Projekt genu, technologia fuzji i warunki rozszczepiania TEV wpływają na oczyszczanie bogatych w utlenione dwusiarczki peptydów jadowych w Escherichia coli

Użycie kodonów w genach kodujących peptydy jadowe powoduje różnice w ekspresji

Do zbadania wpływu użycia kodonów na rozpuszczalne poziomy oczyszczonych białek wybrano 24 geny o różnej długości kodujące peptydy jadowe pochodzące od różnych gatunków i zawierające różną liczbę mostków dwusiarczkowych. Geny te kodują peptydy jadowe, które są zróżnicowane ewolucyjnie, strukturalnie i funkcjonalnie. Celem eksperymentu jest ocena, czy subtelne zmiany w użyciu kodonów mogą wpływać na poziom ekspresji rekombinowanych peptydów w E. coli. Trzy warianty każdego genu zostały wstępnie zaprojektowane przez back-translację sekwencji peptydów jadowych przy użyciu algorytmu Monte Carlo powtarzanego losowego próbkowania w celu probabilistycznego wyboru kodonów z tablic częstości kodonów. Użycie kodonów 72 opracowanych genów (3 warianty 24 genów) jest przedstawione w Dodatkowym pliku 5: Tabela S5 i odzwierciedla użycie kodonów genów Escherichia coli wyrażonych na umiarkowanym lub wysokim poziomie. Jednakże, utworzone warianty genów zawierały zmiany w pierwotnych sekwencjach DNA, które odzwierciedlają losowe próbkowanie wyboru kodonów i ogólną swobodę dozwoloną przez algorytm zastosowany do projektowania genów. Tak więc, średnia parami identyczność sekwencji DNA wynosiła 79,8% w obrębie trzech wariantów 24 zestawów danych.

72 geny zostały zsyntetyzowane i sklonowane przy użyciu systemu Gateway do prokariotycznego wektora ekspresyjnego pETG82A pod kontrolą promotora T7 i w fuzji z genem kodującym znacznik fuzyjny DsbC dla ekspresji cytoplazmatycznej. E. coli BL21 (DE3) pLys S transformowano 72 plazmidami i hodowano w podłożu do autoindukcji. Białka fuzyjne oczyszczano, a integralność i wydajność białek mierzono za pomocą analizy Caliper Labchip GXII (Rys. 1a). W zależności od interesującego nas peptydu, oczyszczone frakcje biegną na Caliper Labchip GXII głównie jako pojedyncze pasmo (peptydy 1, 2, 3, 4…) lub jako podwójne pasmo (5, 8, 16, 18…). Pojedyncze pasmo reprezentuje populację dobrego białka (His-DsbC-peptyd), podczas gdy niższe pasmo (około 29 kDa) odpowiada samemu białku His-DsbC po obcięciu/degradacji docelowego peptydu. To niższe pasmo prawdopodobnie wskazuje, że istnieje część populacji peptydów, która nie została prawidłowo sfałdowana i uległa degradacji podczas procesów ekspresji lub oczyszczania. Stężenie białka przedstawione na Rys. 1b zostało obliczone przez całkowanie tylko pasma His-DsbC-peptyd przy użyciu oprogramowania Caliper. Dane przedstawione na Rys. 1b wykazały, że wydajność oczyszczonego białka fuzyjnego wahała się od ∼1 mg/L (dla białka fuzyjnego 14) do ponad 100 mg/L (dla białek fuzyjnych 4, 5, 8, 9, 10, 18 i 24). Dla zdecydowanej większości celów (19/24) ilości oczyszczonego białka fuzyjnego pozwoliłyby na oczyszczenie peptydu docelowego w skali miligramowej na litr hodowli (zakładając wydajność rozszczepiania i oczyszczania około 100%), podczas gdy dla pozostałych pięciu peptydów (6, 7, 11, 13 i 14) potrzebna byłaby większa objętość hodowli.

