Aplicarea locilor microsateliți pentru identificarea moleculară a genotipurilor de elită, analiza clonalității și diversității genetice la Aspen Populus tremula L. (Salicaceae)

Abstract

Sistemele de testare pentru identificarea moleculară a genotipurilor de elită de aspen (Populus tremula L.) micropropagate au fost dezvoltate pe baza locilor microsateliți (SSR). Dintre cei 33 de loci microsateliți testați, 14 au fost selectați datorită amplificării PCR durabile și variabilității substanțiale în clonele de elită de aspen destinate înființării de plantații forestiere cu rotație rapidă. Toate cele opt clone testate aveau genotipuri multilocus diferite. Printre cei 114 arbori din trei arborete native de referință situate în apropierea plantațiilor înființate, au fost identificate 80 de haplotipuri, în timp ce unele genotipuri repetate au fost atribuite unor clone naturale care au apărut ca urmare a germinării. Setul selectat de markeri SSR a arătat o identificare individuală fiabilă, cu o probabilitate scăzută de apariție a genotipurilor identice de aspen (un minim de și 1 × 10-4 pentru indivizi neînrudiți și înrudiți, respectiv). Sunt descrise studii de caz care demonstrează aplicațiile practice ale sistemului de testare, inclusiv analiza structurii clonale și a nivelurilor de diversitate genetică în trei arborete naturale de aspen care cresc în regiunile în care au fost înființate plantații alcătuite din clone de elită.

1. Introducere

Degradarea continuă a pădurilor native din întreaga lume din cauza supraexploatării necesită introducerea unor forme intensive de silvicultură care să favorizeze nu numai efectul economic, ci și conservarea resurselor genetice de plante lemnoase. Această sarcină declară obținerea și menținerea unor genotipuri elitiste de arbori forestieri destinate plantațiilor forestiere cu rotație rapidă. În urma ameliorării, a selecției mutațiilor și/sau a ingineriei genetice apar noi soiuri și varietăți foarte productive și rezistente la factorii abiotici, la dăunători și agenți patogeni. Înmulțirea clonală a acestor indivizi remarcabili asigură fixarea trăsăturilor utile ale acestora atât pentru experimentele ulterioare de ameliorare, cât și pentru înființarea de plantații forestiere specifice. În special, înmulțirea microclonală prin cultură in vitro permite clonarea rapidă, la scară largă și rentabilă a indivizilor cu trăsăturile dorite, în special atunci când înmugurirea sau altoirea tradițională este imposibilă sau necesită eforturi speciale .

Din moment ce clonele de plante diferite din punct de vedere morfologic și anatomic pot avea un aspect similar, este esențial să se identifice în mod fiabil acele clone, inclusiv să se facă o discriminare între ele și față de indivizii conspecifici sau reprezentanții altor specii strâns înrudite. În silvicultură, problema identificării indivizilor este deosebit de crucială, deoarece aspectul exterior al arborilor depinde foarte mult de parametrii de mediu . În anumite stadii ale ontogenezei naturale a arborilor forestieri, de exemplu, în cazul răsadurilor și al puieților și, mai ales, în cazul calusurilor sau al explantelor în culturi celulare in vitro, indivizii pot fi greu de distins nu numai individual, ci și în ceea ce privește diagnosticarea speciilor. Timpul îndelungat de generare și maturizarea tardivă din punct de vedere ontogenetic face ca sarcina de pasportizare genetică a clonelor de elită la plantele lemnoase să fie reală. Procesul complex în mai multe etape de obținere, înmulțire și introducere a soiurilor de elită prin ameliorare sau inginerie genetică crește probabilitatea diferitelor erori.

