Chromosoomanalyse en CMA zijn klinisch bruikbare diagnostische instrumenten voor het opsporen van chromosomale afwijkingen in het gehele menselijke genoom. Momenteel wordt CMA aanbevolen als de eerstelijns test voor verstandelijke beperkingen en aangeboren afwijkingen, en vervangt daarmee de vroegere rol van chromosomenanalyse. In deze studie vergeleken we de resultaten van chromosomenanalyse en CMA in 3.710 gevallen om de waarde van het uitvoeren van chromosomenanalyse te bepalen.
- Maximale detectie van mozaïcisme door een combinatie van CMA en traditionele cytogenetische analyse
- Chromosomale structurele informatie wordt verstrekt door chromosoom analyse, maar niet duidelijk door CMA
- Ogenschijnlijk gebalanceerde herschikkingen met een normale CMA-studie
- Evidence-gebaseerde strategie voor efficiënte detectie van chromosoomafwijkingen
Maximale detectie van mozaïcisme door een combinatie van CMA en traditionele cytogenetische analyse
Deze studie toonde aan dat 1,2% (43/3.710) van de patiënten een mozaïek bevinding had. Mozaïcisme werd alleen waargenomen door chromosomenanalyse in 39% van de gevallen vanwege ofwel een zeer laag (<10%) of zeer hoog (>80%) percentage abnormale cellen terwijl 12% van de gevallen alleen door CMA werden gedetecteerd. De resterende 49% van de gevallen werd zowel door CMA als door chromosomenanalyse gedetecteerd.
De detectie van mozaïcisme door CMA en die door chromosomenanalyse verschillen door het verschil in technologie en geanalyseerde celpopulatie. Bij CMA wordt DNA geanalyseerd uit alle cellen met een kern in perifeer bloed, inclusief meerdere cellijnen. Chromosomenanalyse wordt daarentegen hoofdzakelijk uitgevoerd op T-lymfocyten die gestimuleerd zijn met fytohemagglutinine. Studies hebben aangetoond dat CMA gevoeliger kan zijn wanneer abnormale cellen niet reageren op mitogenen en/of afwijkingen zeldzaam of afwezig zijn in T-cellen, zoals bij het Pallister-Killian-syndroom.5,6 Vijf gevallen van mozaïek trisomie, waarbij chromosomen 8, 9, 14 en 22 betrokken waren, werden alleen door CMA gedetecteerd.
Hoewel CMA gemakkelijk mozaïcisme kan detecteren bij niveaus van 30% of meer, is het beperkt in het routinematig detecteren van mozaïcisme bij niveaus van <10%.6,13,14 Andere array-platforms, zoals single-nucleotide polymorphism arrays, zijn wellicht beter in staat mozaïcisme te detecteren door de informatie die wordt verkregen uit de B-allel frequenties.15,16 Chromosoomanalyse kan laaggradig mozaïcisme detecteren door het individueel onderzoeken van grote aantallen cellen. Standaard chromosoomonderzoek van 20 cellen sluit 14% mozaïcisme uit met een betrouwbaarheidsniveau van 95%. Meer cellen kunnen worden onderzocht wanneer één of twee abnormale metafasecellen worden geïdentificeerd. De analyse van veel afzonderlijke cellen is echter tijdrovend en arbeidsintensief. Als mozaïcisme wordt vermoed of bevestigd, kan FISH worden gebruikt om honderden individuele cellen in de interfase te onderzoeken om het niveau van mozaïcisme te bepalen; FISH is relatief minder tijdrovend dan chromosomenanalyse.
