Produkcja płciowa identycznych genetycznie organizmów jest znana jako klonowanie. Polega ono na podziale pojedynczego embrionu, przy czym geny jądrowe i niewielka liczba genów mitochondrialnych są „identyczne”, lub może obejmować transfer jądrowy, w którym to przypadku tylko geny jądrowe są „identyczne”. Po wielu latach zmagań w 1995 roku naukowcy sklonowali dwa jagnięta „Megan i Morag” w „Roslin Institute” w Szkocji, które zostały sklonowane z komórek pochodzących z wczesnego embrionu1. Później pojawiły się informacje, że w wyniku klonowania urodziło się kilka jagniąt. W lutym 1997 roku po 277 próbach sklonowano jagnię o nazwie „Dolly”, którego długość życia była znacznie dłuższa niż innych sklonowanych jagniąt.2 Sklonowanie Dolly zwiastowało rozpoczęcie nowego okresu w rolnictwie z możliwością ochrony i szybkiego rozmnażania wybranych genotypów.3 Do tej pory wiele zwierząt zostało sklonowanych poprzez transfer jądrowy u ssaków takich jak owce, kozy, bydło, króliki, myszy.4 Klonowanie ma wiele zastosowań i ułatwia szybkie rozmnażanie pożądanych zwierząt, rozmnażanie zwierząt transgenicznych, ukierunkowane zmiany genetyczne u zwierząt domowych oraz ochronę zagrożonych gatunków.1 Jednak niektóre z tych kwestii są nadal nierozwiązane, jak np. kwestie etyczne i moralne oraz niskie wskaźniki powodzenia transferu jądra komórki somatycznej z powodu błędów epigenetycznych wynikających z niedokładnego programowania jądra,5 wszystkie te czynniki ograniczyły satysfakcję i możliwość zastosowania klonowania w rolnictwie.
Ograniczenie klonowania wynika ze złożonej interakcji wielu powodów, takich jak dobrostan zwierząt i brak zaufania do długoterminowego zdrowia sklonowanego zwierzęcia.6 Podczas stosowania techniki klonowania większość pozornie dobrej jakości embrionów nie rozwija się w czasie ciąży lub po urodzeniu.7 Niepowodzenie w przeprogramowaniu przekazanego jądra jest główną przyczyną niepowodzenia, ponieważ jest ono ważne dla prawidłowego wzorca ekspresji genów, który ma wystąpić podczas późniejszej embriogenezy.8 Przeprogramowanie musi nastąpić w krótkim czasie, w innym kontekście komórkowym w porównaniu z normalnym rozwojem i jest podatne na błędy. Istnieje coraz więcej danych dokumentujących odchylenia w przeprogramowaniu epigenetycznym.9
Odsetek niepowodzeń klonowania jest bardzo wysoki,10 wiele sklonowanych embrionów może rozwinąć się do stadium preimplantacji, ale zdecydowana większość nie doprowadzi do zdolnej do życia ciąży.11 Pomimo stosowania zdrowych, płodnych, synchronicznych samic jako biorczyń, odnotowano, że 50% strat następuje we wczesnym okresie pierwszego trymestru, a około 80% poronień ma miejsce w drugim trymestrze, głównie z powodu nieprawidłowości łożyska.12 Według badań przeprowadzonych na krowach i owcach, najbardziej dramatyczny okres utraty płodu przypada na czas przyczepiania się łożyska.4 Po zakończeniu ciąży sklonowane zwierzęta mają większe trudności z przystosowaniem się do życia pozamacicznego,13 wyglądają jak normalne, ale są genetycznie inne, a różnice te wynikają z nieprawidłowości epigenetycznych nabytych podczas przeprogramowania jądrowego.10 U klonowanych zwierząt stwierdza się wiele nieprawidłowości w okresie ciąży i noworodków,12 co może być spowodowane nieregularną ekspresją i prawdopodobnie niepełnym przeprogramowaniem genów imprinted.14 Według innych doniesień różnice wynikają z nieprawidłowości w długości telomerów, ekspresji genów lub wzorców metylacji.4
Kolejnym problemem stwierdzanym u klonowanych zwierząt są nieprawidłowości łożyskowe. Według wielu naukowców wczesna śmierć embrionu spowodowana jest słabym rozwojem łożyska. U klonowanych zwierząt odnotowano nieprawidłowy rozwój błony alontoicznej i zmniejszony rozwój łożyskowych naczyń krwionośnych, liczba łożysk jest znacznie mniejsza u klonowanych zwierząt15 i wydaje się, że zdolność łożyskowej wymiany gazowej jest znacznie zmniejszona, ponieważ u sklonowanych płodów w późnej ciąży stwierdzono niedotlenienie.16
Postnatalna żywotność sklonowanego potomstwa jest niższa u sklonowanych zwierząt, ale zależy to od zwierzęcia.17 W okresie postnatalnym głównie cielęta wykazywały problemy z oddychaniem18 , układem krążenia, układem kostnym i centralnym układem nerwowym.7 Potencjalne skutki błędów epigenetycznych na skład klonowanych zwierząt, dlatego bezpieczeństwo produktów spożywczych pochodzących miał główną przeszkodę w uzyskaniu zatwierdzenia regulacyjnego do wejścia do łańcucha żywnościowego.