Markerii genetici moleculari (MGM) s-au dovedit a fi instrumente foarte eficiente pentru identificarea individuală. Dintre diferitele clase de MGM, microsateliții sau repetările de secvență simplă (SSR) se potrivesc cel mai bine cerințelor sistemelor de testare pentru identificare datorită specificității lor, codominanței, neutralității selective, bogăției alelice suficiente și heterozigozității cauzate de o rată de mutație ridicată. În plus, datorită conservatorismului relativ al genomului în cadrul genurilor și familiilor de plante, markerii SSR și primerii PCR pentru amplificarea lor pot fi transferabili de la un taxon la altul.

La mai multe specii de plop, au fost demonstrate cu succes amprentarea ADN-ului și diferențierea clonelor, a cultivarelor și a soiurilor prin markeri moleculari, inclusiv loci SSR .

În această lucrare, raportăm dezvoltarea unui sistem de testare bazat pe SSR pentru identificarea genetică moleculară a genotipurilor de elită micropropagate de plop, Populus tremula L., care vizează înființarea de plantații forestiere țintă cu creștere rapidă în mai multe regiuni din Federația Rusă și prezentăm rezultatele aplicării sale pentru discriminarea genotipurilor individuale, studii ale structurii clonale în arboretele naturale de aspen și estimarea variabilității genetice în populații.

2. Material și metode

Dezvoltarea sistemului de testare pentru identificarea genotipurilor de elită a cuprins selectarea unui set de markeri specifici care să corespundă cerințelor de discriminare de înaltă rezoluție a clonelor și testarea fiabilității și puterii de identificare a acestuia pe un set de genotipuri de elită și pe un număr suficient de reprezentanți ai unei specii studiate.

2.1. Material vegetal

Clonele de aspen de elită și clonele hibride utilizate pentru dezvoltarea sistemelor de testare pentru identificarea moleculară au fost obținute din culturi celulare micropropagate menținute în filiala Pushchino a Institutului de chimie bioorganică Shemyakin și Ovchinnikov, Academia Rusă de Științe (Pushchino, Rusia). Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.

Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.

Figura 1

Hartă de localizare a plantațiilor realizate din clone de elită și a arboretelor de aspen nativ corespunzătoare folosite ca populații de referință. (1) Prisady, (2) Voronej, și (3) Yoshkar-Ola.

Prisady. Parcela experimentală situată la 1 km spre vest de așezarea Prisady în Serpukhovsky Raion (district) din Moscova oblast’ (Rusia). Frunzele a 52 de arbori de plop tineri sau de vârstă medie (aproximativ 10-25 de ani) dintr-un arboret natural cu mai multe vârste situat în imediata apropiere (1 km) de această parcelă au fost folosite ca populație de referință.

Voronej. Șaptesprezece arbori au fost eșantionați într-un arboret adiacent parcelei experimentale stabilite în Voronej Oblast. Alți 13 arbori au fost colectați de-a lungul malului râului Voronej în cadrul orașului Voronej, în apropierea plantației.

Yoshkar-Ola. Tânărul arboret nativ de plop a fost sursa arborilor utilizați ca populație de referință pentru o parcelă experimentală situată în apropierea orașului Yoshkar-Ola, Republica Mari-El. Au fost colectate frunze de la 32 de arbori.

Pentru a minimiza eșantionarea ocazională a indivizilor care au origine vegetativă (prin germinare), am colectat frunze de la arbori aflați la o distanță nu mai mică de 15-20 m unul față de celălalt. Această abordare a fost utilizată pentru includerea în eșantioanele de referință a unor puieți predominant polenizați deschis, având o diversitate genetică maximă. Cu toate acestea, bazându-ne exclusiv pe aspectul exterior al arborilor și pe distanța dintre ei, nu a putut fi evitată eșantionarea ramurilor apărute în urma germinării, iar analiza genetică ulterioară a confirmat acest lucru.