Przeanalizowano korelację pomiędzy pierwotną sekwencją wariantów genów a właściwościami, co do których sugerowano, że mogą wpływać na ekspresję. Motywy deleteryjne, takie jak struktury wtórne 5′ mRNA nie mogły mieć wpływu na poziomy ekspresji, ponieważ wszystkie geny jadu były połączone z tą samą sekwencją 5′-prime, która koduje znacznik fuzyjny białka. Nie było korelacji między ekspresją białka a liczbą mostków disiarczkowych, wielkością peptydu, wartością CAI i zawartością GC (dane nie pokazane). Sugeruje to, że różnice w ekspresji genów były determinowane przez inne właściwości związane z sekwencją, w szczególności przez użycie kodonów. W celu zbadania, w jaki sposób zmiany w użyciu kodonów wpłynęły na poziom rekombinowanych peptydów, porównano stosunek pomiędzy wydajnością białek wariantów o niskiej, średniej i wysokiej ekspresji w obrębie 24 zestawów danych. Z analizy wyłączono białka fuzyjne ulegające ekspresji na niższych poziomach, co dotyczy peptydów 6, 7, 11, 13 i 14 (Rys. 1). Uzyskane dane wykazały, że wydajność białek dla wariantów o wysokiej, średniej i niższej ekspresji analizowanych peptydów była istotnie różna. I tak, niżsi ekspresorzy produkowali średnio 65,1 mg/L rekombinowanego białka fuzyjnego, podczas gdy wydajność białka fuzyjnego wyższych ekspresorów wynosiła średnio 87,55 mg/L (Rys. 1b). Różnice te są istotnie różne (p = 0,01).

Aby ocenić, jakie różnice w użyciu kodonów mogłyby wyjaśnić obserwowane różnice w ekspresji białek, porównano użycie kodonów wariantów o niskiej i wysokiej ekspresji. Tabele wykorzystania kodonów z uwzględnieniem genów zawierających znacznik fuzyjny przedstawiono w Tabeli S6. Główne różnice w użyciu kodonów dotyczą w szczególności jednego aminokwasu, cysteiny, chociaż niewielkie zmiany zaobserwowano również dla innych reszt, w szczególności argininy, asparaginy, glutaminianu, histydyny, izoleucyny, fenyloalaniny i seryny. Podsumowanie danych dotyczących użycia kodonów dla tych 8 aminokwasów przedstawiono w Tabeli 1. W przypadku genów o niskiej ekspresji zaobserwowano preferencję kodonu Cys-TGC, podczas gdy w przypadku genów o wysokiej ekspresji preferowany jest kodon Cys-TGT. Ponadto, w genach o niskiej ekspresji Cys-TGC jest używany 1,38 razy częściej niż Cys-TGT, podczas gdy w genach o wysokiej ekspresji Cys-TGT jest używany tylko 1,04 razy częściej niż Cys-TGC. Chociaż inne czynniki mogą ostatecznie działać, obserwacja ta sugeruje, że wysoka ekspresja genów kodujących peptydy wymaga podobnego udziału zarówno kodonów Cys-TGC, jak i Cys-TGT, co sugeruje, że wyższy procent jednego kodonu w porównaniu z drugim będzie wpływał na ekspresję. Wykorzystanie kodonów cysteinowych u E. coli również wskazuje na bardziej zrównoważone wykorzystanie tych dwóch kodonów (Tabela 1). Aby zbadać czynniki, które mogą wyjaśnić tę obserwację, porównano częstość występowania aminokwasów w genach E. coli oraz w 24 peptydach jadu wybranych do tego badania i związanych z nimi białkach fuzyjnych. Dane, przedstawione na Rys. 2, ujawniły, że cysteina występuje ~12,5 i 3,5 razy częściej odpowiednio w peptydach jadu (14,3%) i w rekombinowanych białkach fuzyjnych (4,1%) niż w E. coli (1,16%). Dane te sugeruj± więc, że ekspresji peptydów jadowych na wysokim poziomie sprzyja obecno¶ć dwóch kodonów cysteinowych z podobn± częstotliwo¶ci± w genach syntetycznych. Powinno to zapobiec zubożeniu jednego kodonu, gdy geny ulegają ekspresji na bardzo wysokich poziomach.

