Systemy indukowane tetracykliną były szeroko stosowane w drożdżach do badania kontroli transkrypcji genów w pojedynczych komórkach15,16,17,18,19,20,21,22. Aby wykorzystać rtTA w tym kontekście, stworzyliśmy dwa silne, reagujące na doksycyklinę promotory z trzema (PTET3) lub czterema (PTET4) miejscami wiązania rtTA i użyliśmy zoptymalizowanego wariantu rtTA-M27 do kontroli ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego drożdży (yeGFP)23 z tych promotorów (Rys. 1a). Kaseta ekspresyjna rtTA/PTET-yeGFP została zintegrowana w pojedynczej kopii do genomu drożdży. Wariant M2 jest identyczny z wariantem występującym w systemach ekspresji Tet-ON Advanced firmy ClonTech.
rtTA-M2 wykazuje znaczącą aktywność przy braku indukcji doksycykliną.
(a) Schemat układu doświadczalnego, w którym rtTA-M2 ulega ekspresji z konstytutywnych promotorów PMYO2 lub PTDH3, a yeGFP ulega ekspresji z promotora reagującego na tet. (b) Zależna od dawki doksycykliny aktywacja rtTA-M2 wyrażonego z PMYO2 lub PTDH3 (średnia +/- s.e.m. z trzech powtórzeń technicznych). AutoFL to komórki drożdży BY4742 typu dzikiego. (c) Rozkłady fluorescencji pojedynczych komórek uzyskanych z komórek niosących system PMYO2-rtTA przy różnych stężeniach doksycykliny. Stopniowo ciemniejsze odcienie szarości odpowiadają odpowiednio 0,25, 1, 5 i 100 μg/mL doksycykliny. AutoFL to komórki drożdży wildtype BY4742 (d) Połączone obrazy jasnego pola-fluorescencji komórek drożdży wildtype BY4742 lub komórek nieindukowanych niosących system PMYO2-rtTA.
Problem nieszczelnej transkrypcji genów docelowych jest szczególnie głęboki, gdy rtTA ulega ekspresji na wysokim poziomie. Jest to zilustrowane na Rys. 1b, który pokazuje krzywe odpowiedzi na dawkę doksycykliny PTET3, gdy rtTA-M2 ulega ekspresji z silnego promotora PTDH3. Fluorescencja była bardzo wysoka, gdy komórki były wystawione na działanie nasycających ilości doksycykliny. Niemniej jednak, z powodu nieszczelności transkrypcji z promotora PTET3, zakres dynamiczny systemu był raczej słaby, z maksymalną ekspresją ~17 razy większą przy pełnej indukcji w porównaniu z brakiem doksycykliny.
Zgodnie z modelem, w którym transaktywator ma znaczny potencjał aktywacji w stanie nieindukowanym, ekspresja rtTA-M2 ze słabego promotora PMYO2 znacznie zmniejszyła fluorescencję w nieobecności doksycykliny. Chociaż pełne nasycenie nie zostało zaobserwowane w tym systemie, redukcja nieszczelnej ekspresji spowodowała drastyczną poprawę zakresu dynamicznego, a indukcja doksycykliną spowodowała ~200-krotny wzrost fluorescencji. Jednakże, pomimo tej poprawy, zarówno dane cytometrii przepływowej (Rys. 1c) jak i dane mikroskopii fluorescencyjnej (Rys. 1d) wskazywały, że nieindukowany rtTA-M2 powoduje znaczącą ekspresję genów reporterowych, nawet gdy transaktywator ulega ekspresji ze słabego promotora.
Podczas wstępnego testowania dwunastu klonów niosących system PTDH3-rtTA-M2, przypadkowo odkryliśmy, że jeden z nich emitował niespodziewanie niską fluorescencję przy braku doksycykliny, ale prawie normalną fluorescencję przy pełnej indukcji (Rys. 2a). Późniejsze sekwencjonowanie zidentyfikowało pojedynczą mutację nukleotydową, guaninę na tyminę, która zmienia glicynę (GGG) na walinę (GTG) w reszcie 72 w obrębie białka transaktywatora. Analiza Western blot wykazała, że ta substytucja nie wpływa na obfitość białka (Fig. 2a, Insert, zobacz Uzupełniające Rys. S1 dla szczegółów), a rekonstrukcja systemu ekspresji potwierdziła, że pojedyncza mutacja guaniny na tyminę jest odpowiedzialna za zmiany obserwowane w odpowiedzi na dawkę doksycykliny (dane nie pokazane).