Ramurile cu frunze au fost tăiate cu ajutorul unui cutter mecanic cu un catarg telescopic din aluminiu. Lăstarii cu frunze colectați au fost plasați în saci de plastic pentru cel mult 6 zile la +4°С până la prelucrare. Pregătirea probelor a inclus extragerea ADN-ului și plasarea fragmentelor de țesut foliar de rezervă în pungi cu fermoar etichetate cu gel de silice pentru stocarea pe termen lung. În afara perioadei de vegetație activă, mugurii vegetativi latenți pot fi utilizați cu succes pentru extragerea ADN-ului.

2.2. Extracția ADN-ului

Pentru extracția ADN-ului s-au folosit fragmente de frunze de aproximativ 350-500 mg prelevate din explantele care cresc in vitro pe un mediu special (REF) în plăci Petri.

Pentru arborii din populațiile autohtone, am extras ADN-ul din fragmente de 350-500 mg de țesuturi foliare proaspete sau 200-300 mg de țesuturi foliare uscate cu silice prin metoda modificată a bromurii de cethyltrimethylammonium bromide (CTAB) .

2.3. Analiza microsateliților

Microsateliții, sau SSR, reprezintă o clasă de secvențe de ADN repetate în tandem cu motive scurte (1-6 perechi de nucleotide, pb) care diferă în număr de copii între indivizi din cauza ratei ridicate de mutație. Alelele multiple care se găsesc de obicei în loci microsateliți codominanți creează o mare varietate de combinații genotipice unice, ceea ce asigură o identificare fiabilă a acestora, în special atunci când se utilizează un număr suficient de loci. Din punct de vedere tehnic, analiza polimorfismului SSR necesită doar o reacție în lanț a polimerazei (PCR) și o electroforeză ulterioară (gel sau capilară) pentru analiza fragmentelor. Pentru dezvoltarea sistemului de testare am ales varianta metodei care utilizează doar echipamente de bază și reactivi simpli. Acest lucru a asigurat o reproductibilitate crescută a procedurilor în orice laborator PCR și a permis obținerea unei rentabilități ridicate a analizei, care este crucială pentru identificarea practică a clonelor la scară largă.

Din moment ce numărul substanțial de loci SSR nucleari pentru plopi a fost găsit în literatura de specialitate și în bazele de date de primeri, am decis să selectăm din mai multe publicații și să testăm primeri care pot fi utilizați pentru identificarea de rutină a genotipurilor pe baza unui echipament foarte simplu, fără a utiliza analizoare de ADN. Un set inițial de primeri SSR pentru potențiala lor utilizare ca elemente ale sistemului de testare a identificării moleculare la plopi a fost rezultatul căutării în bazele de date bibliografice (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) și în Molecular Ecology Resources Primer Database (http://tomato.bio.trinity.edu/).

Amplificarea ADN a fost realizată cu ajutorul kiturilor PCRCore (Isogen Laboratories, Ltd., Moscova, Rusia) în laboratoarele BioRad Inc. (SUA) Dyad Thermo cycler. Loci microsateliți (enumerați în tabelul 2) din seriile ORPM și WPMS au fost amplificați cu primeri specifici la o concentrație de 1 mmol/mL și 5-10 ng de ADN țintă, utilizând următorul profil de temperatură: (1) denaturare inițială la 94°С timp de 3 min; (2) 30 de cicluri constând în 30 de secunde de denaturare la 94°С, recoacere a amorselor la temperatură și timp variabile (a se vedea tabelul 3 pentru temperatura finală de recoacere recomandată după ajustarea procedurii) și alungire la 72°С timp de 1,5 min, urmate de (3) alungire finală la 72°С timp de 10 min și (4) răcirea amestecului PCR la 4°С.