Na poziom ekspresji peptydów jadowych wpływa znacznik fuzyjny

Pięć nowych wektorów do ekspresji białek rekombinowanych w E. coli zostało skonstruowanych poprzez wstawienie różnych znaczników fuzyjnych do szkieletu pHTP1. Wszystkie znaczniki fuzyjne mają być wstawione na N-końcu rekombinowanych peptydów (Rys. 3). Dwa z wektorów kodują partnerów fuzyjnych, którzy zawierają peptyd sygnałowy w celu skierowania ekspresji peptydów jadowych do peryplazmy (pHTP4, pHTP6). Pozostałe znaczniki fuzyjne prowadzą do cytoplazmatycznej ekspresji białka rekombinowanego (Rys. 3). We wszystkich przypadkach wprowadzono znacznik 6HIS, aby umożliwić dalsze oczyszczanie białek fuzyjnych przy użyciu chromatografii powinowactwa z unieruchomionym niklem. We wszystkich syntetycznych genach wprowadzono miejsce rozszczepienia proteazy TEV (tobacco etch virus) (ENLYFQ/G), aby umożliwić usunięcie partnera fuzji. Oprócz samego znacznika powinowactwa 6HIS (pHTP1), 5 nowych wektorów zawiera izomerazę disiarczkową DsbC lub białko wiążące maltozę (MBP). Nieaktywna mutantowa pochodna DsbC została wyprodukowana w celu rozróżnienia roli DsbC w pasywnej solubilizacji (odnoszącej się do wydajności białka fuzyjnego) i aktywności redoks (odnoszącej się do wydajności prawidłowo złożonego peptydu docelowego). Schematyczne przedstawienie wszystkich wektorów użytych w tym badaniu przedstawiono na Rys. 3.

Szesnaście dobrze scharakteryzowanych peptydów jadowych (w tym 7, które były częścią eksperymentu wykorzystania kodonów opisanego powyżej) o różnym pochodzeniu i reprezentujących różne fałdy i wzory wiązań cysteinowych zostało wybranych do tego badania (patrz Tabela S3). 16 syntetycznych genów wstawiono do sześciu różnych wektorów ekspresyjnych (patrz Tabela S2 i Rys. 3), tworząc w sumie 96 rekombinowanych plazmidów. Te 96 konstruktów transformowano w BL21 (DE3) pLysS. Rekombinowane szczepy E. coli hodowano w podłożu autoindukcyjnym w celu uzyskania wysokiej gęstości komórek. Po oczyszczeniu metodą powinowactwa niklowego przeprowadzono systematyczną analizę elektrofotogramów Labchip GXII w celu określenia stężenia oczyszczonych białek oraz porównania pozornej masy cząsteczkowej oczyszczonych białek fuzyjnych z ich oczekiwaną teoretyczną masą cząsteczkową. Dane, przedstawione na Rys. 4, wykazały, że 16 peptydów rzeczywiście może być wytwarzanych przy użyciu znacznika fuzyjnego. W zależności od peptydu i zastosowanej fuzji, poziomy oczyszczonych białek fuzyjnych wahały się od zera (głównie gdy peptydy były klonowane w pHTP1) do ponad 300 mg oczyszczonego białka fuzyjnego na litr hodowli. Ogólnie rzecz biorąc, mniejsze peptydy wydawały się być łatwiejsze do wytworzenia niż większe, ale jest kilka kontrprzykładów (jak T16, który jest największym peptydem tego badania). Dla peptydów 2, 4, 7, 8, 9, 14 i 15, różne wektory wydawały się być odpowiednie do ekspresji białek fuzyjnych, ale w większości przypadków (13 z 16) wektor pHTP4 (DsbC) przewyższał wszystkie inne wektory. Z kolei, bez wyj±tku, rozpuszczalna ekspresja z samym znacznikiem 6HIS była zawsze bardzo niska. Obecność peptydu sygnałowego prowadziła do wyższych poziomów ekspresji dla DsbC we wszystkich przypadkach (pHTP4 versus pHTP2) podwajając średnio ilość ekspresjonowanego białka fuzyjnego. Dla MBP (pHTP6 versus pHTP5) jego obecność daje podobny trend (10/16). Dla pozostałych sześciu peptydów poziom cytoplazmatyczny był podobny (1, 5, 11) lub nawet znacząco lepszy (2, 7, 14). W sumie spośród 16 peptydów, gdy peryplazmatyczny DsbC nie był najlepszą opcją, najlepszą opcją był cytoplazmatyczny (dla peptydów 2 i 14) lub peryplazmatyczny (peptyd 4) MBP. Wreszcie, inaktywacja funkcji biologicznej DsbC nie miała wpływu na poziom ekspresji białek fuzyjnych peptydów jadowych, gdyż ekspresja pHTP2 i pHTP3 była, ogólnie rzecz biorąc, bardzo podobna.