Anomalie epigenetyczne
Epigenetyka oznacza „badanie mitotycznie i / lub mejotycznie dziedzicznych zmian w funkcji genu, które nie mogą być wyjaśnione przez zmiany w sekwencji DNA.19 Zgodnie z teorią klon i zwierzę dawca powinny mieć ten sam genom, ale nie jest prawdopodobne, że sklonowane ssaki okazjonalnie wykazują anomalie rozwojowe z powodu błędów epigenetycznych.20 Czasami przerost łożyska i płodu określany jako „syndrom dużego potomstwa „15 , inne anomalie, w tym zaburzenia oddychania, poważne nieprawidłowości w układzie krążenia i powiększenie narządów są powszechnie obserwowane u klonowanych przeżuwaczy21 , dlatego możliwość zastosowania klonowania w rolnictwie jest bardzo ograniczona.22
Praktycznym wynikiem jest to, że istnieje wiele sklonowanych zwierząt, które zachowują się i wydają się normalne, podczas gdy bliższe badania ujawniły, że nawet niektóre z tych pozornie normalnych zwierząt różnią się subtelnie od naturalnie wyprodukowanej populacji.23 W przypadku klonowania, gdy komórka somatyczna jest przenoszona od dawcy do biorcy, jądro komórki somatycznej musi zostać szybko przeprogramowane, aby mogło przyjąć nowe życie komórki embrionalnej.24 W każdym przypadku, gdy komórka nie jest w stanie przeprogramować się lub przeprogramowanie jest niekompletne, prowadzi to do przerwania rozwoju i prawdopodobnie nieśmiertelnych anomalii w klonach, które przeżyły.4 Niektóre geny ulegają prawidłowej ekspresji w sklonowanych embrionach, np. ważne enzymy metaboliczne, ale ekspresja innych genów jest w większości nieprawidłowa, co wpływa na przyszłe życie klonu. W takim stanie większość klonów najwyraźniej doświadczyła prawidłowej ciąży i okresu noworodkowego, perspektywy na normalne życie wydają się dobre, ale rozwój łożyska i środowisko wewnątrzmaciczne dla wielu klonów jest suboptymalne i samo to może wpływać na ich zdrowie w późniejszym życiu.25
Metylacja DNA odgrywa ważną rolę w ekspresji genów, które kontrolują rozwój zwierząt.5 Stwierdzono, że błędy epigenetyczne dotyczą przede wszystkim wzorców metylacji DNA i organizacji chromatyny w klonowanych zarodkach.19 Często wzorzec metylacji DNA w komórkach dawcy jest utrzymywany podczas rozwoju przed implantacją14, co prowadzi do przeprogramowania efektu i powoduje nieprawidłowe łożysko.26 To drugi ważny powód niskiego wskaźnika urodzeń.24
Placenta abnormalities
Placenta jest głównym organem kontaktu matczyno-płodowego, odgrywa istotną rolę w utrzymaniu ciąży i utrzymuje płód poprzez spełnianie pozytywnego podziału składników odżywczych i krytycznych funkcji endokrynologicznych. Przeżycie i rozwój płodu w czasie ciąży zależy od prawidłowego rozwoju morfologicznego i funkcjonalnego łożyska. Klonowanie zawsze wiąże się z nieprawidłowościami łożyskowymi, a wskazaniami na niewydolność łożyska w ciążach z przeniesieniem jądra są takie anomalie jak zespół dużego potomstwa, zmienione białka błon łożyskowych i płodowych, zwiększona masa łożyska oraz powiększenie i obrzęk łożyska u bydła.27 Hydroallantois zostało sklasyfikowane przez Farina jako typ II zespołu nieprawidłowego potomstwa w tym patologicznym stanie łożyska zwiększa się ilość płynu płodowego i stwarza trudności w lokalizacji płodu w obrębie rogu macicy.27
