O genoma do lagarto do anole verde e uma análise comparativa com aves e mamíferos

A linhagem amniote dividida em linhagens ancestrais de mamíferos e répteis ∼320 milhões de anos atrás. Hoje, os membros sobreviventes dessas linhagens são mamíferos, compreendendo ∼4,500 espécies, e répteis, contendo ∼17,000 espécies. Dentro dos répteis, os dois maiores clades divergiram ∼280 milhões de anos atrás: os lepidossauros, que contém lagartos (incluindo cobras) e o tuatara; e os arcossauros, contendo crocodilianos e aves (a posição das tartarugas permanece pouco clara)6. Para simplificar, vamos nos referir aqui aos lepidossauros como lagartos (Fig. 1).

O estudo dos principais eventos genômicos que acompanharam a transição para um ciclo de vida totalmente terrestre foi auxiliado pelo sequenciamento de vários mamíferos (K.L.-T. et al., manuscrito submetido) e três genomas de aves2,3,4. O genoma do lagarto A. carolinensis preenche assim uma importante lacuna na cobertura de amniotas, dividindo o ramo longo entre mamíferos e aves e permitindo uma análise evolutiva mais robusta dos genomas amniote.

Por exemplo, quase todos os genomas reptilianos contêm microcromossomos, mas estes só foram estudados em nível de seqüência em aves2,7, levantando a questão se as características peculiares de seqüência dos microcromossomos aviários são universais entre os microcromossomos reptilianos8. Outro exemplo é o estudo da evolução dos cromossomos sexuais. Quase todos os mamíferos placentários e marsupiais compartilham cromossomos sexuais homólogos (XY)9 e todas as aves compartilham os cromossomos sexuais ZW. No entanto, os lagartos exibem determinação sexual genética ou dependente da temperatura10. A caracterização dos cromossomos sexuais de lagartos permitiria o estudo de cromossomos sexuais previamente desconhecidos e a comparação de sistemas de cromossomos sexuais independentes em espécies intimamente relacionadas.

Anolis lagartos compreendem um clade diversificado de ∼400 espécies descritas e distribuídas ao longo dos Neotropicais. Estes lagartos têm irradiado, muitas vezes de forma convergente, em uma variedade de nichos ecológicos com adaptações morfológicas correspondentes, fornecendo um dos melhores exemplos de radiação adaptativa. Em particular, a sua diversificação em múltiplos nichos replicados em diversas ilhas do Caribe através de competição interespecífica e seleção natural tem sido documentada em detalhe11. A. carolinensis é o único anjo nativo dos EUA e pode ser encontrado desde a Flórida e Texas até a Carolina do Norte. Nós escolhemos esta espécie para sequenciamento genômico porque é amplamente utilizada como modelo de réptil para ecologia experimental, comportamento, fisiologia, endocrinologia, epizootia e, cada vez mais, genômica.

O genoma do anole verde foi sequenciado e montado (AnoCar 2.0) usando DNA de uma fêmea de A. carolinensis lagarto (Tabelas Suplementares 1-4). A hibridação in situ da fluorescência (FISH) de 405 clones de cromossomos artificiais bacterianos (BAC) (de um macho) permitiu que os andaimes de montagem fossem ancorados aos cromossomos (Tabela Suplementar 5 e Suplementar Fig. 1). O genoma A. carolinensis foi relatado como tendo um cariótipo de n = 18 cromossomos, compreendendo seis pares de macrocromossomos grandes e 12 pares de microcromossomos pequenos12. O esboço da seqüência do genoma é de 1,78 Gb em tamanho (ver Tabela Suplementar 3 para estatísticas de montagem) e representa um intermediário entre as montagens do genoma de aves (0,9-1,3 Gb) e mamíferos (2,0-3,6 Gb).

Nós descobrimos que poucos rearranjos cromossômicos ocorreram nos 280 milhões de anos desde que o anole e a galinha divergiram, como foi sugerido por comparações anteriores usando Xenopus e galinha13. Existem 259 blocos sintéticos (definidos como âncoras sintéticas consecutivas que são consistentes na ordem, orientação e espaçamento, com uma resolução de 1 Mb) entre lagarto e galinha (Tabela Suplementar 6 e Suplementar Fig. 2). Curiosamente, 19 dos 22 cromossomos de galinha ancorados são cada um sinténico para um único cromossomo A. carolinensis em todo o seu comprimento (Fig. 2a); em contraste, apenas 6 (de 23) cromossomos humanos são sinténicos para um único cromossomo opossum em todo o seu comprimento, mesmo que a espécie tenha divergido apenas 148 milhões de anos atrás14. As duplicações segmentares seguem as tendências observadas em outros genomas amniote (Nota Complementar, Tabela Complementar 7 e Fig. 3).

