B. B-cel epitopen
We beperken onze bespreking tot B-cel epitopen op eiwitten en peptiden; epitopen op andere biopolymeren en haptenische groepen worden niet behandeld. De eerste belangrijke generalisatie over B-cel epitopen is dat zij gericht zijn tegen drie-dimensionale kenmerken van het moleculaire oppervlak van eiwitten en polypeptiden. Een bepaalde driedimensionale topologie is een kenmerk van B-cel epitopen, in tegenstelling tot T-cel epitopen. Het is waarschijnlijk dat elk aminozuurresidu dat vanaf het oppervlak van een eiwit bereikbaar is, deel kan uitmaken van een of andere B-cel epitoop (Benjamin et al., 1984). Derhalve kunnen eiwitten zeer veel verschillende epitopen bevatten, hoewel om sterische redenen slechts een beperkt aantal antilichamen zich op elk moment aan het antigeen kan binden. De B-cel respons is stereospecifiek, en is veel zwakker tegen d-enantiomeren van peptiden (Gill et al., 1963) en eiwitten (Dintzis et al., 1993), mogelijk omdat d-enantiomere eiwitten niet efficiënt verwerkt worden tot peptiden voor T-cel hulp.
Vroeger werd aangenomen dat eiwitten een goed gedefinieerde antigene structuur hadden, gekarakteriseerd door een beperkt aantal epitopen. Inzicht in de complexe aard van de B-cel immuunrespons en de regulering daarvan, en in de specificiteit van monoklonale antilichamen tegen eiwitten, maakte duidelijk dat een eiwit geen welomschreven antigene structuur bezit. Het is niet mogelijk de “volledige antigene structuur” van een eiwit te definiëren, in tegenstelling tot wat door sommige onderzoekers wordt beweerd (Atassi en Lee, 1978; Atassi, 1984). De antigeniciteit van een eiwit is zowel een eigenschap van de topografie van het eiwit als van regulerende mechanismen van het gastheer-immuunsysteem, waaronder tolerantie voor structuren die lijken op de eigen eiwitten van de gastheer, de specificiteit van T-cel hulp, en idiotypische netwerken (Benjamin et al., 1984; Berzofsky, 1985). Immunodominante plaatsen, d.w.z. plaatsen waarnaar de meeste maar niet alle antilichamen van de immuunrespons gericht zijn, zijn op zichzelf geen intrinsieke eigenschap van het eiwit. Zoals al eerder door anderen is opgemerkt, bestaan epitopen niet op zichzelf, maar alleen krachtens een verbinding met de complementaire antilichaambindingsplaats, de zogenaamde paratoop (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Een epitoop is dus een relationeel begrip, en de definitie van een epitoop is noodzakelijkerwijs operationeel (Van Regenmortel, 1986). Met andere woorden, de definitie van een bepaald epitoop hangt in hoge mate af van de moleculaire geometrie en de chemische aard van het corresponderende paratoop en, misschien nog belangrijker, van de experimentele benadering die wordt gekozen om het epitoop in kaart te brengen.
Deze stand van zaken kan worden geïllustreerd aan de hand van het voorbeeld van het eerste eiwit-antilichaam complex waarvan de structuur werd opgelost door middel van röntgen-kristallografie (Amit et al., 1986). In dit complex maken 16 residuen van lysozym contact met 17 residuen van een monoklonaal Fab (antilichaam fragment) tegen lysozym. De epitoop strekt zich uit over 750 Å2 van het lysozymoppervlak. Daarentegen blijkt uit epitoopkartering met een reeks sequentiegerelateerde aviaire lysozymes dat slechts enkele residuen belangrijk zijn voor de binding van lysozym aan antilysozym-monoklonale antilichamen. Mutatie van zeer weinig residuen kan de associatieconstante van het lysozym-antilichaamcomplex radicaal verlagen (Harper et al., 1987). In één geval verminderde een enkele Arg naar Lys substitutie de affiniteit van lysozym voor een monoklonaal antilichaam met twee orden van grootte (Smith-Gill et al., 1982). Theoretische berekeningen op basis van de kristalstructuren van twee complexen van lysozym met Fab-fragmenten toonden aan dat van de vele residuen die de epitoop in het kristal definiëren, er slechts enkele daadwerkelijk bijdragen aan de stabiliteit van het complex (Novotny et al., 1989). Op basis van hun berekeningen maakten Novotny et al. onderscheid tussen een energetisch epitoop en een passief epitoop. De energetische epitoop omvat de residuen die bijdragen tot de energetica van de binding. De passieve epitoop biedt alleen oppervlakte-complementariteit rond de residuen die de energetische epitoop vormen. Dat slechts enkele van de interacties die in de kristalstructuur te zien zijn een belangrijke rol spelen bij het stabiliseren van het antigeen-antilichaam complex werd bevestigd voor binding van influenza virus neuraminidase aan een monoklonaal antilichaam. Negentien residuen van het neuraminidase maken contact met 17 residuen van het antilichaam in het kristal, maar plaats-specifieke mutatie van slechts 3 residuen heft de binding volledig op (Air et al., 1990; Nuss et al., 1993).