Cięcie fuzji, wydajność peptydów i prawidłowy stan utlenienia zależy głównie od partnera fuzji i stężenia DTT w buforze rozszczepiającym TEV

Optymalne warunki rozszczepiania TEV w celu uwolnienia docelowych peptydów z tagów fuzji zależą od kilku parametrów, w tym stosunku enzymu do substratu, składu buforu, okresu inkubacji i temperatury. Aby zbadać, które warunki doprowadziłyby do najlepszej wydajności złożonych peptydów jadu, wybrano osiem peptydów z listy 16 wyprodukowanych w poprzednim eksperymencie (patrz plik dodatkowy 3: Tabela S3, peptydy kursywą i Rys. 4, peptydy w ramkach). Ponieważ partner fuzyjny DsbC przewyższał inne znaczniki pod względem wydajności białka fuzyjnego i ogólnej przydatności, konstrukty te wybrano do badania optymalizacji rozszczepiania TEV. Jedynym parametrem, który okazał się krytyczny i dlatego został dokładnie dostrojony w tym eksperymencie, było stężenie DTT (0, 0.1, 0.5 i 2 mM DTT) obecne w buforze rozszczepiającym. W rzeczywistości, podczas gdy proteaza TEV wymaga warunków redukujących dla optymalnego rozszczepienia, nadmierne stężenie DTT może prowadzić do redukcji wewnątrzdysiarczkowych mostków peptydów i utraty ich składania oraz aktywności biologicznej.

Po 18-godzinnym okresie inkubacji, podwielokrotność mieszaniny TEV-peptyd fuzyjny została zakwaszona. Frakcję („przed” versus „po” rozszczepieniu TEV) ładowano do Calipera w celu określenia wydajności rozszczepienia, a próbkę analizowano na LC-MS w celu ilościowego oznaczenia toksyny i potwierdzenia jej prawidłowego stanu utlenienia. Wydajność rozszczepiania, analizę mas i wydajność peptydów podsumowano na Rys. 5. Rozszczepienie zachodziło w 32 warunkach testowanych w teście (w zakresie od 30 do 100% wydajności). Zgodnie z oczekiwaniami, rozszczepienie nie było całkowite w przypadku braku DTT i całkowite przy najwyższym stężeniu DTT. Spośród ośmiu peptydów, siedem można było wykryć utlenionych w ilościach mg na litr hodowli. Z 32 próbek, 19 dało prawidłową masę utlenioną na LC-MS z różną wydajnością w zależności od stężenia DTT podczas rozszczepiania. Dla 13 pozostałych próbek nie wykryto żadnych pików na LC-MS. Spośród siedmiu peptydów prawidłowo wykrytych w różnych stężeniach DTT, cztery dawały najwyższy odzysk w 0,1 mM DTT, podczas gdy dwa nie wymagały DTT, a jeden wymagał 0,5 mM DTT dla optymalnego odzysku (Rys. 5, pogrubione). Stężenie DTT wynoszące 0.1 mM okazało się być najlepszym kompromisem, który został zachowany dla następnych eksperymentów i linii produkcyjnej projektu VENOMICS. Roztwory 7 peptydów zostały zagęszczone do 2 i 4 mg/mL i poddane temu samemu eksperymentowi z 0.1 mM DTT, aby potwierdzić, że rozszczepienie będzie możliwe w tych warunkach. Średnio, wydajność spadła o 20%, ale wystąpiła we wszystkich przypadkach (dane nie pokazane).

