Topoisomerase based cloning (TOPO clonagem) é um método de clonagem de DNA que não usa enzimas de restrição ou ligase, e não requer procedimentos pós-PCR. Parece fácil, certo? A técnica se baseia na capacidade básica da adenina (A) e da timina (T) para hibridizar e formar ligações de hidrogênio. Este post concentra-se na clonagem “sticky end” TOPO (também chamada TOPO-TA); no entanto, a técnica de clonagem TOPO também foi adaptada para a clonagem de extremidade romba.
Então, como funciona a clonagem TOPO?
Como ilustrado na Figura abaixo, a saliência “A” no inserto azul do produto PCR vem do uso da Taq polimerase para a etapa de amplificação, uma vez que a Taq polimerase deixa uma única deoxiadenosina (A) nas extremidades de 3′ dos produtos PCR. O “T” complementar no par vem de um backbone I-linearizado de topoisomerase. A topoisomerase I de DNA (representada como uma nuvem verde) funciona tanto como uma endonuclease de restrição como como uma ligase, clivando e juntando novamente as extremidades de DNA super-recobertas para facilitar a replicação.
A técnica TOPO utiliza especificamente a vaccinia topoisomerase I isolada pelo vírus Vaccinia, pois esta enzima reconhece a sequência de DNA 5′-(C/T)CCTT-3′ e digere o DNA duplamente encalhado nesta sequência. A energia desta quebra é armazenada como uma ligação covalente entre o cordão de DNA clivado 3′ e um resíduo de tirosil da topoisomerase I (1). Se um grupo de hidroxila 5′ de uma cadeia de DNA diferente aparecer, ele pode atacar essa ligação covalente, unindo assim as duas cadeias de DNA e liberando topoisomerase (2).
Estes kits TOPO disponíveis comercialmente hoje em dia fornecem vetores ou braços de clonagem com resíduos de desoxitymidina (T) salientes de 3′ que estão covalentemente ligados à topoisomerase. Os vectores nestes kits também têm frequentemente o local da topoisomerase inserido num cassete de beta-galactosidase permitindo a um pesquisador realizar uma triagem azul-branco após a transformação – a auto união das extremidades vectoriais resulta na produção de colónias azuis que não precisam de ser colhidas e sequenciadas para potenciais clones positivos. Uma vez que você introduza o seu 3′-end “A” overhang insert, a magia da clonagem TOPO acontece.
Basic procedure
Deixemos quebrar os passos necessários para a clonagem TOPO:
1. Crie o seu produto PCR: Crie primers padrão (sem necessidade de adicionar locais de restrição únicos nas extremidades) e amplifique sua sequência de interesse com Taq polimerase usando seu protocolo PCR favorito.
2. Configure a Reação de Clonagem TOPO: Misture o produto PCR e o TOPO Vector.
3. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente: Pode colocar a sua reacção em gelo se estiver a planear transformar imediatamente OU pode armazenar a reacção a -20C durante a noite.
4. Transforme a reacção de clonagem TOPO em células competentes: Você pode usar seu protocolo padrão de laboratório para isso; entretanto, você deve reduzir seu tempo de incubação em gelo para 5 minutos (incubar os 30 minutos completos não vai melhorar significativamente a eficiência da transformação).
5. Seleccione e analise 10 colónias brancas ou azuis claras: Pode confirmar a presença do seu insert por PCR, digestão de restrição ou sequenciação.
Pontas de Pro
- li>Não adicione fosfatos de 5′ aos seus iniciadores PCR; precisa desse grupo hidroxil livre!
- Pode querer incluir tempo extra de extensão após o último ciclo de PCR para se certificar de que o “A” é adicionado a todos os produtos PCR.
- Leve em conta que a Taq polimerase tem uma taxa de erro de cerca de 1 em 3.500 bases. Tipicamente as polimerases com funcionalidade de revisão são usadas no lugar da Taq para reduzir as taxas de erro; no entanto, as polimerases de revisão também removerão todas as extremidades não reparadas de 3′ no seu produto PCR. Se necessitar de diminuir a taxa de erro, utilize um destes métodos para assegurar que o seu insert retém a saliência de 3′ A:
- Utilize uma mistura de enzima de revisão e Taq, com Taq usada numa razão de excesso de 10:1.
- Gel purifique o seu produto PCR e incube-o com tampão, Taq e dATPs a 72C durante 10-15min.
- Ao misturar o produto PCR com o vector TOPO, pode querer adicionar sal extra à sua reacção:
Topoisomerase I é libertada do vector quando o produto PCR e o vector ligam; no entanto, pode potencialmente rebobinar e cortar o ADN recém-ligado. O sal ajuda a prevenir que a topoisomerase I seja rebobinada, o que resulta em moléculas mais intactas. (Note que a quantidade de sal que adiciona dependerá do facto de estar a planear transformar a sua reacção em E. coli quimicamente ou electro-competente – o excesso de sal provoca um arco eléctrico durante a electroporação, o que causaria a falha da electroporação).
- Quando incubar à temperatura ambiente, não é recomendado que exceda o limite de tempo de 5 minutos (foram relatadas eficiências de transformação mais baixas com uma incubação mais longa); no entanto, pode ser necessário incubar durante 20-30 minutos se o seu produto PCR estiver numa concentração baixa ou se estiver a clonar um inserto extremamente grande.
- Li>Desde que a reacção de ligadura padrão seja bastante rápida, certifique-se de que se mantém organizada e prepare tudo o que necessita para o próximo passo antes de proceder.
- Li> Pré-aquecimento da sua placa contendo antibióticos antes de proceder à sua transformação pode permitir-lhe ver colónias dentro de 8 horas.
1. Shuman S. “Recombinação mediada pelo vírus da vacina DNA topoisomerase I em Escherichia coli é sequência específica”. Proc Natl Acad Scien U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796. PubMed Central PMCID: PMC52876.
2. Nova abordagem à clonagem molecular e síntese de polinucleotídeos usando vaccinia DNA topoisomerase. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dez 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
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