Loci Primer sequences (5′- 3′) Repeat motif Fragment size (bp)3 ORPM141 F- GGGCTGCAGCAGATATTGA R- CCAAAGGAACCCAAAGAAGA (GCTC)4 146–162 ORPM181 F- AGCAGAGATCGATGCTGAGG R- AATTTCTCGCTTCTCGCATT (TTTA)4 205 ORPM361 F- AGCCTCCAAACACCATGAAC R- ACAGTGGTGTGGATCCTGCT (GAAA)4 213 ORPM601 F- ATAGCGCCAGAAGCAAAAAC R- AAGCAGAAAGTCGTAGGTTCG (AAT)5 212 ORPM791 F- GAAGCTGAAAACAACAACAAACA R- GGGTTTTTAACATAATAAAAGCTTGG (AAT)4 160 ORPM811 F- GCTGCAGCCAAACAAAGC R- CAGAAATCCCACCCAAACC (TATT)4 142–158 ORPM841 F- CTGCAGCCTTACCACCATTT R- CGTGTTCGAGATTGGGATTT (AAG)4 171 ORPM861 F- CCACATCCATAGCTCTGCAAC R- GTACTACCTCGCCTGCCAAC (CTT)5 204 ORPM1071 F- AATCTGGTGGCTTGCCTCT R- TTGAGGAACACGTGCAGACT (TAAA)4 190 ORPM1171 F- CCCCCTAATTACCTTGGAAAC R- TTGTTTGTATCTCCTCCGTTGA (ATTA)4 210 ORPM1581 F- GCTGAAACATCCTTCATGGTC R- CGAAGCTGCATAAGCATCAA (TTTC)4 200 ORPM1931 F- CCGCTGGATTTGTTTGTTTT R- TGAGCAGAAAGATGCGAAGA (ATTTT)4 187–207 ORPM2021 F- TCGCAAAAGATTCTCCCAGT R- TTCAAATCCCGGTAATGCTC (TAA)5 184–190 ORPM2061 F- CCGTGGCCATTGACTCTTTA R- GAACCCATTTGGTGCAAGAT (GCT)7 190–208 ORPM2201 F- AGCTAGCCTGTCGTCAAGGA R- CAAGGAAGCATTCTCGCAAT (TTTA)6 178–222 ORPM2961 F- CGAAGCCATTGACCCAGTAT R- GGGCATCTCTCTCCTTTCAA (GTTCTG)4 199 ORPM3121 F- GTGGGGATCAATCCAAAAGA R- CCCATATCAAACCATTTGAAAAA (CCT)6 194 ORPM3661 F- CCTTGAGGGGACACTTCGAT R- AAAGAGTTGAGCCCTTGGTG (TTA)5 156 ORPM3711 F- CCGGACTCTCACAAATCTCC R- TGCTTTTGCTCCTGGTTCTT (TCTT)6 192–200 ORPM3721 F- AGCTCTTCTGCTGGTGCTGT R- GAGGGAGGGAGGGTAAAAGA (TCTT)5 190 ORPM4151 F- CTCGGTGCAAATATCGGTTC R- AGATCGATGGTCCTTTCCTG (GGCG)4 225 ORPM4841 F- CAAAATGGCAATCCAAGGTT R- CCAAGCTTCCAATTGAGTCC (TTAA)4 190–206 ORPM4881 F- CTCCAGCCGCTTCTATCCTT R- TGTCGTGGGAAAGAACCAGT (TTA)6 200 ORPM4961 F- CAGCAGTGCAAGCTCCTAAA R- GGCCACTGACAGAGACCAAG (GGA)4 185 WPMS142 F- CAGCCGCAGCCACTGAGAAATC R- GCCTGCTGAGAAGACTGCCTTGAC (CGT)28 215–287 WPMS152 F- CAACAAACCATCAATGAAGAAGAC R- AGAGGGTGTTGGGGGTGACTA (CCT)14 201–219 WPMS162 F- CTCGTACTATTTCCGATGATGACC R- AGATTATTAGGTGGGCCAAGGACT (GTC)8 139–184 WPMS172 F- ACATCCGCCAATGCTTCGGTGTTT R- GTGACGGTGGTGGCGGATTTTCTT (CAC)15 122–146 WPMS182 F- CTTCACATAGGACATAGCAGCATC R- CACCAGAGTCATCACCAGTTATTG (GTG)13 219–248 WPMS192 F- AGCCACAGCAAATTCAGATGATGC R- CCTGCTGAGAAGACTGCCTTGACA (CAG)28 180–234 WPMS202 F- GTGCGCACATCTATGACTATCG R- ATCTTGTAATTCTCCGGGCATCT (TTCTGG)8 210–222 WPMS212 F- TGCTGATGCAAAAGATTTAG R- TTGGAACTTCAACATTCAGAT (GCT)45 287–326 WPMS222 F- ACATGCTACGTGTTTGGAATG R- ATCGTATGGATGTAATTGTCTTA (TGA)23 100–135