Mutacja glicyny 72 w rtTA-M2 obniża aktywność podstawową do niewykrywalnych poziomów.
(a) Zależna od dawki doksycykliny aktywacja wariantów rtTA-M2 wyrażonych z PTDH3 (średnia +/- s.e.m. z trzech powtórzeń technicznych). AutoFL to komórki drożdży BY4742 wildtype. W insercie, western blot (przycięty) porównujący obfitość białek zarówno rtTA-M2 jak i mutanta G72V. Wszystkie próbki zostały przygotowane i przeprowadzone w identycznych warunkach doświadczalnych. (b) Rozkłady fluorescencji pojedynczych komórek uzyskane z komórek niosących układ PTDH3-rtTA(G72V) przy różnych stężeniach doksycykliny. AutoFL to komórki drożdży wildtype BY4742. Stopniowo ciemniejsze odcienie szarości odpowiadają odpowiednio 1, 2,5, 5 i 100 μg/mL doksycykliny. (c) Połączone obrazy jasnego pola-fluorescencji nieindukowanych komórek z układami PTDH3-rtTA-M2 lub PTDH3-rtTA(G72V). (d) Kreskówka dimeru TetR, w której każdy protomer jest zabarwiony na inny kolor (żółty i turkusowy). Struktura drugorzędowa jest oznaczona, a G72 jest pokazany jako sfera.
System PTDH3-rtTA-M2(G72V) ma niezwykły zakres dynamiczny i wykazał ~500-krotny wzrost intensywności fluorescencji, gdy komórki były indukowane wysoką dawką doksycykliny w porównaniu do braku indukcji (Rys. 2b). Ponadto, emisja fluorescencji wykryta przez cytometrię przepływową jest nie do odróżnienia od autofluorescencji komórkowej przy braku doksycykliny, a wariant ten zachowuje stopniowaną odpowiedź indukcyjną oryginalnego transaktywatora. Co więcej, ekspresja reportera z nieindukowanego szczepu rtTA-M2(G72V) była niewykrywalna w mikroskopii fluorescencyjnej, nawet przy ustawieniach instrumentu, gdzie nieindukowany szczep rtTA-M2 dawał silnie nasycony sygnał (Rys. 2c).
Aby uzyskać wgląd w to, jak pojedyncza mutacja może mieć tak drastyczny wpływ na zakres dynamiki rtTA-M2(G72V), zbadaliśmy, gdzie znajduje się ta reszta w kontekście trójwymiarowej struktury białka. Struktura rtTA-M2 lub innych wariantów rtTA nie została rozwiązana. Jednak dzięki temu, że 203 z 207 aminokwasów w domenie TetR rtTA zostało zachowanych7, struktura TetR24 o wysokiej rozdzielczości daje wgląd w strukturę domeny wiążącej DNA rtTA. W strukturze TetR reszta glicynowa 72 mapuje do elastycznej pętli zlokalizowanej pomiędzy α-helisami α4 i α5, regionu łączącego domenę wiążącą DNA represora (α1-α3) z jego regionem wiążącym tetracyklinę (α5-α9)24,25 (Rys. 2d). Sugeruje to, że substytucja, która wprowadza niepolarny łańcuch boczny, wyzwala zmiany konformacyjne o dużym zasięgu, które ostatecznie wpływają na aktywność transaktywatora, przypuszczalnie poprzez usztywnienie jego struktury trzeciorzędowej.