We wczesnej ciąży sklonowanych zwierząt śmiertelność płodów jest bliska 80%26 , co jest głównie spowodowane nieprawidłowym funkcjonowaniem i niedorozwojem łożyska.15 Typowo, u bydła, 50-70% ciąż w 50. dniu jest traconych przez resztę ciąży i aż do jej zakończenia z powodu braku łożyskowego unaczynienia i miejsc przyczepu, które są ważne dla wymiany składników odżywczych i zapobiegają niedotlenieniu płodu.7 W trzecim trymestrze ciąży u krów z płodami sklonowanymi odnotowano również pewne nieprawidłowości łożyskowe, takie jak obrzęk i wodogłowie, których prawdopodobieństwo wystąpienia wynosi około 45%.28 Wodogłowie najczęściej obserwuje się pomiędzy 150 a 180 dniem ciąży sklonowanej.28 Według badań dysfunkcja i powiększenie łożyska może być spowodowane białkami łożyska, które wykazały nadmierną ekspresję TIMP-229 , ale według innych może to być spowodowane zmianą ekspresji genów w trofoblaście sklonowanych łożysk.30
Trudności w porodzie
Obecnie klonowanie generalnie ma niską efektywność, co wynika z wielu czynników, takich jak przeprogramowanie jądra, różnicowanie komórek dawcy i sytuacja oocytu.31 Okres przeprogramowania jest kluczowym etapem dla optymalizacji klonowania.32 W tym czasie, jeśli przeprogramowanie nie odbywa się prawidłowo, prowadzi to do nieprawidłowości epigenetycznych i zwiększa śmiertelność. a sklonowane somatycznie cielęta są widocznie cięższe niż klony embrionalne33 , co również jest przykładem nieprawidłowości epigenetycznych, które zwiększają komplikacje porodowe.13 Duże rozmiary płodu, w tym wszystkie nieprawidłowości noworodkowe spowodowane błędem epigenetycznym określane jako „zespół dużego cielęcia”.34 Powszechne jest, że długość ciąży w ciążach z transferem jądrowym jest dość znacznie wydłużona, co jest spowodowane brakiem uwalniania przez łożysko kortyzolu płodowego w okresie okołoporodowym lub brakiem uwalniania ACTH przez płód.26 Brak równowagi hormonalnej i duży rozmiar płodu są krokiem w kierunku dystocji, oprócz powiązanych problemów poporodowych mogą mieć również poważny negatywny wpływ na zdrowie matki, jak również jej przyszłą produkcję i wydajność reprodukcyjną w stadzie.7
Przed- i pourodzeniowa żywotność
Embryo jest uważane za dobrej jakości, jeśli liczba komórek jest dość dobra, ponieważ jest to ważne kryterium, które weryfikuje wykonalność embrionu po transferze do matki zastępczej, więc niska liczba komórek w sklonowanym embrionie będzie związana z niskim procentem przeżywalności po transferze embrionu w kilku gatunkach.35 Klonowane zarodki bydlęce z wyższym odsetkiem blastomerów apoptotycznych wykazywały niższy wskaźnik ciąż po 90 dniach od transferu zarodków, a następnie niższy wskaźnik wycieleń.36
Postnatalna żywotność jest znacznie niższa dla wielu sklonowanych.37 Odsetek urodzonych sklonowanych cieląt, które przeżywają dłuższy okres czasu waha się pomiędzy 47% a 80%.38 Po urodzeniu, sklonowane cielęta i jagnięta powszechnie wykazują oznaki stresującego środowiska macicy; pojemność rezerwowa łożyska jest najprawdopodobniej ograniczona z powodu nieodpowiedniego rozwoju.7 Jest oczywiste, że żywotność płodów u sklonowanych zwierząt różni się w zależności od eksperymentu i gatunku, przy czym sklonowane myszy i kozy wykazują lepszą żywotność pourodzeniową, która może być spowodowana techniką, szczepem zwierząt lub rodzajem łożyska.26 U sklonowanych cieląt odnotowano również kilka innych przypadków, w których łuszcząca się pępowina może być potencjalną przyczyną śmierci poporodowej.39 U sklonowanych cieląt powiększone żyły i tętnice pępkowe są również ważną przyczyną śmierci poporodowej z powodu sepsy w strukturach pępowinowych.39
