Porównanie analizy chromosomowej i analizy mikromacierzy chromosomalnych: jaka jest wartość analizy chromosomowej w dzisiejszej erze macierzy genomowych?

Analiza chromosomowa i CMA są klinicznie użytecznymi narzędziami diagnostycznymi do wykrywania nieprawidłowości chromosomalnych w całym ludzkim genomie. Obecnie CMA jest zalecana jako test pierwszego rzutu w diagnostyce niepełnosprawności intelektualnej i wad wrodzonych, zastępując dotychczasową rolę analizy chromosomowej. W tym badaniu porównaliśmy wyniki analizy chromosomowej i CMA w 3710 przypadkach, aby określić wartość wykonywania analizy chromosomowej.

Maksymalne wykrycie mozaikowości przez połączenie CMA i tradycyjnej analizy cytogenetycznej

W badaniu tym wykazano, że 1,2% (43/3,710) pacjentów miało mozaikowość. W 39% przypadków mozaikowatość została stwierdzona jedynie na podstawie analizy chromosomowej z powodu bardzo niskiego (<10%) lub bardzo wysokiego (>80%) odsetka nieprawidłowych komórek, podczas gdy 12% przypadków wykryto jedynie na podstawie CMA. Pozostałe 49% przypadków wykryto zarówno za pomocą CMA, jak i analizy chromosomowej.

Wykrywanie mozaikowatości za pomocą CMA i analizy chromosomowej różni się ze względu na różnice w technologii i analizowanej populacji komórek. CMA analizuje DNA pobrane ze wszystkich komórek jądrzastych krwi obwodowej, w tym z wielu linii komórkowych. Natomiast analiza chromosomowa wykonywana jest głównie na limfocytach T stymulowanych fitohemaglutyniną. Badania wykazały, że CMA może być bardziej czuła, gdy nieprawidłowe komórki nie odpowiadają na mitogeny i/lub nieprawidłowości są rzadkie lub nieobecne w komórkach T, tak jak w zespole Pallister-Killian.5,6 Pięć przypadków trisomii mozaikowej, obejmującej chromosomy 8, 9, 14 i 22, zostało wykrytych wyłącznie przez CMA.

Ale CMA może z łatwością wykryć mozaikowatość na poziomie 30% lub wyższym, jest ona ograniczona w rutynowym wykrywaniu mozaikowości na poziomie <10%.6,13,14 Inne platformy tablicowe, takie jak tablice polimorfizmu pojedynczego nukleotydu, mogą lepiej wykrywać mozaikowatość dzięki informacjom uzyskanym z częstotliwości alleli B.15,16 Analiza chromosomowa może wykryć niski poziom mozaicyzmu poprzez indywidualne badanie dużej liczby komórek. Standardowe badania chromosomowe 20 komórek wykluczą 14% mozaikowatości przy 95% poziomie ufności. Więcej komórek może być przebadanych, gdy zidentyfikowana zostanie jedna lub dwie nieprawidłowe komórki metafazy. Jednakże, analiza wielu pojedynczych komórek jest czasochłonna i pracochłonna. W przypadku podejrzenia lub potwierdzenia mozaicyzmu, FISH może być wykorzystany do zbadania setek pojedynczych komórek międzyfazowych w celu określenia poziomu mozaicyzmu; FISH jest stosunkowo mniej czasochłonny niż analiza chromosomów.