Aproximadamente 30% do A. carolinensis é composto por elementos móveis, que compreendem uma variedade muito maior de famílias de repetição ativa do que a observada para os genomas de aves2 ou mamíferos15. As classes mais ativas são elementos longos intercalados (LINE) (27%) e elementos curtos intercalados (SINE) (16%)16 (Tabela Suplementar 8). A maioria das repetições LINE pertencem a cinco grupos (L1, L2, CR1, RTE e R4) e parecem ser inserções recentes baseadas na sua semelhança de sequência (a divergência varia de 0,00-0,76%; ref. 17). Isto contrasta com as observações de genomas de mamíferos, onde apenas uma única família de LINEs-L1 – tem predominado durante dezenas de milhões de anos. As transposições de DNA compreendem pelo menos 68 famílias pertencentes a cinco superfamílias: hAT, Chapaev, Maverick, Tc/Mariner e Helitron18. Tal como acontece com os retrotransposões, a maioria das famílias de transpositores de DNA parece ser relativamente jovem, em contraste com os extremamente poucos transpositores de DNA recentemente ativos encontrados em outros genomas amniote (Tabela Suplementar 9). Em geral, os elementos móveis de A. carolinensis apresentam um conteúdo significativamente maior de GC (43,5%, P < 10-20) do que a média de 40,3% de todo o genoma. Além dos elementos móveis, A. carolinensis exibe uma alta densidade (3,5%) de repetições tandem, com distribuições de comprimento e frequência similares às do DNA humano por microsatélite15. Sabemos agora que os genomas amniote vêm em pelo menos três tipos: os genomas dos mamíferos são enriquecidos para elementos L1 e têm um alto grau de acumulação de elementos móveis, os genomas das aves são repetidamente pobres com muito pouca actividade de elementos móveis, enquanto que o genoma dos lagartos contém uma diversidade extremamente grande de famílias de elementos móveis activos mas tem uma baixa taxa de acumulação, que é reminescente do perfil de elementos móveis dos peixes teleosteanos19.

Os genomas dos répteis contêm microcromossomas, mas os números variam entre as espécies; o genoma A. carolinensis contém 12 pares de microcromossomas12, enquanto que o genoma da galinha contém 28 pares. Os microcromossomos de aves têm propriedades muito distintas em comparação com os macrocromossomos de aves, tais como GC mais alto e conteúdo de repetição mais baixo2, enquanto os microcromossomos de lagartos não exibem estas características (Fig. 2b). Notavelmente, todas as sequências ancoradas a microcromossomos em A. carolinensis também se alinham a microcromossomos no genoma da galinha, e todos os microcromossomos de A. carolinensis, exceto um, são sintéticos a apenas um único microcromossomo correspondente de galinha (Fig. 2a). Microcromossomos conservados entre A. carolinensis e galinha assim poderiam ter surgido no ancestral réptil, enquanto os microcromossomos de galinha restantes poderiam ser derivados na linhagem da ave. Alternativamente, os microcromossomos de galinha remanescentes poderiam estar presentes no ancestral do réptil, mas fundidos para formar macrocromossomos na linhagem de lagarto.

O genoma A. carolinensis tem surpreendentemente pouca variação regional do conteúdo de GC, substancialmente menor do que o observado anteriormente para aves e mamíferos; é o único genoma amniótico conhecido cuja composição de nucleotídeos é tão homogênea quanto o genoma da rã5 (Figuras Suplementares 4 e 5). A figura 3 ilustra como o conteúdo local de GC é conservado evolutivamente entre o cromossomo 14 humano e o cromossomo 5 de galinha, mas em muito menor grau com o cromossomo A. carolinensis 1. Como todos os genomas amniote sequenciados que não A. carolinensis contêm estes níveis homólogos de conteúdo de GC (‘isochores’)20, a heterogeneidade do amniote ancestral GC é susceptível de ter corroído para a homogeneidade na linhagem deste lagarto. Tem sido proposto que os isócoros com alto conteúdo de GC são consequência de maiores taxas de conversão de genes tendenciosos para GC em regiões de maior recombinação2. A maior homogeneidade de GC no genoma anole pode assim refletir taxas de recombinação mais uniformes, ou então um viés substancialmente reduzido para GC durante a resolução dos eventos de conversão gênica na linhagem A. carolinensis (para uma discussão, ver ref. 5).

