Characterization of the anti-inflammatory Lactobacillus reuteri BM36301 and its probiotic benefits on aged mice

Characterization of probiotic lactic acid bacteria

Od lat izolujemy bakterie kwasu mlekowego (LAB) z różnych źródeł, w tym od ludzi, zwierząt, roślin i produktów spożywczych. Te kolekcje Benebios Microorganisms (BM) składają się z ponad 500 szczepów, których potencjał probiotyczny ujawnił się już podczas wstępnych badań przesiewowych. W tym badaniu wybraliśmy cztery ludzkie szczepy komensalne pochodzące z próbek kału i poddaliśmy je szczegółowym badaniom (Tabela 1). Były to dwa szczepy Lactobacillus reuteri (BM36301 i BM36304), szczep L. gasseri (BM33601) i szczep Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BM10307).

Badaliśmy bakterie pod względem ich ogólnych kwalifikacji jako probiotyków (Tabela 1). Po pierwsze, te szczepy BM wykazały odporność na kwasy (pH 2,5) i sole żółci (0,3%), wykazując zakres przeżywalności od 43% do 98,5% po 1 h traktowania w temperaturze 37 °C, co jest dość wysokim wynikiem. Następnie przetestowaliśmy aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii jelitowych. Podczas gdy L. gasseri BM33601 wykazywał minimalną inhibicję szczepu testującego E. coli, wszystkie pozostałe tworzyły wyraźne strefy inhibicji (0,5-3 mm od brzegów LAB). Te efekty inhibicyjne są zwykle powodowane przez bakteriocyny, kwasy organiczne (kwas mlekowy lub octowy), nadtlenek wodoru lub etanol z LAB. Wreszcie, sprawdziliśmy ich zdolność do wiązania się z ludzkimi komórkami nabłonka jelitowego (IECs) in vitro. W tym celu hodowaliśmy ludzkie komórki raka jelita grubego, HT-29, na szkiełkach nakrywkowych przez 15 dni i nakładaliśmy na nie żywe kultury LAB przez 1 h (Metody). Po obfitym płukaniu, pozostałe komórki bakteryjne były wizualizowane przez barwienie metodą Grama i liczone pod mikroskopem. Szczepy L. reuteri BM36301 i BM36304 wykazały wysokie wyniki retencji (5,5-7,4 bakterii na HT-29), podczas gdy L. gasseri BM33601 miał umiarkowane (1,7 bakterii na HT-29) i B. animalis subsp. lactis BM10307 miał niskie (0,3 bakterii na HT-29) wyniki. Silniejsze przyleganie LAB do IECs jest szczególnie ważne, ponieważ muszą one pozostać w warstwie błony śluzowej jelita wystarczająco długo, aby korzyści mogły zadziałać na gospodarza. Z tych pierwotnych eksperymentów, dwa szczepy L. reuteri wykazały wyższy potencjał jako wysokiej jakości probiotyki.