Nieprawidłowości pominięte przez CMA, z wyłączeniem pozornie zrównoważonych rearanżacji, stanowią <0,2% wszystkich przypadków w tym badaniu ( Tabela 2 ). Większość przypadków była niewykrywalna przez CMA, ponieważ odsetek nieprawidłowych komórek był poniżej granicy wykrywalności CMA (<10%). Niejasne jest znaczenie kliniczne bardzo niskiego poziomu mozaicyzmu w przypadkach 2 i 3 oraz małego chromosomu markerowego zawierającego wyłącznie sekwencje powtórzeń pericentromerycznych w przypadku 4. Pozostałe nieprawidłowości pominięte przez CMA są związane z nieprawidłowościami fenotypowymi. Nie jest jasne, dlaczego nieprawidłowość obserwowana w 30% hodowanych komórek w przypadku 5 została przeoczona przez CMA, ale przypuszczalnie wynika ona z nadreprezentacji nieprawidłowych komórek, szczególnie w komórkach T. Obecność dwóch różnych linii komórkowych z genomowymi zyskami i stratami dotyczącymi tego samego regionu doprowadziła do genomowej równowagi netto dla tego regionu, tym samym wymykając się wykryciu przez CMA, jak pokazano w przypadku 6.

Wykrywanie mozaicyzmu przez CMA opiera się na odchyleniu od oczekiwanych współczynników log dla delecji lub duplikacji bez mozaicyzmu. Podejrzenie mozaicyzmu musi być potwierdzone analizą chromosomową na hodowanych komórkach lub analizą FISH, najlepiej z wykorzystaniem rozmazów krwi. W 11 przypadkach badanych tutaj, CMA był w stanie wykryć nieprawidłowość chromosomową, ale nie był w stanie wykryć, że przypadek był mozaikowy z powodu niskiego odsetka normalnych komórek lub obecności izodicentrycznego chromosomu prowadzącego do segmentalnej tetrasomii. Na przykład, dwa przypadki miały przyrost liczby kopii wykryty przez wszystkie sondy dla chromosomu 18 przez CMA ( rysunek 2 ), sugerując trisomię 18. W rzeczywistości analiza chromosomowa wykazała, że jeden przypadek miał trisomię 18 we wszystkich komórkach ( Figura 2a ), podczas gdy drugi przypadek miał mozaicyzm dla trisomii 18 w 80% komórek ( Figura 2b ). Ponadto, gdy dwie lub więcej nieprawidłowych linii komórkowych obejmuje ten sam region, jak w przypadku na rycinie 2c, analiza chromosomowa i/lub FISH jest niezbędna do prawidłowej interpretacji nieprawidłowości chromosomowych.

Chromosomalne informacje strukturalne są dostarczane przez analizę chromosomową, ale nie są widoczne przez CMA

CMA dostarcza bardzo wiarygodnych informacji na temat tego, czy występują zyski i straty liczby kopii, ale nie dostarcza informacji o położeniu lub orientacji. Nasze badania wykazały, że nieprawidłowości strukturalne były widoczne w 18% nieprawidłowych przypadków CMA. Połowa rearanżacji strukturalnych zidentyfikowanych w tym badaniu to niezrównoważone translokacje/insercje, jedna trzecia to inne zmiany strukturalne, takie jak chromosomy pierścieniowe, chromosomy markerowe, izochromosomy i chromosomy izodicentryczne, a pozostałe 15% to rearanżacje złożone. Biorąc pod uwagę, że większość z tych strukturalnych aberracji dotyczy regionów subtelomerycznych, terminalne zmiany liczby kopii mają większe prawdopodobieństwo wystąpienia dalszych nieprawidłowości strukturalnych.17 Ogólnie rzecz biorąc, zarówno analiza chromosomów, jak i analiza FISH są w stanie zidentyfikować translokacje, insercje, izochromosomy i markery, z różną siłą dla każdej z metod. Chociaż FISH może wykryć zmiany zbyt małe, aby mogły być wykryte przez analizę chromosomową, analiza wzorów prążkowania chromosomów dostarcza dodatkowych informacji na temat regionów, których dotyczą. W przypadku złożonych rearanżacji, do pełnego określenia złożonych zmian strukturalnych może być konieczna łączna analiza FISH i analiza chromosomów. Z tym wyjątkiem, analiza FISH po stwierdzeniu nieprawidłowości przez CMA jest zazwyczaj wystarczająca do uzyskania informacji o naturze zmiany liczby kopii.