Tanto a determinação do sexo dependente da temperatura como a determinação genética do sexo XY foram encontradas em Iguania10. Dentro do gênero Anolis, existem espécies com cromossomos XY heteromórficos (incluindo aqueles com múltiplos cromossomos X e Y), e outras com cromossomos totalmente homomórficos12. A. carolinensis é conhecida por ter determinação genética do sexo21, mas a forma de seus cromossomos sexuais (ZW ou XY) tem sido até agora desconhecida devido à falta de cromossomos obviamente heteromórficos.

No exame profundo das células masculinas e femininas usando FISH nos permitiu identificar o microcromossomo previamente designado como ‘b’ como o cromossomo A. carolinensis X; ele está presente em duas cópias em fêmeas e uma em machos. Este cromossoma é sinténico ao microcromossoma 15 da galinha. Onze BACs atribuídos a dois andaimes, 154 (3.3 Mb) e chrUn0090 (1.8 Mb), hibridizar via FISH para os braços p dos dois cromossomas X em fêmeas, e hibridizar para o braço p do único cromossoma X em machos (Fig. 4 e Suplementar Fig. 1). A. carolinensis mostra assim um padrão representativo de um sistema heterogamético masculino de determinação do sexo genotípico. Nós não identificamos o cromossomo Y, mas nós colocamos a hipótese de que A. carolinensis possui ambos os cromossomos X e Y, já que tanto células masculinas quanto femininas contêm o mesmo número de cromossomos.

Os 5,1 Mb de sequência atribuídos ao cromossoma X contêm 62 genes codificadores de proteínas (Tabela Suplementar 10); os termos da Ontologia Genética (GO) associados a estes genes não mostram enriquecimento significativo. É muito provável que exista mais sequência de cromossomas X que é actualmente rotulada como andaimes não ancorados na montagem do AnoCar 2.0. A identificação do gene de determinação sexual A. carolinensis irá requerer uma biologia funcional considerável, mas notamos que o gene de determinação sexual DMRT1 está localizado no cromossomo A. carolinensis 2 e que o SOX3 (o paraleato cromossômico X do gene SRY de determinação sexual de mamíferos therian) está localizado em um andaime não ancorado de A. carolinensis; estes genes são assim improváveis de ser o gene de determinação sexual A. carolinensis.

Todos os dez A. carolinensis (originários da Carolina do Sul e do Tennessee) usados para o mapeamento FISH mostraram grandes inversões pericentroméricas em um ou mais cromossomos 1-4, sem correlação entre diferentes inversões cromossômicas ou com o sexo do lagarto (ver Nota Complementar, Tabela Complementar 11 e Fig. Complementar. 6).

Um total de 17.472 genes codificadores de proteínas e 2.924 genes RNA foram previstos a partir do conjunto do genoma A. carolinensis (Ensembl release 56, setembro de 2009). Nós construímos uma filogenia para todos os genes A. carolinensis e seus homólogos em oito outras espécies de vertebrados (humano, rato, cão, gambá, ornitorrinco, galinha, zebra finch e pufferfish), permitindo-nos identificar um conjunto conservador de 3.994 ortologues um-para-um, ou seja, genes que não foram duplicados ou apagados em nenhum desses vertebrados desde seu último ancestral comum. Estas filogenias de genes também foram utilizadas para identificar genes que surgiram por duplicação na linhagem do lagarto após a divisão com a linhagem aviária e, separadamente, aqueles que foram perdidos na linhagem mamífera após a divisão mamífero-reptil (Fig. 1, Nota Complementar, Fig. Complementar. 7 e Quadro Suplementar 12).

