B. Epitopy komórek B
Ograniczyliśmy naszą dyskusję do epitopów komórek B na białkach i peptydach; epitopy na innych biopolimerach i grupach haptenicznych nie zostały omówione. Pierwszym ważnym uogólnieniem dotyczącym epitopów B-komórkowych jest to, że są one skierowane przeciwko trójwymiarowym cechom powierzchni molekularnej białek i polipeptydów. Szczególna trójwymiarowa topologia jest cech± charakterystyczn± epitopów B-komórkowych w odróżnieniu od epitopów T-komórkowych. Jest prawdopodobne, że każda reszta aminokwasowa dostępna z powierzchni białka może być częścią tego lub innego epitopu komórek B (Benjamin i in., 1984). Stąd, białka mogą zawierać bardzo wiele różnych epitopów, chociaż, z powodów sterycznych, tylko ograniczona liczba przeciwciał może wiązać się z antygenem w tym samym czasie. Odpowiedź komórek B jest stereospecyficzna, znacznie słabsza wobec enancjomerów d peptydów (Gill i in., 1963) i białek (Dintzis i in., 1993), być może dlatego, że d-enancjomery białek nie są skutecznie przetwarzane w celu uzyskania peptydów dla pomocy komórek T.
Wcześniej uważano, że białka mają dobrze zdefiniowaną strukturę antygenową charakteryzującą się ograniczoną liczbą epitopów. Wgląd w złożoną naturę odpowiedzi immunologicznej komórek B i jej regulację oraz w specyficzność przeciwciał monoklonalnych wobec białek sprawił, że stało się jasne, iż białko nie posiada zdefiniowanej struktury antygenowej. Nie jest możliwe zdefiniowanie „kompletnej struktury antygenowej” białka, wbrew temu, co twierdzą niektórzy badacze (Atassi i Lee, 1978; Atassi, 1984). Antygenowość białka jest zarówno właściwością topografii białka, jak i mechanizmów regulacyjnych układu odpornościowego gospodarza, w tym tolerancji na struktury przypominające własne białka gospodarza, specyficzności pomocy komórek T i sieci idiotypowych (Benjamin i in., 1984; Berzofsky, 1985). Miejsca immunodominujące, to znaczy takie, do których kieruje się większość, ale nie wszystkie przeciwciała odpowiedzi immunologicznej, nie są wewnętrzną właściwością per se białka. Jak wskazywali już inni, epitopy nie istnieją same w sobie, lecz jedynie na mocy połączenia z komplementarnym miejscem wiązania przeciwciał, tzw. paratopem (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Stąd, epitop jest pojęciem relacyjnym, a definicja epitopu jest z konieczności operacyjna (Van Regenmortel, 1986). Innymi słowy, definicja danego epitopu zależy w dużym stopniu od geometrii molekularnej i natury chemicznej odpowiadającego mu paratopu oraz, co być może ważniejsze, od podejścia eksperymentalnego wybranego do mapowania epitopu.
Ten stan rzeczy można zilustrować na przykładzie pierwszego kompleksu białko-przeciwciało, którego struktura została rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej (Amit i in., 1986). W kompleksie tym 16 reszt lizozymu styka się z 17 resztami monoklonalnego Fab (fragmentu przeciwciała) do lizozymu. Epitop rozciąga się na 750 Å2 powierzchni lizozymu. Dla kontrastu, mapowanie epitopu z serią sekwencyjnie powiązanych lizozymów ptasich wskazuje, że tylko kilka reszt jest ważnych dla wiązania lizozymu z przeciwciałami monoklonalnymi przeciw lizozymowi. Mutacja bardzo niewielu reszt może radykalnie obniżyć stał± asocjacji kompleksu lizozym-przeciwciało (Harper i in., 1987). W jednym przypadku, pojedyncza substytucja Arg do Lys zmniejszyła o dwa rzędy wielkości powinowactwo lizozymu do przeciwciała monoklonalnego (Smith-Gill i in., 1982). Obliczenia teoretyczne oparte na strukturach krystalicznych dwóch kompleksów lizozymu z fragmentami Fab wykazały, że spośród wielu reszt, które definiują epitop w krysztale, tylko kilka faktycznie przyczynia się do stabilności kompleksu (Novotny i in., 1989). W oparciu o swoje obliczenia Novotny i wsp. rozróżnili epitop energetyczny i epitop pasywny. Epitop energetyczny obejmuje te reszty, które przyczyniają się do energetyki wiązania. Pasywny epitop zapewnia jedynie komplementarno¶ć powierzchniow± wokół reszt tworz±cych energetyczny epitop. To, że tylko kilka oddziaływań widocznych w strukturze krystalicznej odgrywa główną rolę w stabilizacji kompleksu antygen-przeciwciało, zostało potwierdzone w przypadku wiązania neuraminidazy wirusa grypy z przeciwciałem monoklonalnym. Dziewiętnaście reszt neuraminidazy kontaktuje się z 17 resztami przeciwciała w krysztale, ale specyficzna dla danego miejsca mutacja tylko 3 reszt całkowicie znosi wiązanie (Air i in., 1990; Nuss i in., 1993).