Comments: 1Tuskan et al., 2004 ; 2Smulders et al., 2001 ; 3by literature data in different Populus species (P. tremula, P. x canescens, and P. alba).

Table 2

Microsatellite loci tested for PCR amplification in aspen.

Locus PCR amplification Fragment size range (bp) Number of alleles Status1 Included in testing system ORPM14 Yes 146–162 4 P No ORPM18 No — — N No ORPM36 Yes 217 1 M No ORPM60 No — — N No ORPM79 No — — N No ORPM81 No — — N No ORPM84 No — — N No ORPM86 Yes 204–216 4 P No ORPM107 No — — N No ORPM117 Yes 218 1 M No ORPM158 Yes 200 1 M No ORPM193 Yes 182–207 6 P Yes ORPM202 Yes 184–193 5 P Yes ORPM206 Yes 190–196 3 P Yes ORPM220 Yes 178–198 5 P Yes ORPM296 Yes 201–183 4 P Yes ORPM312 Yes 189–201 4 P No ORPM366 No — — N No ORPM371 Yes 192–200 3 P No ORPM372 No — — N No ORPM415 Yes ~280 1 M No ORPM484 Yes 190–206 3 P No ORPM488 Yes 197–203 2 P No ORPM496 No — — N No WPMS14 Yes 224–243 3 P Yes WPMS15 Yes 189–207 5 P Yes WPMS16 Yes 139–184 9 P Yes WPMS17 Yes 122–146 7 P Yes WPMS18 Yes 219–248 7 P Yes WPMS19 Yes 210–252 9 P Yes WPMS20 Yes 210–222 4 P Yes WPMS21 Yes 196–240 5 P Yes WPMS22 Yes 115–135 3 P Yes

1P: polymorphic, M: monomorphic, and N: no PCR amplification.

Tabel 3

Rezultatele testării lociilor microsateliți la aspen.

Produsele PCR au fost supuse electroforezei în blocuri de gel de poliacrilamidă 6% folosind sistemul tampon Tris-EDTA-borat. După ce gelurile de electroforeză au fost colorate în soluție de bromură de etidiu și vizualizate în lumină UV, imaginile grafice au fost capturate și salvate cu ajutorul sistemului de documentare pe gel Doc-Print II Vilber Lourmat și prelucrate în editori grafici. Dimensiunea fragmentelor a fost estimată cu ajutorul unui software specializat (Photo-Capt). ADN-ul din plasmidul E. coli pBR322, restricționat de endonucleaza HpaII, a fost utilizat ca marker de greutate moleculară.

2.4. Analiză statistică

Identitatea clonei a fost determinată utilizând analiza meciurilor multilocus pentru datele codominante. Probabilitatea de genotip (GP), însemnând probabilitatea de apariție a unei anumite combinații multilocus în populație, și probabilitatea de identitate, estimând probabilitatea de potrivire aleatorie a doi indivizi neînrudiți (PI) sau înrudiți (PIsib) prin intermediul unui anumit set de loci, au fost calculate pe baza distribuției frecvențelor alelelor în eșantioanele de populație.