Encontramos 11 genes A. carolinensis opsina que não possuem ortologues de mamíferos (mas possuem ortologues em invertebrados, peixes e sapos), e assim parecem ter sido perdidos durante a evolução dos mamíferos (Quadro Suplementar 13). O grande repertório de opsinas pode contribuir para a excelente visão cromática das palmilhas – incluindo a capacidade de ver na gama ultravioleta – e também pode contribuir para a sua hiperdiversidade ao permitir a evolução da coloração diversificada e específica da barbela, que tem um papel importante na selecção sexual e reconhecimento de espécies11. Da mesma forma, os genes olfatórios e da queratina β são altamente duplicados em A. carolinensis (Nota Complementar e Fig. 9 Suplementar).

Muitos répteis, incluindo as palmilhas verdes, diferem dos mamíferos placentários por serem ovíparos (ovos de postura). O vivíparo nos mamíferos placentários é um estado derivado, reflectido na perda de alguns genes relacionados com os ovos. Usamos a espectrometria de massa para identificar proteínas presentes no ovo imaturo A. carolinensis, já que a maioria das proteínas do ovo são produzidas no corpo da mãe e depois transportadas para o ovo imaturo. Descobrimos que, em contraste com os mamíferos, os répteis têm duplicações de genes específicos da linhagem, inclusive em vitelogeninas (VTGs), apovitellenina-1, ovomucina-α e três homólogos da ovocalyxin-36, uma proteína da matriz da casca do ovo da galinha.

Nossos resultados mostram uma rápida evolução dos genes da proteína do ovo entre as amniotas. Especificamente, encontramos proteínas de 276 genes de A. carolinensis em ovos imaturos de A. carolinensis (Tabelas Suplementares 14 e 15), dos quais apenas 50 foram confirmados como presentes em ovos de galinha por espectrometria de massa22,23. Estes genes incluem VTGs, uma lisozima, proteína da camada externa da membrana vitelina 1 (VMO1) parálogos, inibidores da protease, natterina e nothepsina. Alinhando genes que são ortologues um-para-um em A. carolinensis e galinha, descobrimos que as proteínas do ovo evoluem significativamente mais rapidamente do que as proteínas não ovo (valores médios de dN/dS (razão da taxa de substituições não-sinônimas para a taxa de substituições sinônimas) de 0,186 e 0,135, respectivamente; P = 1.2 × 10-5), o que reflete seleção purificadora reduzida e/ou episódios mais freqüentes de evolução adaptativa.

Usando sequências múltiplas de genoma de vertebrados, identificamos três parálogos VMO1 (que denominamos α, β e γ) que inferimos ter estado presentes no último ancestral comum de todos os répteis e mamíferos. Enquanto pelo menos um dos parálgrafos VMO1-α, VMO1-β e VMO1-γ foi perdido em todos os outros genomas amniote, o genoma A. carolinensis contém representantes de todos os três parálgrafos. Além disso, a família A. carolinensis específica VMO1-α cresceu para 13 membros e experimentou uma seleção positiva de substituições de aminoácidos dentro de uma cavidade de carga negativa, provavelmente substrato de ligação; mudanças que, presumivelmente, modificam sua atividade de transferência lisozima (Nota Complementar, Fig. 8 e Tabelas Suplementares 16 e 17).

O extenso e ativo repertório de repetição de A. carolinensis nos permitiu descobrir a origem de vários elementos conservados de mamíferos. Através do processo de exaptação (uma grande mudança na função de uma sequência durante a evolução), certos elementos móveis que eram activos no antepassado amniote tornaram-se conservados, e presumivelmente funcionais, em mamíferos, enquanto que os elementos móveis activos permanecem em A. carolinensis. A origem destas sequências conservadas de mamíferos em elementos móveis não era reconhecível sem comparação com uma sequência genómica distante e rica em repetições24. Identificamos 96 elementos exaptados (ver Tabela Complementar 18) no rastreamento do genoma humano até elementos móveis presentes nos ancestrais amniote que ainda estão presentes em A. carolinensis, particularmente nas famílias CR1, L2 e ciganos.

Embora a maioria dos elementos exaptados sejam não codificadores e provavelmente sirvam a uma função reguladora, também identificamos um exon codificador de proteína que foi exaptado de uma LINE tipo L2, agora constituindo o exon 2 em uma região N-terminal específica de mamíferos da proteína MIER1 (mesoderme indução resposta precoce 1). Este exon é altamente conservado em 29 mamíferos e portanto provavelmente representa uma inovação mamífera desde o ancestral amniote.

termos associados ao local de início da transcrição mais próximo de cada elemento exaptado no genoma humano mostram enriquecimento para genes de desenvolvimento neurológico (ver Métodos), com “ligação do receptor de efrina”, “desenvolvimento do sistema nervoso” e “transmissão sináptica” sendo fortemente enriquecidos (todos os valores de P < 5 × 10-3). Esse enriquecimento é consistente com as mudanças adaptativas no neurodesenvolvimento que ocorrem durante a emergência dos mamíferos.