Aby zbadać tę hipotezę, stworzyliśmy dwa dodatkowe warianty, w których reszty glicyny zostały zmutowane na alaninę lub prolinę. Mutacje te zachowują niepolarną naturę reszty walinowej, ale wprowadzają łańcuchy boczne o różnej wielkości. Przewidywaliśmy, że pojedynczy metylowy łańcuch boczny alaniny będzie mniej skuteczny w zapobieganiu nieindukowanej aktywności niż duży cykliczny łańcuch boczny proliny. Stworzyliśmy również indukowany β-estradiolem system ekspresji26 , aby uzyskać bezpośrednią kontrolę nad ekspresją rtTA-M2 i wykorzystaliśmy promotor z dodatkowym miejscem wiążącym TetR, PTET4, aby zwiększyć zdolność rtTA do wiązania DNA. System ekspresji został zilustrowany schematycznie na (Rys. 3a). Potwierdziliśmy przez analizę western blot, że cztery warianty rtTA ulegają ekspresji na podobnym poziomie przy pełnej indukcji β-estradiolem (Fig. 3b, zobacz Supplementary Fig. S2 dla szczegółów) i że fluorescencja szczepu pozbawionego rtTA wykazuje ekspresję reporterową, która jest nie do odróżnienia od szczepu drożdży BY4742 typu dzikiego, wykazując, że nie ma tła ekspresji reporterowej z PTET4 (Supplementary Fig. S3).
Niepolarne łańcuchy boczne przy reszcie 72 są kluczowym wyznacznikiem aktywności podstawowej.
(a) Schemat sieci genowej, w której warianty rtTA-M2 ulegają ekspresji z promotora indukowanego β-estradiolem, a yeGFP ulega ekspresji z promotora reagującego na tet. (b) Western blot (przycięty) porównujący obfitość białek wszystkich czterech wariantów rtTA, gdy są indukowane przez 1000 nM β-estradiolu lub bez indukcji. Wszystkie próbki zostały przygotowane i przeprowadzone w identycznych warunkach doświadczalnych. (c) Połączone obrazy jasnego pola-fluorescencji wszystkich czterech wariantów rtTA indukowanych przez 1000 nM β-estradiolu bez indukcji doksycykliną. (d) Podstawowa aktywność wariantów rtTA jako funkcja poziomu ich ekspresji zależnej od β-estradiolu (średnia +/- s.e.m. z trzech powtórzeń technicznych). W insercie, histogramy ekspresji reportera dla różnych wariantów rtTA. (e) Zależna od dawki doksycykliny aktywacja wariantów rtTA-M2 ulegających wszechobecnej ekspresji w 1000 nM β-estradiolu (średnia +/- s.e.m. z trzech replik technicznych).
Jak oczekiwano, wariant alaninowy wykazywał wyższą nieszczelną ekspresję niż wariant walinowy, a wariant prolinowy miał fluorescencję, która była nieodróżnialna od komórkowej autofluorescencji mierzonej za pomocą cytometrii przepływowej. Jest to widoczne na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej uzyskanych przy ustawieniach instrumentu, w których szczep zawierający oryginalny wariant M2 daje silny sygnał fluorescencji przy pełnej indukcji β-estradiolem (Rys. 3c) oraz z pomiarów fluorescencji metodą cytometrii przepływowej przy zmiennej indukcji β-estradiolem (Rys. 3d).
Co znamienne, substytucje aminokwasowe, które znacząco zmniejszają podstawową ekspresję genu reporterowego, mają minimalny wpływ na aktywację transkrypcyjną rtTA przy pełnej indukcji β-estradiolem i doksycykliną. Ilustruje to Rys. 3E, na którym pokazano krzywe dawka-odpowiedź dla czterech wariantów G72-M2 mierzone przy zróżnicowanej dawce doksycykliny przy pełnej indukcji β-estradiolem. Jednak substytucje aminokwasowe wpływają na wrażliwość na doksycyklinę. W naszych eksperymentach (Rys. 3e), wariant M2 miał najwyższą wrażliwość z pół maksymalnym efektywnym stężeniem (EC50) ~0,06 μg/mL, podczas gdy wariant alaninowy (EC50 ~0,2 μg/mL), wariant walinowy (EC50 ~1,0 μg/mL) i wariant prolinowy (EC50 ~1.5 μg/mL) wymagały stopniowo wyższych stężeń doksycykliny, aby osiągnąć maksymalną zdolność ekspresji.
Aby przeciwdziałać wpływowi mutacji G72 na wrażliwość na doksycyklinę, wprowadziliśmy dodatkowe mutacje w domenie TetR, które, jak niedawno wykazano, zwiększają wrażliwość na doksycyklinę10,11,27. W szczególności zbadaliśmy efekt wprowadzenia mutacji zwiększających wrażliwość (SE) V9I, F67S, F86Y i R171K.
