Tetracycline inducible systems have been used extensively in yeast to study the control of gene transcription in single cells15,16,17,18,19,20,21,22. Om rtTA te gebruiken in deze context, creëerden we twee sterke doxycycline-responsieve promotors met ofwel drie (PTET3) of vier (PTET4) rtTA bindingsplaatsen en gebruikte de geoptimaliseerde rtTA-M2 variant 7 tot de expressie van yeast-enhanced groen fluorescent eiwit (yeGFP) 23 controle van deze promotors (Fig. 1a). De rtTA/PTET-yeGFP expressiecassette werd geïntegreerd in een enkel exemplaar in het gistgenoom. De M2-variant is identiek aan de variant die wordt aangetroffen in ClonTech’s Tet-ON Advanced expressiesystemen.
(a) Schematische weergave van de experimentele opstelling waarbij rtTA-M2 wordt uitgedrukt uit de PMYO2 of PTDH3 constitutieve promotors en yeGFP wordt uitgedrukt uit een tet-responsieve promoter. (b) Doxycycline dosis-afhankelijke activatie van rtTA-M2 uitgedrukt uit PMYO2 of PTDH3 (gemiddelde +/- s.e.m. van drie technische replicaten). AutoFL is wildtype BY4742 gistcellen. (c) Verdelingen van single-cel fluorescentie verkregen uit cellen met de PMYO2-rtTA systeem bij verschillende doxycycline concentraties. Geleidelijk donkerder grijstinten komen overeen met respectievelijk 0,25, 1, 5 en 100 ug/ml doxycycline. AutoFL is wildtype BY4742 gistcellen (d) Samengevoegde helderveld-fluorescentiebeelden van wildtype BY4742 gistcellen of niet-geïnduceerde cellen die het PMYO2-rtTA-systeem dragen.
Het probleem van lekkende doelgen-transcriptie is vooral diepgaand wanneer rtTA op hoge niveaus tot expressie wordt gebracht. Dit wordt geïllustreerd in Fig. 1b die PTET3 doxycycline dosis-respons curves toont wanneer rtTA-M2 wordt uitgedrukt uit de sterke PTDH3 promotor. Fluorescentie was zeer hoog wanneer cellen werden blootgesteld aan verzadigende hoeveelheden doxycycline. Niettemin, als gevolg van lekkende transcriptie van de PTET3 promoter, was het dynamisch bereik van het systeem nogal slecht met de maximale expressie ~17 keer groter bij volledige inductie in vergelijking met de afwezigheid van doxycycline.
Consistent met een model waarin de transactivator een aanzienlijk activeringspotentieel heeft in zijn niet-geïnduceerde toestand, verminderde expressie van rtTA-M2 van de zwakke PMYO2 promoter de fluorescentie aanzienlijk in de afwezigheid van doxycycline. Hoewel volledige verzadiging niet werd waargenomen met dit systeem, de vermindering van de lekke expressie resulteerde in een drastische verbetering van het dynamisch bereik en inductie met doxycycline resulteerde in een ~ 200 voudige toename van de fluorescentie. Echter, ondanks deze verbetering, zowel flowcytometrie gegevens (Fig. 1c) en fluorescentiemicroscopie gegevens (Fig. 1d) aangegeven dat niet-geïnduceerde rtTA-M2 aanzienlijke reporter genexpressie veroorzaakt, zelfs wanneer de transactivator wordt uitgedrukt uit een zwakke promotor.
Tijdens de eerste testen van twaalf klonen die de PTDH3-rtTA-M2 systeem, ontdekten we bij toeval dat een van hen onverwacht lage fluorescentie in de afwezigheid van doxycycline, maar bijna normale fluorescentie bij volledige inductie (Fig. 2a). Daaropvolgende sequentiebepaling identificeerde een enkele nucleotide mutatie, van guanine naar thymine, die een glycine (GGG) verandert in een valine (GTG) op residu 72 binnen het transactivator eiwit. Western blot analyse gaf aan dat deze substitutie geen invloed eiwit overvloed (Fig. 2a, Invoegen, zie aanvullende Fig. S1 voor details) en het reconstrueren van het expressiesysteem bevestigd dat de enkele guanine naar thymine mutatie is verantwoordelijk voor de veranderingen gezien in de doxycycline dosis respons (gegevens niet weergegeven).