Corespunderea distribuției genotipurilor observate pentru fiecare locus SSR cu cea așteptată conform echilibrului Hardy-Weinberg a fost testată prin criteriul chi-pătrat. Numărul de alele și heterozigozitățile observate și așteptate au fost calculate pentru fiecare eșantion nativ. Am utilizat statistica F a lui Wright pentru evaluarea subdiviziunii genetice între eșantioanele de populație studiate. Toate calculele menționate mai sus au fost efectuate în add-in-ul pentru MS Excel, GenAlEx 6.5 .

3. Rezultate și discuții

3.1. Dezvoltarea sistemelor de testare bazate pe SSR pentru identificarea genotipurilor la Aspen

Pentru testarea inițială, am selectat 33 de loci microsateliți heterologici tri-, tetra-, penta- și hexanucleotide din două serii; seria ORPM a fost proiectată mai întâi pentru Populus trichocarpa și seria WPMS a fost proiectată pentru Populus nigra . Caracteristicile acestor loci sunt prezentate în tabelul 2. Testele inițiale au fost efectuate pe probe de ADN din trei clone (47-1, PtV22 и С-control) dintr-o colecție in vitro depozitată și înmulțită în filiala Pushchino a Institutului de Chimie Bioorganică Shemyakin și Ovchinnikov, Academia Rusă de Științe (Pushchino, regiunea Moscova, Rusia). În această etapă, variabilitatea lor a fost, de asemenea, testată pe 20-24 de specimene de plop sălbatic din Novosibirsk Oblast (Siberia de Vest, Rusia) și Krasnoyarsk Krai (Siberia Mijlocie, Rusia).

În urma primei etape de testare, 24 de loci au fost amplificați cu succes, iar alți nouă loci nu au reușit să producă produse PCR. Din cei 24 de loci care au produs fragmente PCR, 20 de loci s-au dovedit a fi variabili, cu un număr de alele de la două la nouă, în timp ce patru loci care au fost amplificați cu succes au fost monomorfi (tabelul 3). După teste suplimentare la regimuri PCR variabile, am selectat în cele din urmă 14 loci cu o amplificare fiabilă și un nivel substanțial de polimorfism pentru a fi incluși în sistemul de testare pentru identificarea genetică moleculară. În figurile 2(a) și 2(b) sunt prezentate exemple de variabilitate a lociilor microsateliți selectați la aspen.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

(a) Modele electroforetice ale PCR-amplificat SSR loci ORPM202, ORPM206, ORPM220, ORPM296 și ORPM312 la aspen. Loci: benzile 1-4: ORPM202; benzile 6-9: ORPM206; benzile 10-13: ORPM220; probe: 1, 6, 6, 10, 15, și 19, aspen din populația nativă; 2, 7, 11, 16, și 20, clona С-control; 3, 8, 12, 18, și 21, clona 47-1; 4, 9, 13, 18, și 22, clona PtV22. Rândurile 5, 14 ș i 23: marker de greutate moleculară ADN (ADN din plasmidul E. coli pBR322, digerat cu endonucleaza de restricție HpaII). (b) Modele electroforetice ale lociurilor SSR WPMS15, WPMS17, WPMS18, WPMS19, WPMS21 și WPMS22 amplificate prin PCR la aspen. Loci: benzile 1-4: WPMS15, benzile 6-9: WPMS17, benzile 10-13: WPMS18, benzile 15-18: WPMS19, benzile 19-22: WPMS21, și benzile 24-27: WPMS22. Eșantioane: 1, 6, 6, 10, 15, 19 și 24, plop din populația naturală; 2, 7, 11, 16, 20 și 25, clona С-control; 3, 8, 12, 16, 21 și 26, clona 47-1; 4, 9, 13, 18, 22 și 27, clona PtV22. Rândurile 5, 14 și 23, markerul de greutate moleculară ADN (ADN din plasmidul E. coli pBR322, digerat cu endonucleaza de restricție HpaII).