De door CMA gemiste afwijkingen, de schijnbaar gebalanceerde herschikkingen niet meegerekend, maken <0,2% uit van het totaal aantal gevallen in deze studie ( Tabel 2 ). De meeste gevallen waren niet detecteerbaar door CMA omdat het aandeel abnormale cellen onder de detectiegrens van CMA lag (<10%). De klinische betekenis is onduidelijk voor het zeer lage niveau mozaïcisme in de gevallen 2 en 3, en het kleine markerchromosoom dat uitsluitend pericentromerische herhaalreeksen bevat in geval 4. De overige door CMA gemiste afwijkingen zijn geassocieerd met fenotypische afwijkingen. Het is niet duidelijk waarom de afwijking die in 30% van de gekweekte cellen in geval 5 werd gezien, door CMA werd gemist, maar het is vermoedelijk te wijten aan het feit dat de abnormale cellen specifiek in de T-cellen oververtegenwoordigd zijn. De aanwezigheid van twee verschillende cellijnen met genomische winsten en verliezen in dezelfde regio leidde tot een netto genomisch evenwicht voor die regio, waardoor detectie door CMA werd vermeden, zoals in geval 6.
Detectie van mozaïcisme door CMA berust op de afwijking van de verwachte logaratio’s voor deletie of duplicatie zonder mozaïcisme. Het vermoede mozaïcisme moet worden bevestigd door chromosomenanalyse op gekweekte cellen of FISH-analyse, bij voorkeur met behulp van bloeduitstrijkjes. In 11 hier bestudeerde gevallen kon met CMA de chromosoomafwijking worden gedetecteerd, maar kon niet worden aangetoond dat het om mozaïcisme ging vanwege een laag percentage normale cellen of de aanwezigheid van een isodicentrisch chromosoom dat tot segmentale tetrasomie leidt. In twee gevallen bijvoorbeeld werd door alle probes voor chromosoom 18 door CMA een toename van het kopiegetal vastgesteld ( figuur 2 ), wat trisomie 18 suggereert. In werkelijkheid bleek uit chromosoomanalyse dat één geval trisomie 18 in alle cellen had ( figuur 2a ), terwijl het andere geval mozaïcisme voor trisomie 18 in 80% van de cellen had ( figuur 2b ). Bovendien, wanneer twee of meer abnormale cellijnen betrekking hebben op dezelfde regio, zoals geïllustreerd in het geval in figuur 2c , chromosoom en/of FISH analyse is essentieel voor een juiste interpretatie van de chromosoom afwijkingen.
Chromosomale structurele informatie wordt verstrekt door chromosoom analyse, maar niet duidelijk door CMA
CMA geeft zeer betrouwbare informatie over de vraag of kopie getal winsten en verliezen aanwezig zijn, maar geeft geen positionele of oriëntatie informatie. Onze studies toonden aan dat structurele afwijkingen werden gezien in 18% van de abnormale CMA gevallen. De helft van de in deze studie geïdentificeerde structurele herschikkingen zijn onevenwichtige translocaties/inserties, een derde zijn andere structurele veranderingen zoals ringchromosomen, markerchromosomen, isochromosomen en isodicentrische chromosomen, en de resterende 15% zijn complexe herschikkingen. Aangezien de meeste van deze structurele afwijkingen subtelomere regio’s betreffen, hebben terminale kopiegetalveranderingen een grotere kans op verdere structurele afwijkingen.17 In het algemeen kunnen met zowel chromosoomanalyse als FISH-analyse translocaties, inserties, isochromosomen en markers worden geïdentificeerd, waarbij voor elke methode de kracht verschilt. Hoewel FISH veranderingen kan detecteren die te klein zijn om door chromosomenanalyse te kunnen worden gedetecteerd, geeft analyse van chromosoombandpatronen aanvullende informatie over de betrokken regio’s. In het geval van complexe herschikkingen kan een combinatie van FISH en chromosomenanalyse nodig zijn om de complexe structurele veranderingen volledig vast te stellen. Met deze uitzondering is FISH-analyse na een abnormale bevinding door CMA meestal toereikend om informatie te verschaffen over de aard van de kopiegetalverandering.