Mutatie van glycine 72 in rtTA-M2 verlaagt de basale activiteit tot een niet te detecteren niveau.
(a) Doxycycline-dosisafhankelijke activering van rtTA-M2-varianten, uitgedrukt uit PTDH3 (gemiddelde +/- s.e.m. van drie technische replicaten). AutoFL is wildtype BY4742 gistcellen. In de inzet, een western blot (bijgesneden) het vergelijken van eiwit abundanties van zowel rtTA-M2 en de G72V mutant. Alle monsters werden bereid en uitgevoerd onder identieke experimentele omstandigheden. (b) Verdelingen van de fluorescentie per cel, verkregen uit cellen met het PTDH3-rtTA(G72V)-systeem bij verschillende doxycyclineconcentraties. AutoFL is wildtype BY4742 gistcellen. Geleidelijk donkerder grijstinten komen overeen met respectievelijk 1, 2,5, 5 en 100 μg/mL doxycycline. (c) Samengevoegde helderveld-fluorescentiebeelden van niet-geïnduceerde cellen met de PTDH3-rtTA-M2 of PTDH3-rtTA(G72V) systemen. (d) Cartoon voorstelling van TetR dimer waarin elke protomer is verschillend gekleurd (geel en turquoise). De secundaire structuur is gelabeld en G72 wordt weergegeven als een sphere.
Het PTDH3-rtTA-M2(G72V) systeem heeft een opmerkelijk dynamisch bereik en toonde een ~ 500-voudige toename in fluorescentie-intensiteit wanneer cellen werden geïnduceerd met hoge doxycycline in vergelijking met geen inductie (Fig. 2b). Bovendien is de fluorescentie-emissie gedetecteerd door flowcytometrie niet te onderscheiden van cellulaire autofluorescentie in de afwezigheid van doxycycline en de variant behoudt de graded inductie respons van de oorspronkelijke transactivator. Bovendien was de reporter expressie van de niet-geïnduceerde rtTA-M2(G72V) stam niet detecteerbaar door fluorescentiemicroscopie, zelfs onder instrument instellingen waar de niet-geïnduceerde rtTA-M2 stam een sterk verzadigend signaal gaf (Fig. 2c).
Om inzicht te krijgen in hoe de enkele mutatie zo’n drastische invloed kan hebben op het dynamische bereik van rtTA-M2(G72V), onderzochten we waar het residu zich bevond in de context van de drie dimensionale structuur van het eiwit. De structuur van rtTA-M2 of andere rtTA-varianten is niet opgelost. Daar echter 203 van de 207 aminozuren in het TetR domein van rtTA bewaard zijn gebleven7, geeft de hoge resolutie structuur van TetR24 inzicht in de structuur van het rtTA DNA bindend domein. In de TetR structuur komt het glycine residu 72 voor in een flexibele lus gelegen tussen α-helften α4 en α5, een regio die de brug vormt tussen het repressor DNA bindend domein (α1-α3) en zijn tetracycline bindend gebied (α5-α9)24,25 (Fig. 2d). Dit suggereert dat de substitutie, die een apolaire zijketen introduceert, conformatieveranderingen over een groot bereik teweegbrengt die uiteindelijk de activiteit van de transactivator beïnvloeden, vermoedelijk door de tertiaire structuur te verstarren.