Anolis lagartos são um caso exemplar de radiação adaptativa, tendo se diversificado independentemente em cada ilha nas Grandes Antilhas e em toda a Neotropia, produzindo uma grande variedade de espécies ecologicamente e morfologicamente diferenciadas, com até 15 encontradas em uma única localidade11. Embora as janelas sejam amplamente utilizadas como um sistema modelo para estudos comparativos filogenéticos, tem sido difícil determinar as relações evolutivas entre as grandes clades anulares devido às rápidas radiações evolutivas associadas ao acesso a novas dimensões de oportunidade ecológica. A resolução com sucesso dos eventos de ramificação relativamente curtos associados a tal radiação requer uma riqueza de dados de loci evoluindo a um ritmo apropriado.

Utilizamos a sequência genómica de A. carolinensis para desenvolver um novo conjunto de dados filogenómicos composto por 20 kb de dados de sequência amostrados nos genomas de 93 espécies de anoles (Tabelas Suplementares 19 e 20). As análises deste conjunto de dados inferem uma filogenia bem suportada que reforça e esclarece o histórico adaptativo e biogeográfico das palmilhas (Fig. 5, detalhes na Fig. 10 Suplementar). Em primeiro lugar, a nossa análise filogenómica reafirma estudos moleculares e morfológicos anteriores, indicando que especialistas em habitat de anuros semelhantes evoluíram independentemente em cada uma das quatro grandes ilhas da Grande Antilina. Em segundo lugar, as nossas análises sugerem um cenário biogeográfico complexo envolvendo um número limitado de eventos de dispersão entre ilhas e uma extensa diversificação in situ dentro das ilhas. Os parentes mais próximos de Anolis ocorrem no continente e a filogenia confirma a existência de duas colonizações, uma no sul das Antilhas Menores e a segunda produzindo as diversas radiações adaptativas em todo o resto do Caribe. Dentro deste último clade, as anoles inicialmente diversificaram-se principalmente nas duas maiores ilhas da Grande Antilhas (embora Porto Rico também pareça ter estado envolvido), antes de posteriormente sofrerem radiações secundárias em todas as ilhas e eventualmente regressarem ao continente, onde esta colonização de volta produziu uma extensa radiação evolutiva. A filogenia também indica que muito poucos eventos de dispersão inter-ilhas ocorreram na evolução da Grande Antilina. Pelo contrário, as faunas das Grandes Antilhas, conhecidas pela extensão em que os mesmos ecomorfos são encontrados em cada ilha, são principalmente o resultado da evolução convergente25.

A sequência genómica de A. carolinensis permite uma compreensão mais profunda da evolução do amniote. O preenchimento deste importante nó reptiliano com um genoma sequenciado revelou estados derivados em cada ramo principal do amniote e ajudou a iluminar o ancestral do amniote. Entretanto, a árvore de genomas de répteis sequenciados ainda é extremamente esparsa, e o sequenciamento de outros répteis não-aviosos seria necessário para entender completamente quão típicos são os genomas de A. carolinensis e os genomas de aves sequenciadas de todo o clade de répteis.

Além da utilidade da sequência do genoma de A. carolinensis como um representante dos répteis não-avios, as espécies de Anolis são um recurso único para o estudo da radiação adaptativa e da evolução convergente. Com as suas invasões e subsequentes radiações nas ilhas das Caraíbas, as anolis fornecem um análogo terrestre aos peixes stickleback e ciclídeos, que sofreram evolução adaptativa em ambientes aquáticos separados. Tal como a investigação genómica em sticklebacks aprofundou o estudo da especiação ecológica aquática, um levantamento filogenético genómico em grande escala das janelas caribenhas seria uma oportunidade para o estudo detalhado da evolução adaptativa num animal terrestre26; em particular porque os genomas anulares contêm um grande número de elementos móveis activos que especulamos que poderiam formar substratos para a exaptação de novos elementos reguladores.