Een meer algemeen toepasbaar operationeel onderscheid van epitopen is dat tussen een contact-epitoop en een functioneel epitoop. De contact-epitoop heeft betrekking op informatie verkregen uit de driedimensionale structuur van het antigeen-antilichaamcomplex; de functionele epitoop heeft betrekking op informatie verkregen uit niet-kristallografische karteringsprocedures, waaronder epitoopkartering met peptiden. Een contact-epitoop wordt voorgesteld door een overeenstemming tussen grote complementaire oppervlakten van antigeen en antilichaam, zoals gezien in verscheidene röntgenstructuren van eiwit-antilichaam complexen (Davies en Padlan, 1990; Wilson en Stanfield, 1994; Braden en Poljak, 1995). Contact-epitopen bestrijken enkele honderden vierkante angstroms van het moleculaire oppervlak. De functionele epitoop definieert residuen die belangrijk lijken voor de binding van antilichamen en waarvan mutatie de binding kan verminderen of geheel opheffen. Het functionele epitoop kan uit slechts 2 tot 3 residuen bestaan, zoals in de hierboven genoemde voorbeelden van lysozym en neuraminidase. Het is niet mogelijk de contact-epitoop af te leiden uit de functionele epitoop. Evenzo onthult de contactepitoop op zichzelf niet de functionele epitoop. Bij het antilichaam kan men ook twee soorten paratopen onderscheiden: een functionele paratoop en een contactparatoop. Dit volgt uit thermodynamische analyse van de complementariteitsbepalende gebieden van een monoklonaal antilichaam (Kelley en O’Connell, 1993).
De dubbele aard van een epitoop zoals die door kristallografische en niet-kristallografische karteringstechnieken wordt onthuld, weerspiegelt twee verschillende modellen van moleculaire herkenning. Op deze manier bezien wordt de moeilijkheid om de aard van epitopen te definiëren verschoven naar het niveau van een epistemologische moeilijkheid: hoe kunnen we de werkelijkheid modelleren met de beperkte experimentele middelen die ons ter beschikking staan? Deze beperkingen zullen in gedachten worden gehouden bij de bespreking van het in kaart brengen van epitopen door peptiden.
Hier moeten we de reeds lang bekende conceptuele indeling van B-cel epitopen in sequentiële en conformationele epitopen vermelden (Sela et al., 1967; Sela, 1969; Atassi en Smith, 1978). Een epitoop wordt sequentieel of continu genoemd als hij kan worden voorgesteld door een reeks aaneengesloten residuen van een polypeptideketen. Van een antilichaam wordt gezegd dat het een sequentieel epitoop herkent als het reageert met een kort, flexibel peptide of met de gedenatureerde, ongevouwen polypeptideketen. Een conformatie-epitoop, ook wel discontinue of topografische epitoop of geassembleerde epitoop genoemd, wordt opgebouwd uit niet-samenhangende delen van de aminozuursequentie door vouwing van de polypeptideketen in het natieve eiwit. Van een antilichaam wordt gezegd dat het een conformatie-epitoop herkent als het reageert met een natief eiwit en niet met de ongevouwen polypeptideketen, of als het reageert met een peptide met een unieke conformatie, bijvoorbeeld een helix, maar niet met een willekeurige spiraal-peptide.
Het onderscheid tussen sequentiële en conformatie-epitopen is enigszins arbitrair en kan misleidend zijn. Omdat elke paratoop een goed gedefinieerde driedimensionale structuur heeft, is de interactie tussen paratoop en epitoop altijd een passen van structuren in de driedimensionale ruimte. Dit geldt zowel voor een epitoop op een goed geordend bolvormig eiwit als voor een epitoop op een kort flexibel peptide. In het laatste geval moet het peptide ook een unieke conformatie aannemen wanneer het bindt met het antilichaam; vandaar dat een continu epitoop ook “conformationeel” is. De bindende conformatie bestaat al of wordt geïnduceerd door de paratoop (zie Secties V,B en V,C).
In het geval van antilichamen tegen natieve eiwitten is gesteld dat de meeste of misschien wel alle epitopen discontinu zijn (Barlow et al., 1986). Vanwege de grote omvang van een typische contact-epitoop in een antigeen-antilichaamkristal is het inderdaad onwaarschijnlijk dat een antilichaam zich uitsluitend bindt aan een aaneengesloten stuk van de polypeptideketen en niet ook aan contactresiduen die in sequentie uit elkaar liggen maar dicht bij elkaar in de ruimte. Ruimtevullende modellen van eiwitten tonen weinig lineaire stroken langer dan 4 tot 5 residuen in directe peptidebinding die toegankelijk zijn op het molecuuloppervlak. Dit wil niet zeggen dat een antilichaam gericht tegen een geassembleerd epitoop op het oppervlak van een eiwit niet ook kan kruisreageren met een peptide dat overeenkomt met een segment van het eiwit.
Ter afsluiting van ons overzicht van de aard van B-cel epitopen, benadrukken we nogmaals de grote moeilijkheid om een algemene definitie van “epitoop” te geven. Een pragmatisch gebruik van operationele definities zal de purist misschien niet bevallen, maar operationele definities kunnen nuttig zijn bij het beantwoorden van vragen over de aard van een bepaalde antigeen-antilichaam interactie.