Ogólniej stosowanym operacyjnym rozróżnieniem epitopów jest rozróżnienie między epitopem kontaktowym a epitopem funkcjonalnym. Epitop kontaktowy odnosi się do informacji uzyskanych z trójwymiarowej struktury kompleksu antygen-przeciwciało; epitop funkcjonalny odnosi się do informacji z niekrystalograficznych procedur mapowania, w tym mapowania epitopów z peptydami. Epitop kontaktowy jest reprezentowany przez dopasowanie pomiędzy dużymi komplementarnymi powierzchniami antygenu i przeciwciała, co można zaobserwować w kilku strukturach rentgenowskich kompleksów białko-przeciwciało (Davies i Padlan, 1990; Wilson i Stanfield, 1994; Braden i Poljak, 1995). Epitopy kontaktowe pokrywają kilkaset angstremów kwadratowych powierzchni molekularnej. Epitop funkcjonalny definiuje reszty, które wydają się być istotne dla wiązania przeciwciał i których mutacja może zredukować lub całkowicie zlikwidować wiązanie. Epitop funkcjonalny może obejmować zaledwie 2 do 3 reszt, jak w przykładach lizozymu i neuraminidazy wspomnianych powyżej. Nie jest możliwe wywnioskowanie epitopu kontaktowego z epitopu funkcjonalnego. Podobnie, epitop kontaktowy sam w sobie nie ujawnia epitopu funkcjonalnego. Po stronie przeciwciała można również wyróżnić dwa rodzaje paratopów: paratop funkcjonalny i paratop kontaktowy. Wynika to z termodynamicznej analizy regionów decydujących o komplementarności przeciwciała monoklonalnego (Kelley i O’Connell, 1993).
Podwójna natura epitopu ujawniona przez krystalografię i niekrystalograficzne techniki mapowania odzwierciedla dwa różne modele rozpoznania molekularnego. Patrząc w ten sposób, trudność w zdefiniowaniu natury epitopów przenosi się na poziom trudności epistemologicznej: jak mamy modelować rzeczywistość za pomocą ograniczonych środków eksperymentalnych, którymi dysponujemy? O tych ograniczeniach będziemy pamiętać przy omawianiu mapowania epitopów przez peptydy.
Musimy tu wspomnieć o znanej od dawna konceptualnej klasyfikacji epitopów komórek B na sekwencyjne i konformacyjne (Sela i in., 1967; Sela, 1969; Atassi i Smith, 1978). Epitop nazywany jest sekwencyjnym lub ciągłym, jeśli może być reprezentowany przez serię przylegających do siebie reszt łańcucha polipeptydowego. Mówi się, że przeciwciało rozpoznaje epitop sekwencyjny, jeśli reaguje z krótkim, elastycznym peptydem lub z denaturowanym, rozwiniętym łańcuchem polipeptydowym. Epitop konformacyjny, zwany również nieciągłym, topograficznym lub złożonym, jest zbudowany z nieciągłych części sekwencji aminokwasowej poprzez fałdowanie łańcucha polipeptydowego w białku natywnym. Mówi się, że przeciwciało rozpoznaje epitop konformacyjny, jeśli reaguje z natywnym białkiem, a nie z rozwiniętym łańcuchem polipeptydowym, lub jeśli reaguje z peptydem o unikalnej konformacji, na przykład helisą, ale nie z peptydem o przypadkowym zwoju.
Różnica między epitopami sekwencyjnymi i konformacyjnymi jest nieco arbitralna i może być myląca. Ponieważ każdy paratop ma dobrze zdefiniowaną strukturę trójwymiarową, interakcja między paratopem a epitopem jest zawsze dopasowaniem struktur w przestrzeni trójwymiarowej. Dotyczy to zarówno epitopu na dobrze uporz±dkowanym białku globularnym, jak i epitopu na krótkim elastycznym peptydzie. W tym ostatnim przypadku, peptyd również musi przyjąć unikalną konformację podczas wiązania się z przeciwciałem; stąd, ciągły epitop jest również „konformacyjny”. Konformacja wiązania albo istnieje wcześniej, albo jest indukowana przez paratop (patrz sekcje V,B i V,C).
W przypadku przeciwciał do białek natywnych, argumentowano, że większość, a być może wszystkie epitopy są nieciągłe (Barlow i in., 1986). Ze względu na duży rozmiar typowego epitopu kontaktowego w krysztale antygen-przeciwciało, jest rzeczywiście mało prawdopodobne, aby przeciwciało wiązało się wyłącznie do przylegającego odcinka łańcucha polipeptydowego, a nie również do reszt kontaktowych oddalonych od siebie sekwencyjnie, ale bliskich w przestrzeni. Modele białek wypełniające przestrzeń pokazują niewiele liniowych odcinków dłuższych niż 4 do 5 reszt w bezpośrednich połączeniach peptydowych dostępnych na powierzchni cząsteczki. Nie oznacza to, że przeciwciało skierowane przeciwko złożonemu epitopowi na powierzchni białka nie może reagować krzyżowo również z peptydem odpowiadaj±cym segmentowi białka.
Kończ±c nasz przegl±d natury epitopów komórek B, jeszcze raz podkre¶lamy trudno¶ć podania ogólnej definicji „epitopu”. Pragmatyczne odwołanie się do definicji operacyjnych może nie zadowolić purystów, ale definicje operacyjne mogą być pomocne w odpowiedzi na pytania o charakter interakcji antygen-przeciwciało.