Rysunek 4A,B pokazuje, że mutacje SE poprawiają wrażliwość na doksycyklinę wariantów SE-G72P i SE-G72A rtTA M2. Kiedy warianty rtTA ulegają ekspresji na wysokim poziomie z w pełni aktywowanego promotora indukowanego β-estradiolem (Rys. 3a), wprowadzenie mutacji SE zmniejsza EC50 doksycykliny z ~1,5 μg/mL do ~0,1 μg/mL dla wariantu G72P (Rys. 4a) i z ~0,2 μg/mL do ~0,02 μg/mL dla wariantu G72A (Rys. 4b). Efekt ten wystąpił bez zauważalnej zmiany w ekspresji reportera przy pełnej indukcji doksycykliną i nie pogorszył zakresu dynamicznego wariantu SE-G72P. Co ciekawe jednak, mutacje SE spowodowały znaczącą utratę zakresu dynamicznego dla wariantu SE-G72A poprzez zwiększenie ekspresji genu reporterowego przy braku doksycykliny.
Wrażliwość na doksycyklinę nowatorskich wariantów rtTA może być poprawiona poprzez dodanie mutacji zwiększających wrażliwość.
(a,b) Zależna od dawki doksycykliny aktywacja wariantów rtTA ulegających ekspresji wszechobecnej w 1000 nM β-estradiolu (średnia +/- s.e.m. z trzech powtórzeń technicznych). (c-f) Mapy cieplne przedstawiające ekspresję reportera (jednostki arbitralne) jako funkcję ekspresji transaktywatora zależnego od β-estradiolu i indukcji doksycykliną.
Aby dokładniej zbadać związek między poziomem ekspresji rtTA, EC50 doksycykliny i aktywnością podstawową, zbadaliśmy wpływ jednoczesnego zróżnicowania indukcji β-estradiolem i doksycykliną na ekspresję genów reporterowych. Zbadaliśmy cztery różne warianty M2: wariant oryginalny, wariant oryginalny z mutacjami SE, wariant G72P i wariant SE-G72P.
Dwuwymiarowa powierzchnia dawka-odpowiedź dla oryginalnego wariantu M2 zawiera trzy odrębne regiony ekspresji reporterowej odpowiadające niskiej, pośredniej i wysokiej ekspresji genów reporterowych. Regiony te są oznaczone jako I, II i III na Rys. 4c-f. Region III to miejsce, gdzie ekspresja reportera jest maksymalna, co zależy zarówno od poziomu ekspresji rtTA, jak i poziomu indukcji doksycykliną. Region II to miejsce, gdzie ekspresja reportera jest względnie wysoka, nawet gdy indukcja doksycykliną jest niska. Region I to miejsce, gdzie ekspresja reportera jest niska z powodu niskiego poziomu β-estradiolu lub niskiej indukcji doksycykliną.
Mutacje SE same w sobie (Rys. 4d) dramatycznie zwiększają ekspresję reportera w części regionu I i całym regionie II. Potwierdza to, że mutacje te mogą zwiększać wrażliwość w wąskim zakresie poziomów ekspresji rtTA, ale także powodują znaczący wzrost aktywności rtTA w stanie nieindukowanym. W przeciwieństwie do tego, sama mutacja G72P (Rys. 4e) dramatycznie redukuje ekspresję reportera w całym regionie II i w części regionu III. Potwierdza to, że głęboki wpływ tej mutacji na aktywność rtTA w stanie nieindukowanym jest związany z ogólną utratą wrażliwości na doksycyklinę.
Rycina 4f przedstawia efekt połączenia mutacji SE i G72P. W porównaniu z wariantem SE (ryc. 4d), dodanie mutacji G72P przeciwdziała wzrostowi ekspresji reportera spowodowanemu przez mutacje SE w regionie I i zmniejsza ekspresję reportera do niewykrywalnych poziomów w tym regionie. Ponadto, w porównaniu z wariantem G72P (ryc. 4e), dodanie mutacji SE prawie całkowicie przywraca utratę ekspresji reportera w regionie III. Innymi słowy, czułość ulega poprawie bez wprowadzania nieszczelnej ekspresji genów docelowych na jakimkolwiek poziomie ekspresji transaktywatora.