worden toegeschreven aan onvoldoende placentatie.16 Het is ook aanwezig in de literatuur dat verlies van gekloonde foetus is ook te wijten aan hypoxische toestand, omdat in gekloonde dieren aantal placentoom is minder die in staat zijn om minder voedingsstoffen uit te wisselen van moeder naar foetus en maken een ongunstige conditie voor de ontwikkeling van foetus.15
Het hoge percentage zwangerschapsverliezen en neonatale sterfte bij gekloonde kalveren is te wijten aan onvolledige nucleaire herprogrammering; verschillende auteurs hebben overtuigend bevestigd dat de somatische donorcel zodanig wordt geherprogrammeerd dat het expressiepatroon in het blastocyststadium aanzienlijk verschilt van dat van de somatische cel vóór de nucleaire overdracht.46 Volgens Arnold et al.47 expressie van genen die cruciaal zijn voor de normale ontwikkeling van de placenta is misvormd in gekloonde runderembryo’s, en dit veroorzaakt waarschijnlijk een abnormale differentiatie van de trofoblasten en draagt bij tot zwangerschapsverlies. Zelfs de lopende nakomelingen hebben grote placenta’s en een verhoogd geboortegewicht, bekend als het grote nakomelingen syndroom14 , en sommige met een ogenschijnlijk gezond uiterlijk lijden aan immuundisfunctie, wat leidt tot verhoogde sterfte.24
Volgens een rapport van Marfil et al.48 bij gekloonde kalveren Ademhalingsmoeilijkheden 19% en in die toestand stierven kalveren zonder enig ander teken van abnormaliteit. Een vergrote navelstreng 37%, hyper/hypothermie 17% en depressieve/verlengde lighouding 20% zijn de meest voorkomende doodsoorzaken tussen 24 uur en 60 dagen na de geboorte. Problemen die de overlevingskansen van deze kalveren bij of rond de geboorte kunnen verminderen, zijn onder meer de langere draagtijd, ernstige dystocie, onvoldoende ontwikkeling en functie van de placenta, tekortkomingen in de metabolische routes die nodig zijn voor een leven buiten de baarmoeder en bepaalde aangeboren problemen zoals cerebellaire hypoplasie, ademhalingsmoeilijkheden en hartvergroting.4
Het kan normaal zijn dat klonen een andere stressgevoeligheid hebben dan conservatieve dieren, waardoor ze vatbaarder zijn voor ziekteverwekkers, wat ook het sterftecijfer van klonen kan verhogen.23 Om de lage efficiëntie van klonen te overwinnen, zijn verschillende methoden uitgeprobeerd, zoals het gebruik van verschillende soorten donorcellijnen, een verscheidenheid aan kweeksystemen, verschillende fusiemethoden en chemicaliën.35 Sommige van deze onderzoeksinspanningen hebben geleid tot een geringe verbetering van de kwaliteit van gekloonde embryo’s, die nauw samenhangt met de ontwikkeling van het embryo en de productiviteit van het nageslacht.
Ethnics
Het klonen van dieren is de sleutel tot ontwikkeling op het gebied van landbouw en geneeskunde, maar het is alleen aanvaardbaar als de doelen en methoden ethisch gerechtvaardigd zijn en als het onder ethische voorwaarden wordt uitgevoerd. Wetenschappers doen uitgebreid onderzoek naar het klonen van dieren, maar nu rijzen er veel ethische vragen. De opmerkelijke ondoeltreffendheid van klonen vormt een ernstige bedreiging voor het welzijn van dieren.49 Vaak leidt minder dan één procent van de pogingen tot klonen tot een geslaagde geboorte, en van degenen die wel geboren worden, is slechts een relatief klein percentage gezond genoeg om langer dan een paar dagen of weken te leven.35 Volgens een enquête is 64% van de mensen in de VS tegen klonen, omdat ze denken dat het in strijd is met het welzijn van dieren en daarom moreel onjuist is.50
Tijdens het klonen is de pijn die dieren tijdens dat proces lijden het ernstigste ethische gevolg, en daarnaast heeft klonen ook gevolgen voor andere dierenpopulaties. Daardoor kan het klonen van dieren ook ernstige gevolgen hebben voor de mens, omdat het de veiligheid van de voor de voedselproductie gebruikte dieren in gevaar brengt.51 Klonen heeft ernstige gevolgen voor zowel de donor als de ontvanger, omdat bij klonen eerst een operatie wordt uitgevoerd om de eicel bij de donor weg te halen en vervolgens een operatie bij de ontvanger om de eicel te implanteren, waarbij de kans op een doel het kleinst is en bovendien, als het dier de draagtijd met succes heeft voltooid, om onbekende redenen een hoog gewicht van het nageslacht17 nodig is, zodat meestal een keizersnede nodig is, waardoor het dier opnieuw pijn lijdt.
Er zijn ook andere problemen gemeld waarbij dieren pijn lijden en dat is in strijd met het dierenwelzijn, zoals Hydroallantois, de typische fatale aandoening waarbij het drachtige dier zodanig met vocht opzwelt dat het lijkt alsof het op het punt staat te barsten.48 Het is duidelijk dat door kerntransplantatie geproduceerde embryo’s in sommige gevallen kunnen leiden tot een onstabiele ontwikkeling van de foetus en tot een verhoogde incidentie van dystocie, sectio caesarea en perinatale sterfte, wat negatieve gevolgen kan hebben voor de ontvanger en de nakomelingen, en dat al deze zaken samen morele problemen doen rijzen.52 Biodiversiteit is een vangnet dat beschermt tegen de verspreiding van ziekten bij dieren, maar klonen is een poging om één set gewenste genen te fixeren en exacte kopieën van het brondier te maken, wat tegengesteld is aan diversiteit en ook een groot aantal ethische problemen oplevert.53
Voedselveiligheid
Elk land heeft een speciale afdeling die zich bezighoudt met voedselproducten die zijn geproduceerd met behulp van biotechnologie. Biotechnologische producten van dieren moeten echter veiligheidsbeoordelingen ondergaan die worden uitgevoerd voordat het publiek en de overheid het gebruik ervan voor menselijke consumptie accepteren.23 De mogelijkheid van epigenetische fouten die de samenstelling van voedsel kunnen veranderen, is de reden waarom voedingsmiddelen afkomstig van gekloonde dieren een groot obstakel zijn geweest bij het verkrijgen van wettelijke goedkeuring voor de opname van gekloonde producten in de voedselketen. Bovendien bevestigde een voederproef met ratten dat het gebruik van vlees van gekloonde dieren geen effect had op lichaamsgroei, voedselinname, algemene conditie, locomotie, reflexes, seksuele cyclus, urineonderzoek, hematologie, bloedbiochemie of histologie.23 Gezien het feit dat de technologie nog steeds als nieuw en onbekend wordt beschouwd, plus het ontbreken van producten met directe voordelen voor de hedendaagse consument, is het niet schokkend dat de huidige acceptatie laag is. De rijping van de technologie en de beschikbaarheid van dergelijke producten, in combinatie met de vergrijzing van de bevolking in de ontwikkelde westerse wereld, met een sterke wens om langer gezond te blijven, zou de acceptatie echter uiteindelijk kunnen doen toenemen.54