Zgodnie z nowymi badaniami problemy naczyniowe są również przyczyną śmierci poporodowej jak nadciśnienie płucne, zmiany, obrzęk i wysięki opłucnowe, oprócz kapilarnego przekrwienia przegród pęcherzykowych i zakrzepicy płucnej powodującej zaburzenia hemodynamiczne. Zmiany te prawdopodobnie zahamowały całkowite rozszerzenie pęcherzyków płucnych i wyjaśniły niewydolność płucną, która przyczyniła się do niskiego wskaźnika przeżywalności po urodzeniu sklonowanych cieląt.40 Te problemy rozwojowe naczyń krwionośnych były wynikiem pierwotnych lub kluczowych zmian spowodowanych modyfikacjami epigenetycznymi wywołanymi przez klonowanie.
Aczkolwiek te szczególne aberracje epigenetyczne mogą być niewielkie i nie stanowią problemu dla dobrostanu zwierząt, mogą ograniczać niektóre praktyczne zastosowania tej technologii, ponieważ zmniejszają potencjalną jednorodność sklonowanych zwierząt.41 Fenotyp klonów, dobrze znany z gatunków diagonalnych, jest potwierdzeniem upośledzonego układu odpornościowego, z aplazją grasicy u klonowanego bydła i niższą produkcją przeciwciał u klonowanych myszy.26 Upośledzony układ odpornościowy może zwiększać ich skłonność do infekcji i chorób.9
W okresie poporodowym Próbki krwi pobrane od sklonowanych jagniąt po urodzeniu ujawniły szeroki zakres nieprawidłowości wskazujących na dysfunkcję nerek i wątroby.32 Dalsze straty w okresie poporodowym wynikają głównie z nieprawidłowości w układzie sercowo-naczyniowym, kostnym i centralnym układzie nerwowym, infekcji pępka i płuc, wraz z zaburzeniami trawienia i nerek.7 Straty pourodzeniowe u owiec są większe niż u bydła.26
Fenotypy dorosłych klonów
Jeśli ekspresja genów jest nieprawidłowa w czasie preimplantacji i we wczesnych stadiach implantacji, morfologia klonu będzie również nieprawidłowa.42 W większości przypadków klon wygląda normalnie i ma prawidłową fizjologię, ale nadal istnieje wiele raportów, które wykazują nieprawidłowości związane z fenotypem,41 takie jak „syndrom dużego potomstwa”.9 Jest to spowodowane błędem w ekspresji genów wzrostu i rozwoju płodu.43 Częstość występowania tych anomalii może się różnić w zależności od gatunku, genotypu, płci, typu komórki lub specyficznych aspektów protokołu transferu jądrowego.4
Wysoki odsetek niepowodzeń
Jedną z barier praktycznego wykorzystania technik transferu jądrowego komórek somatycznych jest niska możliwość rozwoju sklonowanych embrionów; tylko kilka procent zrekonstruowanych oocytów jest zawsze zdolnych do rozwoju.43 Dotychczas sukces klonowania wewnątrzgatunkowego wynosi 1%44 , mimo zastosowania zdrowej i zsynchronizowanej biorczyni, a także dobrej jakości użytego zarodka. U większości gatunków ssaków ocena morfologii zarodka pozostaje metodą selekcji różnorodnych, nadających