Genotipurile multilocus obținute de opt clone de elită și genotipurile de referință ale arborilor sălbatici din arborete indigene sunt enumerate în tabelul S1 din materialul suplimentar disponibil online la http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. Am analizat până la 8 ramete prelevate în diferite faze ale înmulțirii microclonale. În cadrul clonei, genotipurile au fost stabile și s-au reprodus fără ambiguitate între ramets, indiferent de faza de înmulțire. După excluderea rameturilor din același genet, atât clonele de elită, cât și genotipurile de aspen din populațiile native incluse în eșantioanele de referință au fost 100% diferite. Probabilitatea de apariție a genotipurilor (GP: probabilitatea de apariție a genotipurilor) între clonele de elită a variat de la 2,4 – 10-21 la 1,7 – 10-11, iar între arborii din eșantioanele de referință de la 4,0 – 10-24 la 5,8 – 10-9. Probabilitatea de coincidență ocazională a două genotipuri neînrudite (PI: probabilitatea de identitate) a variat de la 4,8 – 10-10 în Yoshkar-Ola la 4,3 – 10-13 în Prisady. Ajustată la probabilitatea teoretică de descendență a indivizilor comparați din aceiași strămoși, o estimare mai conservatoare (PIsibs) a fost cuprinsă între 1,0 – 10-4 în Yoshkar-Ola și 9,3 – 10-6 în Voronej. Toate valorile sunt destul de scăzute, astfel încât frecvența teoretică de apariție a genotipurilor repetabile datorită recombinării diferiților gameți în cursul reproducerii semințelor nu a depășit aproximativ 1 combinație de alele identice găsite accidental din 10000 de comparații. Relația dintre PI și PIsibs în funcție de numărul de loci utilizați este prezentată în figura 3 și demonstrează probabilitatea practic neglijabilă de apariție a genotipurilor identice în cazul utilizării primilor 7-8 loci selectați pentru includerea în sistemul de testare. Utilizarea tuturor celor 14 loci asigură fiabilitatea și robustețea suplimentară a procedurii.

Figura 3

Relația dintre PI și PIsibs în funcție de numărul de loci utilizați. 1 reprezintă locul 1, 2 reprezintă locul 1 + 2 și așa mai departe.

Dezvoltarea lociilor microsateliți pentru speciile din genul Populus a început la sfârșitul secolului al XX-lea, împreună cu tehnologiile de markeri genetici moleculari. În 1998, unul dintre primele seturi de primeri pentru amplificarea locilor SSR dinucleotide a fost proiectat pentru plopii tremurători americani, Populus tremuloides . În această lucrare a fost demonstrată o amplificare încrucișată cu succes a acelorași markeri pentru alte câteva specii de plop, P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis și P. maximowiczii. Autorii au postulat, de asemenea, spectrul larg de aplicații ale locilor SSR în diferite scopuri, inclusiv identificarea clonelor, analiza împerecherilor controlate, cartografierea genomului, selecția asistată de markeri, testele de diversitate genetică și sprijinirea programelor de conservare și gestionare durabilă a resurselor genetice forestiere. Studii ulterioare au furnizat alți opt loci SSR dinucleotide pentru Populus tremuloides . De atunci, au fost dezvoltați loci microsateliți pentru alte specii, inclusiv pentru P. nigra . Unii dintre acești loci au fost, de asemenea, amplificați la P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans și P. lasiocarpa. Au fost concepuți primeri specifici pentru loci SSR pentru Populus euphratica . Ulterior, acest set a fost utilizat pentru dezvoltarea de panouri multiplex utilizate pentru estimarea diversității genetice la această specie .

Secvențierea de generație următoare a fost cea mai eficientă modalitate de detectare a repetițiilor în tandem în genomul plopului și de proiectare pe baza acestora a unor primeri SSR transferabili, așa cum s-a demonstrat în cazul plopului balsamic, Populus trichocarpa . Astfel de loci universali cu amplificare încrucișată sunt utilizați pentru identificarea speciilor și a hibrizilor și pentru estimarea diferențierii genetice între speciile congenerice .