Po optymalizacji warunków rozszczepiania, 96 oczyszczonych białek fuzyjnych (16 w 6 wektorach, patrz Rys. 4) rozszczepiono w obecności 0,1 mM DTT przy stężeniu oczyszczonych pul (wynoszącym najczęściej od 0,2 do 2 mg/mL) zgodnie z protokołem opisanym powyżej. Po rozszczepieniu i zakwaszeniu, podwielokrotność 96 próbek analizowano metodą LC-MS w celu potwierdzenia prawidłowej masy cząsteczkowej, wydajności i stanu utlenienia końcowego rekombinowanego peptydu jadowego. W momencie wykrycia, 96 rekombinowanych peptydów miało masy cząsteczkowe zgodne z oczekiwanymi masami, biorąc pod uwagę w pełni utlenione reszty cysteinowe (Zobacz towarzyszący artykuł, aby uzyskać więcej szczegółów na temat analizy spektrometrii masowej); zredukowane formy białek nigdy nie zostały wykryte (dane nie pokazane), prawdopodobnie z powodu wytrącania nieprawidłowo utlenionych peptydów podczas etapów rozszczepiania i zakwaszania. Ostateczna wydajność dla 96 konstruktów, przedstawiona na Rys. 6, została wyrażona jako absolutna końcowa wydajność peptydów w mg/L hodowli lub znormalizowana do 100% dla każdego peptydu w stosunku do wektora użytego do ekspresji. Dane (Rys. 6) wykazały, że wszystkie 16 badanych peptydów może być wytwarzanych rekombinantowo, ale na różnych poziomach. Podobnie jak w przypadku wydajności uzyskanej dla wariantów fuzyjnych (Rys. 4), ogólna tendencja wskazuje, że krótsze peptydy są łatwiejsze do wytworzenia niż dłuższe. Ostateczna wydajność peptydów jadu była bardzo zróżnicowana, z 50-krotną różnicą pomiędzy najgorszym przypadkiem (0.3 mg/L, T10 w pHTP6) i najlepszym (17.6 mg/L, T1 w pHTP4). Zestaw danych ujawnił również, że nastąpił znaczący spadek wydajności po rozszczepieniu znacznika fuzyjnego. Jest to prawdopodobnie spowodowane trudnymi warunkami odzysku po rozszczepieniu (zakwaszanie w 5% acetonitrylu, 0.1% kwasie mrówkowym), gdzie na wierzchu proteazy TEV wytrąca się każdy rozszczepiony, źle złożony peptyd. Jak oczekiwano z wydajności syntezy, nawet jeśli odzysk jest wysoki, peptydy produkowane z pHTP1 dały najniższe ilości peptydów ogółem (średnio 0.4 mg/L, z maksimum 1.9 mg/L dla T8). W przeciwieństwie do tego, peptydy produkowane z pHTP4 (DsbC) osiągnęły najlepszą końcową wydajność dla 11 z 16 peptydów, a z tych (z wyjątkiem T11) wydajność była większa niż 2 mg/L dla każdego peptydu (średnio 4.6 mg/L). Ogólnie, fuzje DsbC (do ekspresji peryplazmatycznej lub cytoplazmatycznej) z powodzeniem wytworzyły 14 z 16 peptydów jadu. Co więcej, jeden peptyd (T7) mógł być produkowany tylko w peryplazmie, przy użyciu partnera fuzji DsbC, z wektora pHTP4. Dla peptydów produkowanych preferencyjnie z innych wektorów (T10, 12, 13, 14, 16), wydajność nie przekracza 2 mg/L, podkreślając silną ekspresję z wektora pHTP4. Dla tych pięciu peptydów, najwyższe wydajności zostały osiągnięte z ekspresją cytoplazmatyczną i partnerem fuzyjnym DsbC w trzech przypadkach, a następnie z ekspresją peryplazmatyczną z partnerem fuzyjnym MBP w dwóch przypadkach. W większości przypadków (z wyjątkiem T13, T14 i T16), fuzja eksportowana do peryplazmy (dla DsbC lub MBP) przewyższała jej cytoplazmatyczny odpowiednik, wskazując, że przynajmniej część fałdowania może zachodzić w peryplazmie, a część może zachodzić ex vivo podczas oczyszczania. Uderzającym dowodem na to, że DsbC (i prawdopodobnie MBP) działa częściowo jako pasywny czynnik solubilizujący wewnątrz bakterii jest fakt, że podczas gdy wydajność syntezy pomiędzy konstruktami DsbC i zmutowanym DsbC była bardzo podobna dla większości peptydów (Rys. 4), po rozcięciu i odzyskaniu, ogólna wydajność aktywnego peptydu jest średnio trzy razy wyższa w przypadku syntezy redoks-aktywnego DsbC niż w przypadku jego zmutowanego odpowiednika DsbC. Szczegóły wartości ilościowych zostały podsumowane w pliku dodatkowym 7: Tabela S7.