Niektóre rearanżacje chromosomalne mogą zostać przeoczone nawet po wykonaniu zarówno CMA, jak i FISH. Na przykład, delecja śródmiąższowa w 2q została wykryta przez CMA w przypadku 9 ( Rysunek 1a ). Bez analizy chromosomowej rearanżacja ta wydaje się być prostą pojedynczą delecją, nawet po potwierdzającej analizie FISH. Jednak badanie kariotypu wykazało nieprawidłowy chromosom 2 z insercją segmentu z 17q23.1q23.3 do pasma 2p11.2. Ponadto chromosom 2 z wstawionym segmentem 17q ma również inwersję pericentryczną pomiędzy 2p12 i 2q31.1. Delecja na 2q31.1 wykryta przez CMA najprawdopodobniej wystąpiła na lub w pobliżu punktu przerwania inwersji na długim ramieniu jednego z chromosomów 2. Podsumowując, przypadek 9 miał złożoną rearanżację obejmującą delecję w 2q wykrywalną przez CMA, ale niewidoczną w analizie chromosomów, jak również insercję i inwersję obejmującą chromosomy 2 i 17, wykrywalne przez analizę chromosomów, ale nie przez CMA. Podobnie, przypadek 10 miał rearanżacje de novo obejmujące cztery chromosomy, w tym insercję segmentu 2q14.2q24.1 do krótkiego ramienia chromosomu 6, który również ma inwersję paracentryczną, oraz translokację wzajemną między chromosomami 12 i 18. Utrata liczby kopii została zidentyfikowana przez CMA w pobliżu punktów załamania w chromosomach 2 i 6 ( Figura 1b ). Prawidłowa diagnoza wymaga połączenia CMA i analizy chromosomowej.18

Identyfikacja chromosomalnych rearanżacji strukturalnych jest niezbędna w poradnictwie genetycznym rodziny. Zaburzenia równowagi genomowej wykryte za pomocą CMA mogą być spowodowane niezrównoważonym produktem segregacji zrównoważonej translokacji lub insercji u jednego z rodziców i dlatego stanowią silną rekomendację do wykonania badań rodzicielskich. Ponadto, informacje o strukturze chromosomalnej stanowią wskazówkę, które badania rodzicielskie powinny być zalecane. W przypadku rearanżacji, które prawdopodobnie są produktami zrównoważonej rearanżacji, należy wykonać rodzicielską analizę chromosomową lub FISH zamiast rodzicielskiej CMA.

Pozornie zrównoważone rearanżacje z prawidłowym badaniem CMA

W tym badaniu pojedyncze pozornie zrównoważone translokacje lub inwersje bez innych nieprawidłowości chromosomowych zostały wykryte w 30 przypadkach (~0,8%) za pomocą analizy chromosomowej. Stwierdzono, że ~40% pacjentów z wieloma wadami wrodzonymi/opóźnieniem umysłowym i de novo pozornie zrównoważoną translokacją ma kryptyczne nieprawidłowości w pobliżu punktów załamania lub niezwiązane z punktami załamania, które mogą być łatwo wykryte przez CMA.19,20 Jednakże CMA nie wykryła żadnych zmian liczby kopii w pobliżu punktów załamania w tych 30 przypadkach. Kilka czynników może przyczynić się do tej obserwacji. Większość rearanżacji została odziedziczona na podstawie badań rodzicielskich podzbioru przypadków, co oznacza, że jest bardziej prawdopodobne, że są one „prawdziwie” zrównoważone. Ponadto, translokacje Robertsona, które zwykle nie powodują zmian liczby kopii euchromatyny, zostały uwzględnione w tym badaniu, ale wykluczone w opublikowanych badaniach. Co więcej, małe kryptyczne delecje/duplikacje przylegające do punktów przerwania mogą zostać pominięte, ponieważ tablice używane w większości tych przypadków były ukierunkowane i nie miały wystarczającej rozdzielczości genomowej, aby wykryć brak równowagi.