Om deze hypothese te onderzoeken, creëerden we twee extra varianten waarin het glycineresidu in alanine of proline werd gemuteerd. Deze mutaties behouden het apolaire karakter van het valine residu, maar introduceren zijketens van verschillende grootte. Wij verwachtten dat de enkele methylzijketen van alanine minder effectief zou zijn in het voorkomen van niet-geïnduceerde activiteit dan de grote cyclische zijketen van proline. We creëerden ook een β-estradiol induceerbaar expressiesysteem26 om directe controle over rtTA-M2 expressie te krijgen en gebruikten de promotor met een extra TetR bindingsplaats, PTET4, om het vermogen van rtTA om DNA te binden te vergroten. Het expressiesysteem is schematisch weergegeven in (Fig. 3a). We bevestigden door western blot analyse dat de vier rtTA varianten worden uitgedrukt op vergelijkbare niveaus bij volledige β-estradiol inductie (Fig. 3b, zie aanvullende Fig. S2 voor details) en dat de fluorescentie van een stam ontbreekt rtTA heeft reporter expressie die niet te onderscheiden is van een wildtype BY4742 giststam, waaruit blijkt dat er geen achtergrond reporter expressie van PTET4 (Supplementary Fig. S3).
Non-polaire zijketens bij residu 72 is een belangrijke determinant van de basale activiteit.
(a) Schematische weergave van het gennetwerk waarin rtTA-M2-varianten tot expressie komen vanuit een β-estradiol-induceerbare promoter en yeGFP tot expressie komt vanuit een tet-responsieve promoter. (b) Western blot (bijgesneden) het vergelijken van eiwit overvloed van alle vier rtTA varianten wanneer geïnduceerd door 1000 nM van β-estradiol of geen inductie. Alle monsters werden bereid en uitgevoerd onder identieke experimentele omstandigheden. (c) Samengevoegde helderveld-fluorescentie beelden van alle vier rtTA varianten geïnduceerd door 1000 nM β-estradiol met geen doxycycline inductie. (d) De basale activiteit van rtTA varianten als functie van hun β-estradiol-afhankelijke expressieniveau (gemiddelde + / – s.e.m. van drie technische replicaten). In de inzet, histogrammen van reporter expressie voor de verschillende rtTA varianten. (e) Doxycycline dosisafhankelijke activering van rtTA-M2 varianten ubiquitair tot expressie gebracht in 1000 nM β-estradiol (gemiddelde + / – s.e.m van drie technische replicaten).
Zoals verwacht vertoonde de alanine variant een hogere lekkende expressie dan de valine variant en de proline variant had een fluorescentie die niet te onderscheiden was van cellulaire auto-fluorescentie zoals gemeten met flowcytometrie. Dit blijkt uit fluorescentiemicroscopiebeelden verkregen met instrumentinstellingen waarbij de stam die de originele M2 variant bevat een sterk fluorescentiesignaal geeft bij volledige β-estradiol inductie (Fig. 3c) en uit fluorescentiemetingen door flowcytometrie bij variërende β-estradiol inductie (Fig. 3d).
Merkwaardig is dat de aminozuursubstituties die de basale expressie van het reportergen aanzienlijk verminderen een minimaal effect hebben op de rtTA transcriptionele activering bij volledige β-estradiol en doxycycline inductie. Dit wordt geïllustreerd in Fig. 3E, die de dosis-respons curves toont voor de vier G72-M2 varianten gemeten wanneer doxycycline wordt gevarieerd bij volledige β-estradiol inductie. De aminozuursubstituties beïnvloeden echter de gevoeligheid voor doxycycline. In onze experimenten (Fig. 3e), de M2 variant had de hoogste gevoeligheid met een half maximale effectieve concentratie (EC50) van ~ 0,06 ug / ml, terwijl de alanine variant (EC50 van ~ 0,2 ug / ml), de valine variant (EC50 van ~ 1,0 ug / ml) en de proline variant (EC50 van ~ 1.
Om het effect van de G72-mutatie op de gevoeligheid voor doxycycline tegen te gaan, hebben we extra mutaties in het TetR-domein aangebracht, waarvan onlangs is aangetoond dat ze de gevoeligheid voor doxycycline verhogen10,11,27. We onderzochten specifiek het effect van de invoering van de gevoeligheidsverhogende (SE) mutaties V9I, F67S, F86Y en R171K.
