Klonowanie oparte na topoizomerazie (klonowanie TOPO) jest metodą klonowania DNA, która nie wykorzystuje enzymów restrykcyjnych ani ligazy i nie wymaga procedur post-PCR. Brzmi prosto, prawda? Technika ta opiera się na podstawowej zdolności komplementarnych par zasad: adeniny (A) i tyminy (T) do hybrydyzacji i tworzenia wiązań wodorowych. Ten post skupia się na klonowaniu TOPO z „lepkim końcem” (zwanym również TOPO-TA), jednak technika klonowania TOPO może być również zaadaptowana do klonowania z tępym końcem.
Jak działa klonowanie TOPO?
Jak pokazano na poniższym rysunku, nawis „A” na niebieskiej wstawce produktu PCR pochodzi z zastosowania polimerazy Taq do etapu amplifikacji, ponieważ polimeraza Taq pozostawia pojedynczą deoksyadenozynę (A) na 3′ końcu produktów PCR. Komplementarne „T” w parze pochodzi od topoizomerazy I linearyzowanego szkieletu. Topoizomeraza I DNA (przedstawiona jako zielona chmura) funkcjonuje zarówno jako endonukleaza restrykcyjna, jak i ligaza, rozszczepiając i łącząc superskręcone końce DNA w celu ułatwienia replikacji.
W technice TOPO wykorzystuje się topoizomerazę I wyizolowaną z wirusa Vaccinia, ponieważ enzym ten rozpoznaje sekwencję DNA 5´-(C/T)CCTT-3′ i trawi dwuniciowy DNA w tej sekwencji. Energia pochodząca z tego złamania jest przechowywana jako wiązanie kowalencyjne pomiędzy rozciętą 3′ nicią DNA a resztami tyrozylowymi topoizomerazy I (1). Jeśli pojawi się grupa hydroksylowa 5′ z innej nici DNA, może ona zaatakować to wiązanie kowalencyjne, łącząc w ten sposób dwie nici DNA i uwalniając topoizomerazę (2).
W dzisiejszych czasach komercyjnie dostępne zestawy TOPO dostarczają wektory lub ramiona klonujące z przewieszonymi resztami 3′ deoksytymidyny (T), które są kowalencyjnie połączone z topoizomerazą. Wektory w tych zestawach często mają również miejsce topoizomerazy wstawione do kasety beta-galaktozydazy, co pozwala badaczowi na przeprowadzenie screeningu niebiesko-białego po transformacji – samoczynne łączenie się końców wektora skutkuje produkcją niebieskich kolonii, które nie muszą być zbierane i sekwencjonowane w poszukiwaniu potencjalnych klonów pozytywnych. Po wprowadzeniu insercji 3′-end „A” overhang, dzieje się magia klonowania TOPO.
Podstawowa procedura
Przedstawiamy kroki potrzebne do klonowania TOPO:
1. Stwórz swój produkt PCR: Zaprojektuj standardowe startery (nie ma potrzeby dodawania unikalnych miejsc restrykcyjnych na końcach) i amplifikuj interesującą cię sekwencję z polimerazą Taq przy użyciu ulubionego protokołu PCR.
2. Przygotuj reakcję klonowania TOPO: Wymieszać produkt PCR i wektor TOPO.
3. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej: Można umieścić reakcję na lodzie, jeśli planuje się natychmiastową transformację LUB można przechowywać reakcję w temperaturze -20C przez noc.
4. Transformacja reakcji klonowania TOPO do kompetentnych komórek: Można użyć do tego standardowego protokołu laboratoryjnego; jednakże, należy skrócić czas inkubacji na lodzie do 5 minut (inkubacja przez pełne 30 minut nie poprawi znacząco wydajności transformacji).
5. Wybrać i przeanalizować 10 białych lub jasnoniebieskich kolonii: Można potwierdzić obecność insertu metodą PCR, trawienia restrykcyjnego lub sekwencjonowania.
Pro tips
- Nie dodawaj 5′ fosforanów do primerów PCR; potrzebujesz wolnej grupy hydroksylowej!
- Możesz chcieć włączyć dodatkowy czas przedłużania po ostatnim cyklu PCR, aby upewnić się, że „A” zostanie dodane do wszystkich produktów PCR.
- Pamiętaj, że polimeraza Taq ma współczynnik błędu około 1 na 3500 zasad. Zazwyczaj zamiast polimerazy Taq stosuje się polimerazy z funkcją korekty, aby zmniejszyć liczbę błędów; jednakże polimerazy korekcyjne również usuną wszystkie niesparowane końce 3′ w produkcie PCR. Jeśli konieczne jest zmniejszenie liczby błędów, należy użyć jednej z poniższych metod, aby upewnić się, że wstawka zachowa 3′ A overhang:
- Użyj mieszaniny enzymu korekcyjnego i Taq, z Taq użytym w stosunku 10:1.
- Oczyść produkt PCR metodą żelową i inkubuj go z buforem, Taq i dATP w 72C przez 10-15 minut.
- Podczas mieszania produktu PCR z wektorem TOPO, możesz chcieć dodać dodatkową sól do swojej reakcji:
Topoizomeraza I jest uwalniana z wektora, gdy produkt PCR i wektor ligują; jednakże, może ona potencjalnie ponownie związać i nickować nowo zligatowane DNA. Sól pomaga zapobiec ponownemu wiązaniu topoizomerazy I, co skutkuje większą ilością nienaruszonych cząsteczek. (Zauważ, że ilość dodanej soli zależy od tego, czy planujesz transformację reakcji do chemicznie czy elektrokompetentnej E. coli – nadmiar soli powoduje powstawanie łuku elektrycznego podczas elektroporacji, co może spowodować niepowodzenie elektroporacji).
- Podczas inkubacji w temperaturze pokojowej nie zaleca się przekraczania limitu czasu 5 minut (odnotowano niższą wydajność transformacji przy dłuższej inkubacji); jednakże, może zaistnieć potrzeba inkubacji przez 20-30 minut, jeśli produkt PCR ma niskie stężenie lub klonujesz wyjątkowo dużą wstawkę.
- Ponieważ standardowa reakcja ligacji jest dość szybka, upewnij się, że jesteś zorganizowany i przygotuj wszystko, czego potrzebujesz do następnego kroku przed przystąpieniem do niego.
- Podgrzanie płytki zawierającej antybiotyk przed posiewem transformacji może pozwolić na zobaczenie kolonii w ciągu 8 godzin.
1. Shuman S. „Recombination mediated by vaccinia virus DNA topoisomerase I in Escherichia coli is sequence specific.” Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796. PubMed Central PMCID: PMC52876.
2. Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
Dodatkowe zasoby na blogu Addgene
- Perform Site Directed Mutagenesis by PCR
- Use REPLACR Mutatgenesis to Easily Generate Insertion and Deletions in a Plasmids
- Learn How to Verify Your Plasmid
.