Pomimo że większość zrównoważonych rearanżacji jest łagodna, rearanżacje de novo są związane z wyższym ryzykiem choroby z powodu kryptycznej delecji lub duplikacji, zaburzenia genu lub enhancera, efektów pozycji lub efektu epigenetycznego. Ryzyko wystąpienia poważnej wady wrodzonej w przypadku wzajemnych translokacji i inwersji de novo wynosi 6,7%.21 Oczekuje się, że ryzyko to będzie niższe w przypadku przypadków z prawidłowym CMA przy użyciu matrycy całego genomu. Dlatego proste zrównoważone rearanżacje wykryte w tym badaniu są mniej prawdopodobną przyczyną fenotypów pacjentów.

Strategia oparta na dowodach dla skutecznego wykrywania nieprawidłowości chromosomowych

Aby określić, czy i kiedy analiza chromosomowa powinna być wykonywana w celu klinicznej diagnostyki nieprawidłowości chromosomowych, zbadaliśmy wyniki przypadków badanych jednocześnie za pomocą CMA i analizy chromosomowej. Nieprawidłowości chromosomalne wykryte przez analizę chromosomów, ale całkowicie pominięte przez CMA, zaobserwowano w ~1% przypadków, w tym pozornie zrównoważone rearanżacje w 0,8% przypadków i nierównowagę związaną z mozaicyzmem w 0,16% przypadków. Ponadto, analiza chromosomowa ułatwiła wykrycie strukturalnych rearanżacji chromosomalnych w 18% przypadków z nieprawidłowymi wynikami CMA.

Ale CMA dostarcza informacji o zmianach liczby kopii i mozaicyzmie, jedynie analiza chromosomowa lub FISH dostarcza informacji o strukturze chromosomalnej związanej z tymi zmianami liczby kopii i identyfikuje niektóre przypadki mozaicyzmu niewykryte przez CMA. Przewaga FISH nad analizą chromosomową polega na tym, że można wykryć małe (<3-10 Mb) zmiany liczby kopii i szybko przeanalizować dużą liczbę jąder, co jest szczególnie przydatne w ocenie mozaicyzmu. Dlatego po nieprawidłowym CMA, analiza FISH może być zastosowana w pierwszej kolejności w celu wykrycia rearanżacji strukturalnych związanych ze zmianami liczby kopii i potwierdzenia mozaicyzmu oraz określenia odsetka nieprawidłowych komórek. Gdy insercje lub translokacje są wykrywane przez FISH, analiza chromosomowa może być wskazana w celu określenia zaangażowanych chromosomów. Zamiast standardowej analizy chromosomowej, która bada 20 komórek metafazy z dwóch hodowli, do tego celu wystarczająca jest analiza chromosomowa w małej skali pięciu komórek z jednej hodowli. Ta strategia wykryłaby wszystkie zmiany strukturalne z wyjątkiem kilku rzadkich złożonych rearanżacji.

W przypadkach z prawidłowym wynikiem CMA, pełna analiza chromosomowa może być rozważona, jeśli pacjent ma liczne anomalie wrodzone, cechy dysmorficzne i/lub opóźnienie umysłowe przypominające zespół chromosomalny lub objawy kliniczne wskazujące na potencjalny mozaicyzm, takie jak nieprawidłowości pigmentacyjne, które są losowo rozmieszczone lub które podążają za liniami Blashko i asymetrię wzrostu w połączeniu z niepełnosprawnością intelektualną. Na podstawie tego badania, ~1% przypadków miałoby informacyjne wyniki chromosomowe, ale <0,001 przypadków (3/3,710) miałoby klinicznie istotne wyniki.

Podsumowując, nasze badanie potwierdza, że prawie wszystkie nieprawidłowości chromosomowe wykrywalne przez analizę chromosomową są wykrywane przez CMA, wspierając zalecenie, aby CMA było testem pierwszego rzędu. Jednakże tradycyjna analiza cytogenetyczna pozostaje przydatna do wykrywania mozaikowatości i charakterystyki rearanżacji strukturalnych.