się do wykorzystania zarodków przed transferem. Jest to najbardziej realistyczny i klinicznie użyteczny sposób oceny żywotności zarodków.14 Nadal jednak większość przypadków znacznej utraty ciąży odnotowuje się we wczesnych stadiach rozwojowych, w wieku 30-90 dni ciąży45 , z powodu niewydolności błony łożyskowej i ograniczenia rozwoju naczyń łożyskowych,39 donosi się, że wskaźniki ciąż we wczesnym trymestrze są niższe niż 1/2 normalnie oczekiwanych, utrata zarodków jest bardzo wysoka i blisko 80% poronień ma miejsce w drugim trymestrze, a ponadto w późnym trymestrze ciąży istnieje duże prawdopodobieństwo rozwoju łożyska i śmiertelnych nieprawidłowości niż normalnie.7 Główną przyczyną strat w trzecim trymestrze ciąży jest wodogłowie i wodogłowie płodu, zwykle przypisywane nieodpowiedniemu łożysku.16 W literaturze można również znaleźć informacje, że utrata płodu sklonowanego jest spowodowana niedotlenieniem, ponieważ u zwierząt sklonowanych liczba łożysk jest mniejsza, co umożliwia wymianę mniejszej ilości składników odżywczych z matki na płód i stwarza niekorzystne warunki dla rozwoju płodu.15
Wysoki wskaźnik utraty ciąży i śmierci noworodków sklonowanych cieląt wynika z niekompletnego przeprogramowania jądrowego; kilku autorów przekonująco potwierdziło, że komórka somatyczna dawcy jest przeprogramowana w taki sposób, że wzór ekspresji na etapie blastocysty jest znacząco różny od tego z komórki somatycznej przed transferem jądrowym.46 Według Arnolda i wsp.Ekspresja genów krytycznych dla normalnego rozwoju łożyska jest zniekształcona w sklonowanych zarodkach bydlęcych, co prawdopodobnie powoduje nieprawidłowe różnicowanie trofoblastu i przyczynia się do utraty ciąży. Nawet trwające potomstwo ma duże łożyska i zwiększoną masę urodzeniową, znane jako syndrom dużego potomstwa14 , a niektóre z pozornie zdrowym wyglądem ulegają dysfunkcji immunologicznej, co prowadzi do zwiększonej śmiertelności.24
Zgodnie z jednym z raportów Marfil et al.48 u sklonowanych cieląt Zaburzenia oddychania 19% i w tym stanie cielęta zmarły bez żadnych innych oznak nieprawidłowości. Rozszerzona pępowina 37%, hiper/hipotermia 17% i depresja/przedłużona pozycja leżąca 20% są najczęstszymi przyczynami śmierci pomiędzy 24 a 60 dniem po urodzeniu. Problemy, które mogą obniżyć przeżywalność tych cieląt w czasie lub w okolicach porodu, obejmują zwiększoną długość ciąży, ciężką dystocję, niewystarczający rozwój i funkcję łożyska oraz niepowodzenia w szlakach metabolicznych niezbędnych do życia pozamacicznego, a także niektóre problemy wrodzone, takie jak hipoplazja móżdżku, zaburzenia oddychania i powiększenie serca.4
To może być normalne, że klony mają inną wrażliwość na stres w porównaniu ze zwierzętami zachowawczymi, z tego powodu są bardziej podatne na patogeny, co może również zwiększyć śmiertelność klonów.23 Aby przezwyciężyć niską skuteczność klonowania, próbowano różnych metod, takich jak stosowanie różnych typów linii komórkowych dawców, różnych systemów hodowlanych, różnych metod fuzji i chemikaliów.35 Niektóre z tych badań doprowadziły do niewielkiej poprawy jakości klonowanych embrionów, co jest ściśle związane z rozwojem embrionu i produktywnością potomstwa.