Sommige chromosomale herschikkingen kunnen zelfs na zowel CMA als FISH worden gemist. Bijvoorbeeld, een interstitiële deletie in 2q werd gedetecteerd door CMA in geval 9 ( figuur 1a ). Zonder chromosomenanalyse lijkt de herschikking een eenvoudige enkele deletie te zijn, zelfs na bevestigende FISH-analyse. Onderzoek van het karyotype toonde echter een abnormaal chromosoom 2 met een insertie van een segment van 17q23.1q23.3 in band 2p11.2. Bovendien heeft het chromosoom 2 met het ingebrachte 17q-segment ook een pericentrische inversie tussen 2p12 en 2q31.1. De deletie op 2q31.1 gedetecteerd door CMA is waarschijnlijk opgetreden op of nabij het inversie breekpunt op de lange arm van één chromosoom 2. Samenvattend had casus 9 een complexe herschikking met een deletie op 2q die met CMA kon worden vastgesteld maar niet zichtbaar was bij chromosomenanalyse, evenals een insertie en een inversie waarbij chromosomen 2 en 17 betrokken waren, die met chromosomenanalyse konden worden vastgesteld maar niet met CMA. Evenzo had geval 10 de novo herschikkingen waarbij vier chromosomen betrokken waren, inclusief een insertie van het 2q14.2q24.1 segment aan de korte arm van één chromosoom 6, dat ook een paracentrische inversie heeft, en een wederkerige translocatie tussen de chromosomen 12 en 18. Copy number verliezen werden geïdentificeerd door CMA in de buurt van de breekpunten in chromosomen 2 en 6 ( figuur 1b ). Een juiste diagnose vereist de combinatie van CMA en chromosomenanalyse.18
Identificatie van chromosomale structurele herschikkingen is onontbeerlijk voor genetische counseling van de familie. De door CMA gedetecteerde genomische onevenwichtigheden kunnen het gevolg zijn van een onevenwichtig segregatieproduct van een gebalanceerde translocatie of insertie bij één ouder en vormen daarom een sterke aanbeveling voor het uitvoeren van ouderschapsonderzoek. Bovendien geeft de chromosomale structurele informatie een richtsnoer voor welke ouderschapsstudies moeten worden aanbevolen. Voor de herschikkingen die waarschijnlijk producten van een gebalanceerde herschikking zijn, moet ouderlijke FISH of chromosoomanalyse worden uitgevoerd in plaats van ouderlijke CMA.
Ogenschijnlijk gebalanceerde herschikkingen met een normale CMA-studie
In deze studie werden in 30 gevallen (~0,8%) enkele ogenschijnlijk gebalanceerde translocaties of inversies zonder andere chromosoomafwijkingen gedetecteerd door chromosoomanalyse. Er is gerapporteerd dat ~40% van de patiënten met meerdere aangeboren afwijkingen/mentale retardatie en een de novo schijnbaar gebalanceerde translocatie cryptische afwijkingen in de buurt van de breekpunten hebben, of niet gerelateerd aan de breekpunten, die gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd door CMA.19,20 CMA detecteerde echter geen kopiegetal veranderingen in de buurt van de breekpunten in deze 30 gevallen. Verschillende factoren kunnen aan deze waarneming bijdragen. De meeste herschikkingen werden geërfd op basis van de ouderlijke studies van een subset van de gevallen, wat betekent dat de kans groter is dat ze “echt” gebalanceerd zijn. Bovendien werden Robertsoniaanse translocaties, die gewoonlijk niet resulteren in kopienummerveranderingen van euchromatine, in deze studie opgenomen maar in de gepubliceerde studies uitgesloten. Bovendien kunnen kleine cryptische deleties/duplicaties naast de breekpunten worden gemist omdat de arrays die voor de meeste van deze gevallen werden gebruikt, doelgericht waren en niet voldoende genomische resolutie hadden om een onbalans te detecteren.