Regulacja produkcji TNF-α przez bakterie kwasu mlekowego in vitro

Postanowiliśmy zbadać LAB pod kątem ich potencjału do tłumienia zapalenia jelit. W tym celu zaadaptowaliśmy system hodowli tkankowych in vitro, w którym ludzkie komórki mieloidalne (THP-1) wydzielają TNF-α po aktywacji ich receptorów Toll-podobnych (TLR) przez lipopolisacharyd bakteryjny (LPS). Najpierw sprawdziliśmy, że komórki THP-1 w liczbie 5 × 104 w 1 ml hodowli traktowane LPS w dawce 150 ng/ml przez 3,5 h zwykle powodowały produkcję 200-300 pg/ml TNF-α (ryc. 1a, paski 1 i 2). Następnie zbieraliśmy supernatanty z hodowli bakteryjnych hodowanych przez 24 h, suszyliśmy je próżniowo i rekonstytuowaliśmy medium kondycjonowane (CM) (Metody). CM zawiera złożone aktywności zarówno tłumiące, jak i indukujące TNF-α, w zależności od LAB i warunków hodowli. Rzeczywiście, zaobserwowaliśmy niewielką produkcję TNF-α przez CMs z BM36304 i BM36301 bez LPS, ale ta ilość była mniejsza niż 20% indukcji stymulowanej LPS (dane nie pokazane). Wreszcie, dodaliśmy każdy CM do 5% hodowli THP-1 (v/v) w obecności LPS (Rys. 1a, pasy 3-6). Produkcja TNF-α z LPS (208 ± 49 pg/ml, pas 2) została stłumiona do 40% przez CM z L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, pas 3) i do 52% przez CM z B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, pas 6). Dla naszych celów przesiewowych uznaliśmy, że tłumienie ekspresji TNF-α bliskie lub mniejsze niż 50 % przez traktowanie LPS jest przeciwzapalne. Jednakże, CMs z L. reuteri BM36304 i L. gasseri BM33601 nie były w stanie stłumić produkcji TNF-α do tego stopnia. Zweryfikowaliśmy tę obojętną aktywność poprzez przygotowanie tych CMs w różnych warunkach hodowlanych (dane nie pokazane).

Następnie zbadaliśmy zdolność indukcji TNF-α przez same komórki bakteryjne, ponieważ składniki komórkowe bakterii Gram dodatnich mogą indukować odpowiedzi zapalne . W tym celu hodowaliśmy bakterie do fazy wykładniczej (16 h), następnie zbieraliśmy, przemywaliśmy i dodawaliśmy te żywe komórki bakteryjne w nadmiarze (250-krotna liczba komórek) do hodowli THP-1. Aktywność metaboliczna komórek bakteryjnych była minimalizowana przez antybiotyki dodawane do podłoża THP-1. Po 6 h inkubacji dokonano ilościowego pomiaru wydzielanego TNF-α (ryc. 1b). Mimo, że wszystkie cztery komórki LAB indukowały TNF-α, to BM36301 produkował znacznie mniejszą jego ilość (609 pg/ml) niż pozostałe: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml) i BM10307 (7141 pg/ml). Podczas tej 6-godzinnej koinkubacji zaobserwowaliśmy, że komórki THP-1 doświadczały różnej śmierci komórkowej w zależności od zastosowanego LAB (plik dodatkowy 1). Przede wszystkim BM36301, najniższy induktor TNF-α, powodował najmniejszą śmierć komórek THP-1 (9,7%), podczas gdy inne szczepy o wyższej indukcji TNF-α powodowały znacznie większą śmierć (24-38%). Nie jest więc tak, że BM36301 indukował niski poziom TNF-α z powodu utraty żywotności THP-1 per se. Dla naszych celów przesiewowych, uznaliśmy LAB z aktywną produkcją TNF-α powyżej 1000 pg/ml za prozapalne.

Podsumowując, aktywności immunomodulacyjne in vitro zostały przypisane jako przeciwzapalne z supresyjnymi CM (BM36301 i BM10307) i prozapalne z indukcyjnymi żywymi komórkami (BM36304, BM33601, i BM10307). Ponieważ BM10307 wykazywał obie aktywności, przypisaliśmy mu podwójną funkcjonalność (ryc. 1c). Interesujące było to, że dwa szczepy L. reuteri wykazywały różną aktywność. Z początkowego przeglądu naszych szerokich kolekcji BM, szczepy przeciwzapalne okazały się być raczej rzadkie, z odsetkiem odkryć mniejszym niż 5% (dane nie pokazane). Również niektóre szczepy nie wykazywały żadnej z aktywności, zaliczając się tym samym do kategorii „neutralnych” (dane nie pokazane).