Figuur 4A,B tonen aan dat de SE-mutaties de doxycyclinegevoeligheid van de SE-G72P en SE-G72A rtTA M2-varianten verbeteren. Wanneer de rtTA varianten worden uitgedrukt op hoge niveaus van de volledig geactiveerde β-estradiol induceerbare promotor (Fig. 3a), de invoering van de SE-mutaties vermindert de doxycycline EC50 van ~ 1,5 ug / ml tot ~ 0,1 ug / ml voor de G72P variant (Fig. 4a) en van ~ 0,2 ug / ml tot ~ 0,02 ug / ml voor de G72A variant (Fig. 4b). Dit effect trad op zonder een merkbare verandering in reporter expressie onder volledige doxycycline inductie en niet in gevaar brengen van het dynamisch bereik van de SE-G72P variant. Interessant is echter dat de SE-mutaties een aanzienlijk verlies van dynamisch bereik veroorzaakten voor de SE-G72A-variant door de expressie van het reportergen te verhogen in afwezigheid van doxycycline.
De gevoeligheid voor doxycycline van de nieuwe rtTA-varianten kan worden verbeterd door de toevoeging van gevoeligheidsverhogende mutaties.
(a,b) Doxycycline dosisafhankelijke activering van rtTA-varianten die ubiquitair tot expressie komen in 1000 nM β-estradiol (gemiddelde +/- s.e.m. van drie technische replicaten). (c-f) Heatmaps tonen reporter expressie (Arbitraire eenheden) als functie van β-estradiol-afhankelijke transactivator expressie en doxycycline inductie.
Om de relatie tussen het niveau van rtTA-expressie, doxycycline EC50 en basale activiteit verder te onderzoeken, onderzochten we het effect op de expressie van reportergenen van het gelijktijdig variëren van β-estradiol en doxycycline-inductie. We onderzochten vier verschillende M2 varianten; de oorspronkelijke variant, de oorspronkelijke variant met de SE mutaties, de G72P variant en de SE-G72P variant.
Het tweedimensionale dosis-respons oppervlak voor de oorspronkelijke M2 variant bevat drie verschillende regio’s van reporter expressie die corresponderen met lage, intermediaire en hoge reporter genexpressie. Deze regio’s zijn aangeduid met I, II en III in Fig. 4c-f. Regio III is waar de expressie van het reportergen maximaal is, wat afhangt van zowel het expressieniveau van rtTA als het inductieniveau van doxycycline. Regio II is waar de expressie relatief hoog is, zelfs wanneer de inductie met doxycycline laag is. In regio I is de expressie laag als gevolg van een laag β-estradiol of een lage inductie met doxycycline.
Alleen de SE-mutaties (Fig. 4d) verhogen de expressie in een deel van regio I en de gehele regio II dramatisch. Dit bevestigt dat deze mutaties de gevoeligheid kunnen verhogen in een smal bereik van rtTA expressieniveaus, maar ook een aanzienlijke verhoging van de activiteit van rtTA veroorzaken in de niet-geïnduceerde toestand. Daartegenover staat dat de G72P-mutatie alleen (Fig. 4e) de expressie van de reporter in de hele regio II en in een deel van regio III drastisch vermindert. Dit bevestigt dat het ingrijpende effect van deze mutatie op de rtTA activiteit in de niet-geïnduceerde toestand geassocieerd is met een algemeen verlies van doxycycline gevoeligheid.
Figuur 4f toont het effect van de combinatie van de SE en de G72P mutaties. Vergeleken met de SE-variant (fig. 4d) gaat de toevoeging van de G72P-mutatie de toename van de expressie van de reporter, veroorzaakt door de SE-mutaties in regio I, tegen en vermindert de expressie van de reporter tot ondetecteerbare niveaus in deze regio. In vergelijking met de G72P-variant (fig. 4e) herstelt de toevoeging van de SE-mutaties bovendien het verlies van expressie van de reporter in regio III bijna volledig. Met andere woorden, de gevoeligheid wordt verbeterd zonder dat lekkende expressie van het doelgen op enig transactivator expressieniveau wordt geïntroduceerd.