Hoewel de meerderheid van gebalanceerde herschikkingen goedaardig is, zijn de novo herschikkingen geassocieerd met een hoger ziekterisico als gevolg van een cryptische deletie of duplicatie, gen- of enhancerverstoring, positie-effecten, of epigenetisch effect. Het risico op een ernstige aangeboren afwijking voor de novo reciproke translocaties en inversies is 6,7%.21 Het risico zal naar verwachting lager zijn voor die gevallen met een normale KMA met behulp van een volledig genoom array. Daarom is het minder waarschijnlijk dat de eenvoudige gebalanceerde herschikkingen die in deze studie zijn gedetecteerd de oorzaak zijn van de fenotypen van de patiënten.
Evidence-gebaseerde strategie voor efficiënte detectie van chromosoomafwijkingen
Om te bepalen of en wanneer chromosoomanalyse moet worden uitgevoerd voor de klinische diagnose van chromosoomafwijkingen, hebben we de resultaten onderzocht van gevallen die gelijktijdig door zowel CMA als chromosoomanalyse zijn onderzocht. Chromosomale afwijkingen die door chromosomenanalyse werden gedetecteerd maar door CMA volledig werden gemist, werden in ~1% van de gevallen waargenomen, waaronder schijnbaar gebalanceerde herschikkingen in 0,8% gevallen en onevenwichtigheden geassocieerd met mozaïcisme in 0,16% gevallen. Bovendien vergemakkelijkte chromosoomanalyse de detectie van chromosomale structurele herschikkingen in 18% van de gevallen met abnormale CMA resultaten.
Hoewel CMA informatie verschaft over kopie-aantal variatie en mozaïcisme, verschaft alleen chromosoomanalyse of FISH de chromosomale structurele informatie die geassocieerd is met deze kopie-aantal veranderingen en identificeert het sommige gevallen van mozaïcisme die niet door CMA zijn gedetecteerd. Voordelen van FISH boven chromosoomanalyse is dat kleine (<3-10 Mb) veranderingen in het aantal kopieën kunnen worden gedetecteerd en dat een groot aantal kernen snel kan worden geanalyseerd, wat vooral nuttig is voor de evaluatie van mozaïcisme. Daarom kan na een abnormale KMA eerst FISH-analyse worden toegepast om structurele herschikkingen op te sporen die geassocieerd zijn met veranderingen in het kopienummer en om mozaïcisme te bevestigen en het percentage abnormale cellen te bepalen. Wanneer inserties of translocaties door FISH worden gedetecteerd, kan chromosomenanalyse aangewezen zijn om de betrokken chromosomen te bepalen. In plaats van de standaardchromosomenanalyse, waarbij 20 cellen uit twee culturen in de metafase worden onderzocht, volstaat een kleinschalige chromosomenanalyse van vijf cellen uit één cultuur voor dit doel. Met deze strategie kunnen alle structurele veranderingen worden gedetecteerd, met uitzondering van enkele zeldzame complexe herschikkingen.
Bij gevallen met een normaal resultaat bij CMA kan een volledige chromosomenanalyse worden overwogen als de patiënt meerdere aangeboren afwijkingen, dysmorfe kenmerken en/of mentale retardatie heeft die doet denken aan een chromosomaal syndroom of klinische verschijnselen die wijzen op mogelijk mozaïcisme, zoals pigmentafwijkingen die willekeurig zijn verdeeld of die de lijnen van Blashko volgen en asymmetrie in de groei in combinatie met een verstandelijke handicap. Op basis van deze studie zou ~1% van de gevallen informatieve chromosoomresultaten hebben, maar <0,001 van de gevallen (3/3.710) zou een klinisch significante bevinding hebben.
Samenvattend bevestigt onze studie verder dat bijna alle chromosomale afwijkingen die met chromosomenanalyse kunnen worden opgespoord, door CMA worden gedetecteerd, wat de aanbeveling ondersteunt dat CMA de eersterangs test is. Traditionele cytogenetische analyse blijft echter nuttig voor de detectie van mozaïcisme en de karakterisering van structurele herschikkingen.