Cząsteczki supresyjne w CM są stabilne wobec ciepła i trypsyny

Ponieważ CM z LAB składa się z różnych metabolitów bakteryjnych, jak również składników komórkowych, staraliśmy się lepiej zrozumieć przeciwzapalną naturę CM. Ekspresja TNF-α zmniejszała się ilościowo wraz ze wzrostem stężenia CM z L. reuteri BM36301 (ryc. 2a) i B. animalis subsp. lactis BM10307 (ryc. 2b). Co ciekawe, mniejsza ilość CM z BM36301 (0,5× wejście lub 2,5% v/v) faktycznie indukowała TNF-α dalej, co jest zgodne z obserwacją, że ta CM zawiera materiały indukujące TNF-α w pewnym stopniu (Rys. 2a, paski 2 i 3). Niemniej jednak, efekty supresyjne stawały się dominujące w obliczu większych ilości CM, co sugeruje, że substancje przeciwzapalne są ilościowo addytywne, a odpowiadające im receptory na powierzchni komórek THP-1 są wystarczająco liczne, aby łatwo reagować na rosnące traktowanie CM. Ogólnie rzecz biorąc, te obserwacje sugerują, że CM zawierają aktywne metabolity odpowiedzialne za supresję TNF-α, pomimo ich złożonej natury.

Badaliśmy dalej właściwości fizykochemiczne materiałów przeciwzapalnych w CMs. Gotowanie CMs z każdego szczepu przez 10 min okazało się nieefektywne w zmianie ich funkcji hamujących TNF-α w porównaniu z natywnymi CMs (Fig. 2c, ścieżki 3 i 4). Podobnie, traktowanie trypsyną nie miało wpływu na ich aktywność (Rys. 2c, pas 5). Obserwacje te sugerują, że głównymi czynnikami hamującymi w tych CMs nie są ani białka, ani cząsteczki wrażliwe na ciepło.

Regulacja TNF-α u myszy za pomocą bakterii probiotycznych

Ostatnim pytaniem dotyczącym regulacji TNF-α in vitro w oparciu o nasze badania LAB było to, na ile będzie to istotne w zastosowaniach in vivo. Bezpośrednio staraliśmy się odpowiedzieć na to pytanie poprzez zastosowanie wybranych szczepów L. reuteri w modelu mysim. Przygotowaliśmy 20-tygodniowe myszy inbredowe C57BL/6, po 6 samców i 8 samic w każdej grupie. Następnie przez okres 20 tygodni, jedna grupa była leczona przeciwzapalnym BM36301, inna grupa była leczona prozapalnym BM36304, a grupa kontrolna była leczona dekstrozą (Metody). W celu zminimalizowania cierpienia zwierząt, kultury LAB były podawane w wodzie pitnej, aby spełnić dzienną dawkę konsumpcyjną 1 × 106 bakterii na mysz. Zapewniliśmy również standardową dietę, aby proces starzenia przebiegał w tym okresie w sposób naturalny. Pod koniec 20-tygodniowej inkubacji (łącznie 40 tygodni życia) dokonaliśmy eutanazji myszy i po jej zakończeniu pobraliśmy krew w celu przygotowania surowicy do pomiaru cytokin i testosteronu metodą ilościową ELISA. Po przeprowadzeniu sekcji zwłok nie stwierdzono żadnych poważnych nieprawidłowości morfologicznych.

Podsumowując, zaobserwowaliśmy zmniejszenie stężenia TNF-α w surowicy z przeciwzapalnym BM36301, z wyraźniejszym efektem obserwowanym u samic. Prozapalny BM36304 prowadził do wzrostu TNF-α u mężczyzn, ale nie u kobiet. Wyniki te sugerują, że nasze badania in vitro mają znaczenie dla utrzymania TNF-α in vivo w tych badaniach na myszach.