Charakter reszt C-końcowych (P1′) w miejscu rozszczepienia TEV nie wpływa znacząco na skuteczność rozszczepienia

N-końcowy koniec niektórych peptydów jadowych może przyczyniać się do ich miejsc wiązania z receptorami. Dlatego możliwe jest, że wprowadzenie jednej dodatkowej reszty na N-końcu peptydu może wpłynąć na jego aktywność biologiczną. Kanoniczne miejsce rozpoznania proteazy TEV wymaga reszty Gly lub Ser na jego C-końcu (pozycja P1′), pozostawiając nie-natywne reszty Ser lub Gly na N-końcu docelowego peptydu po usunięciu znacznika. Poprzednie badanie sugerowało, że z wyjątkiem proliny, wszystkie łańcuchy boczne aminokwasów mogą być umieszczone w pozycji P1′ miejsca rozpoznawania proteazy TEV z niewielkim wpływem na wydajność przetwarzania. Analiza została jednak przeprowadzona w optymalnych warunkach buforowych TEV. Aby być efektywnym czasowo, potok produkcji peptydów jadu nie może pomieścić dodatkowych kroków, takich jak wymiana buforu na optymalne warunki TEV. Dlatego zbadano zdolność proteazy TEV do działania w buforze elucyjnym IMAC (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, DTT 0.1 mM, pH8), który nie jest optymalnym buforem dla proteolizy TEV. Proteaza TEVSH użyta w niniejszej pracy została wybrana ze względu na łatwość jej nadprodukcji i oczyszczania w E. coli w bardzo dużych ilościach (do 100 mg/L hodowli). Jednakże, specyficzność rozszczepiania tej rekombinowanej pochodnej proteazy TEV pozostaje nieznana, w szczególności gdy różne aminokwasy zajmują pozycję P1′ jej miejsca rozpoznawania (Dr H. Berglund, komunikacja osobista). Tak więc, aby zbadać aktywność TEVSH proteazy w warunkach nieoptymalnych i gdy pozycja P1′ miejsca rozpoznawania proteazy jest zróżnicowana, wyprodukowano 20 testowych sekwencji białek fuzyjnych. Każde białko fuzyjne zawierało N-końcowy znacznik 6HIS, wewnętrzną sekwencję rozpoznawania TEV, każdą zawierającą inny aminokwas w pozycji P1´, połączoną C-końcowo z okrojoną formą białka Kin17 wiążącego DNA/RNA z Homo sapiens. Białka zostały oczyszczone i poddane rozszczepieniu proteazą TEV w tych samych warunkach, jakie zastosowano do rozszczepienia 96 znaczników fuzyjnych (patrz wyżej). Dane, przedstawione na Rys. 7, potwierdzają wcześniej zebrane dane i sugerują, że z wyjątkiem proliny (prawdopodobieństwo obecności proliny w pozycji 1 peptydów jadu naturalnego jest niskie), wszystkie inne reszty mogą być umieszczone w pozycji P1′ miejsca rozpoznawania proteazy TEV, zachowując pewną aktywność rozszczepiania. Należy jednak zwrócić uwagę na peptydy z N-końcowymi resztami Trp, Thr, Leu, Glu, Arg, Asp, Val lub Ile, w przypadku których wydajność rozszczepiania spada do 60% lub mniej. W tych przypadkach może być konieczne osiągnięcie kompromisu między wydajnością rozszczepiania a wydajnością produkcji, w zależności od tego, jak dobrze peptyd ulega ekspresji.

Zauważmy, że w przeciwieństwie do peptydów jadu, Kin17 nie zawiera reszt cysteinowych. Tak więc, udana wydajność rozszczepiania, gdy reszty cysteinowe znajdują się w pozycji 1 (86%) uzyskana z Kin17 wymaga potwierdzenia dla przypadków peptydów z cysteiną w pozycji 1, która prawdopodobnie byłaby zaangażowana w mostek disiarczkowy w natywnym białku.