Etyka
Klonowanie zwierząt jest kluczem do rozwoju w dziedzinie rolnictwa i medycyny, ale jest ono dopuszczalne tylko wtedy, gdy cele i metody są etycznie uzasadnione i gdy jest przeprowadzane w warunkach etycznych. Naukowcy prowadzą szeroko zakrojone badania nad klonowaniem zwierząt, ale obecnie podnoszonych jest wiele kwestii etycznych. Niezwykła nieskuteczność klonowania stwarza poważne zagrożenia dla dobrostanu zwierząt.49 Często mniej niż jeden procent prób klonowania kończy się pomyślnym urodzeniem, a spośród tych, które się urodzą, tylko stosunkowo niewielki odsetek jest wystarczająco zdrowy, aby żyć dłużej niż kilka dni lub tygodni.35 Według jednego z sondaży 64% mieszkańców USA jest przeciwnych klonowaniu, uważają oni, że jest to sprzeczne z dobrostanem zwierząt, dlatego jest to moralnie złe.50
Podczas klonowania najpoważniejszym skutkiem etycznym jest ból, jaki cierpią zwierzęta podczas tego procesu, oprócz tego klonowanie ma również wpływ na inne populacje zwierząt. W związku z tym klonowanie zwierząt może mieć również negatywny wpływ na ludzi, ponieważ zagraża bezpieczeństwu zwierząt hodowlanych wykorzystywanych do produkcji żywności.51 Klonowanie ma zły wpływ zarówno na dawcę, jak i biorcę, ponieważ w klonowaniu najpierw wykonuje się operację usunięcia jaja od dawcy, a następnie ponownie operację wszczepienia jaja biorcy z najmniejszymi szansami na osiągnięcie celu, oprócz tego, jeśli zwierzę pomyślnie zakończy swoją długość ciąży, to z jakiegoś nieznanego powodu wysoka waga potomstwa17 powoduje, że najczęściej potrzebne jest cesarskie cięcie, z powodu którego zwierzę ponownie cierpi z powodu bólu.
Zgłaszane są również inne problemy, w których zwierzęta cierpią z powodu bólu i jest to sprzeczne z dobrostanem zwierząt, jak Hydroallantois, typowo śmiertelny stan, w którym ciężarne zwierzę puchnie od płynu do tego stopnia, że wygląda, jakby miało pęknąć.48 Jest oczywiste, że embriony powstałe w wyniku transferu jądrowego mogą w niektórych przypadkach prowadzić do niestabilnego rozwoju płodu, zwiększonej częstości występowania dystocji, cesarskiego cięcia i śmierci okołoporodowej, co może mieć negatywny wpływ na biorczynie i potomstwo. Różnorodność biologiczna jest siatką bezpieczeństwa, która chroni przed rozprzestrzenianiem się chorób u zwierząt, lecz klonowanie jest wysiłkiem mającym na celu utrwalenie jednego zestawu pożądanych genów i stworzenie dokładnych kopii zwierzęcia źródłowego, co jest sprzeczne z różnorodnością i rodzi szereg problemów etycznych.53
Bezpieczeństwo żywności
Każdy kraj posiada specjalny departament zajmujący się produktami żywnościowymi wytworzonymi przez biotechnologię. Jednakże produkty biotechnologii zwierzęcej muszą przejść przez ocenę bezpieczeństwa, która jest przeprowadzana przed publiczną i rządową akceptacją ich wykorzystania do spożycia przez ludzi.23 Możliwość wystąpienia błędów epigenetycznych zdolnych do zmiany składu żywności, dlatego też produkty żywnościowe pochodzące ze sklonowanych zwierząt hodowlanych stanowiły główną przeszkodę w uzyskaniu zgody organów regulacyjnych na wprowadzenie sklonowanych produktów do łańcucha żywnościowego. Dodatkowo, próba żywieniowa na szczurach potwierdziła, że wykorzystanie mięsa ze sklonowanych zwierząt nie miało żadnego wpływu na wzrost ciała, spożycie pokarmu, ogólną kondycję, aktywność lokomotoryczną, refleksje, cykl płciowy, badanie moczu, hematologię, biochemię krwi czy histologię.23 Biorąc pod uwagę, że technologia ta jest wciąż uważana za nową i nieznaną, a także brak jakichkolwiek produktów przynoszących bezpośrednie korzyści dzisiejszemu konsumentowi, nie jest szokujące, że obecna akceptacja jest niska. Jednakże, dojrzewanie technologii i dostępność takich produktów w połączeniu ze starzejącymi się populacjami w rozwiniętym świecie zachodnim, z silnym pragnieniem zachowania zdrowia na dłużej, może ostatecznie zwiększyć akceptację.54