L. reuteri BM36301 utrzymywał zmniejszony przyrost masy ciała i wysoki testosteron u samców myszy

Starzenie się jest źródłem wielu problemów zdrowotnych u ludzi, w tym cukrzycy i otyłości. W celu zaostrzenia tych problemów związanych ze starzeniem się w modelu zwierzęcym, często stosuje się diety wysokotłuszczowe. Jednakże, interpretacja tych przyspieszonych eksperymentów może być skomplikowana, ponieważ żadne starzenie się u ludzi nie powinno być napędzane przez celową dietę wysokotłuszczową. Wszystkie myszy hodowaliśmy na standardowej diecie, aby ich proces starzenia się był jak najbardziej naturalny. W czasie 20-tygodniowego eksperymentu, począwszy od wieku 20 tygodni, samce grupy kontrolnej przybrały na wadze około 8 g (7,83 ± 1,2 g), a samice grupy kontrolnej przybrały na wadze około 5 g (4,8 ± 0,94 g). Zwraca uwagę fakt, że przyrost masy ciała samców karmionych przeciwzapalnym preparatem BM36301 był istotnie niższy niż w grupie kontrolnej (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040) o 36% (ryc. 4a, paski 1 i 2). Natomiast przyrost masy ciała samców leczonych BM36304 (7,53 ± 0,74 g) nie różnił się istotnie od kontroli (p = 0,67). Przyrosty masy ciała w grupach samic nie różniły się statystycznie od siebie.

Inną istotną różnicą był poziom insuliny w surowicy od samców leczonych BM36304 (ryc. 4b). Podczas gdy w grupie kontrolnej mężczyzn stwierdzono 3,18 ± 0,65 ng/ml insuliny, w grupie mężczyzn karmionych BM36304 stwierdzono 4,91 ± 0,63 ng/ml insuliny (p = 0,027). Jednakże, zgodnie z odkryciem, że przyrost masy ciała w tej grupie nie różnił się znacznie od kontroli (ryc. 4a), nie zaobserwowaliśmy bardziej widocznego nagromadzenia tłuszczu brzusznego u samców leczonych BM36304 (dane nie pokazane). W wieku 40 tygodni, skok insuliny mógł nie spowodować klinicznie widocznej cukrzycy u myszy, ale choroba mogła stać się bardziej wyraźna, jeśli myszy dalej się starzały. Zmienność insuliny między grupami samic nie różniła się znacząco od siebie.

Na koniec skupiliśmy się na poziomach testosteronu u samców. Jak pokazano na ryc. 4c, samce karmione przeciwzapalnym BM36301 zachowały znacznie wyższy poziom testosteronu w surowicy (5,18 ± 0,87 ng/ml) niż grupa kontrolna (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). Jednakże, grupa leczona BM36304 nie różniła się statystycznie (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) od grupy kontrolnej. W celu lepszego zrozumienia wyników testosteronu, zbadaliśmy jądra każdej myszy. Masa sparowanych jąder samców karmionych BM36301 wynosiła 0,579 ± 0,075 g, o 10% więcej niż masa jąder samców kontrolnych (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Biorąc pod uwagę mniejszy przyrost masy ciała w grupie BM36301 (Rys. 4a), ta różnica wielkości jąder jest bardziej widoczna; stosunek masy jąder do przyrostu masy ciała (TW/WG) w grupie kontrolnej wynosił tylko 67% tego w grupie BM36301. Nie udało się jednak zaobserwować różnic mikroskopowych w tkankach jąder, takich jak średnica kanalików nasiennych pomiędzy tymi dwiema grupami (156,03 ± 6,65 μm kontroli vs. 153,95 ± 18,66 μm samców leczonych BM36301, p = 0,51). Nie przeprowadziliśmy innych badań, takich jak porównanie spermatogenezy lub obszaru komórek Leydiga.

Podsumowując, przeciwzapalny BM36301 pomógł samcom utrzymać niższy przyrost masy ciała z większymi jądrami i większą ilością testosteronu w miarę ich starzenia się. Zmniejszona produkcja testosteronu u starzejących się samców została zaproponowana jako związana z zależnymi od wieku zmianami w jądrach, przypuszczalnie w wyniku obrażeń zapalnych. Tymczasem prozapalny BM36304 wywołał wzrost insuliny, choć bez zmian w przyroście masy ciała lub testosteronu wśród mężczyzn. Co ciekawe, żaden z tych szczepów bakteryjnych nie miał znaczącego wpływu na te wskaźniki ciała u samic myszy.

Zdrowa skóra samic dzięki przeciwzapalnemu BM36301

Jedną z interesujących cech niektórych probiotyków jest to, że mogą one promować zdrowie skóry w sposób zależny od regulacji immunologicznej. Ponieważ BM36301 wykazał również działanie przeciwzapalne in vitro i in vivo, zadaliśmy pytanie, czy ten szczep może wywołać takie korzyści zdrowotne w skórze. W 18. tygodniu leczenia ogoliliśmy obszar na 2 myszach z każdej grupy i zbadaliśmy je po 1 tygodniu. Co ciekawe, samice myszy karmione BM36301 wykazywały szybsze odrastanie włosów, choć nie pełne odzyskanie, w miejscu ogolonym (ryc. 5a). W przeciwieństwie do tego, grupy kontrolne lub BM36304 nie wykazywały tak szybkiego tempa regeneracji. Żaden z leczonych mężczyzn nie wykazywał odrastania włosów wyraźnie szybciej niż kontrola, co wskazuje, że ten przyspieszony wzrost włosów może być oczywisty tylko u kobiet. Inną metryką oceny zdrowia skóry jest badanie połysku sierści. Jednakże, nie zaobserwowaliśmy znaczących różnic pomiędzy każdą grupą poprzez pomiary sensoryczne lub światłomierzem, głównie z powodu stosunkowo błyszczącego futra w kontroli (dane nie pokazane).

Dalej ocenialiśmy zdrowie skóry, badając przekroje skóry pod mikroskopem po zabarwieniu Hematoksyliną i Eozyną. Jak pokazano na ryc. 5b i c, stwierdziliśmy, że samice myszy poddane działaniu BM36301 wykazywały wyższą liczbę podskórnych mieszków włosowych (HF) niż samice myszy kontrolnych. Liczby HF na widok mikroskopowy w rozdzielczości 400× wynosiły 3,50 ± 0,52 dla grupy samic kontrolnych, podczas gdy liczby wynosiły 4,80 ± 0,61 od samic karmionych BM36301 z istotną różnicą (p = 0,023). Natomiast u samic leczonych BM36304 zaobserwowano jedynie niewielką zmianę (4,15 ± 1,73, p = 0,55 vs. kontrola). Po bardziej szczegółowej analizie mieszków włosowych stwierdziliśmy, że samice karmione BM36301 wykazywały marginalnie bardziej aktywne etapy cyklu włosowego niż kontrola (anagen + katagen: telogen wynosił 81:19 z kontroli vs. 95: 5 z samic karmionych BM36301). Tymczasem liczba HF z grup męskich nie różniła się znacznie od siebie (ryc. 5b). Wreszcie, oceniliśmy również grubość skóry mierzoną jako głębokość od naskórka do panniculus carnosus (ryc. 5c, plik dodatkowy 1). Nie mogliśmy znaleźć dużej różnicy w głębokości między kontrolą a samicami leczonymi BM36301. Jednakże, warstwy skórne myszy karmionych BM36301 okazały się nieznacznie głębsze niż kontrolne, a tkanka tłuszczowa z myszy leczonych BM36301 była płytsza niż ta z kontroli. Większość podskórnych HF znajdowała się w skórze właściwej.

Ogółem, obserwacje te sugerują, że leczenie przeciwzapalne BM36301 sprzyjało zdrowszej skórze, o czym świadczy odrastanie włosów i liczba HF u samic. Jednak mikroskopowe różnice w próbkach skóry między grupą kontrolną a grupą BM36301 wydawały się raczej marginalne. Te korzyści dla zdrowia skóry nie były obserwowane u mężczyzn. Również prozapalny BM36304 nie powodował żadnych negatywnych skutków na skórze w czasie eksperymentów.