Microsateliții sunt, de asemenea, utili pentru verificarea diversității somaclonale în cadrul unui grup de ramets obținuți prin înmulțire microclonală dintr-un singur arbore donator , pentru identificarea clonelor individuale sub aspectul toleranței lor la factorii de mediu . Nu am observat nicio variație a modelelor SSR între ramets din aceeași linie clonală de elită. Microsateliții nucleari, împreună cu alte clase de markeri moleculari, sunt utilizați, de asemenea, pentru determinarea nivelului de ploidie la plopi, iar noi am găsit indicii de triploidie în cazul mai multor genotipuri. Hibrizii triploizi de plop demonstrează adesea o vigoare și o rezistență crescută la agenți patogeni, astfel încât această chestiune ar trebui studiată în continuare prin analize cariografice și prin citometrie flotantă.

3.2. Analiza structurii clonale în arboretele autohtone de aspen

Din chiar din momentul prelevării pe teren a materialului din arboretele sălbatice am încercat să evităm includerea rameturilor clonale apărute sub formă de muguri, ceea ce este obișnuit pentru aspen. În toate arboretele studiate s-a aplicat aceeași schemă de eșantionare, păstrând o distanță de cel puțin 15-20 m între arbori. Cu toate acestea, în toate populațiile naturale studiate au fost găsiți ramuri ale aceleiași clone, ceea ce indică prezența comună a înmulțirii vegetative (tabelul S1).

Prisady. Dintre cei 52 de arbori studiați, am găsit 41 de haplotipuri diferite; un genotip multilocus a fost găsit de nouă ori și unul a fost găsit de trei ori. Am concluzionat că aceste combinații multilocus repetate au rezultat din faptul că mugurii de prelevare a probelor sunt rameți ai aceleiași clone.

Voronej. Printre cei 17 arbori colectați în imediata apropiere a sitului plantației experimentale nu au fost găsiți indivizi clonali. Treisprezece arbori colectați pe malul râului Voronej au fost reprezentați de opt genotipuri: patru dintre ei se aflau într-un singur exemplar, trei s-au dovedit a fi doi ramets ai aceleiași clone, iar un genotip a fost găsit în trei exemplare provenite în mod evident din germinarea unor progenitori existenți dintotdeauna. În total, am identificat 25 de haplotipuri diferite în acest eșantion de populație de referință.

Yoshkar-Ola. Treizeci și doi de arbori analizați s-au combinat în 13 haplotipuri diferite identificate prin analiza corespondențelor multilocus; un genotip a apărut de două ori, un genotip a apărut de cinci ori, un genotip a apărut de șapte ori și un genotip a apărut de nouă ori. Genotipurile repetate au corespuns, în mod evident, ramurilor rezultate din germinare.

Am concluzionat că germinarea și nivelul ridicat de clonalitate sunt un fenomen larg răspândit în arboretele de aspen nativ. La aspen, precum și la mulți alți plopi, clonele vegetative sunt capabile să ocupe suprafețe mari. Prin urmare, pentru colectarea unui eșantion lipsit de genotipuri clonale repetate, distanțele dintre arbori ar trebui mărite până la cel puțin 40-50 m. Cu toate acestea, o estimare mai precisă a răspândirii maxime a unei singure clone pe teritoriul arboretului necesită, de asemenea, o explorare specială.

Printre alte aplicații, loci nucleari SSR au fost utili pentru studiile structurii clonale și a relațiilor genetice dintre genotipurile clonale în arboretele native sau între arboretele native și artificiale . Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.

3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability

All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).

The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.

Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . Nivelurile de diversitate genetică intrapopulațională observate de noi în arboretele de plop nativ s-au încadrat în intervalul de valori observate în mod obișnuit la plopi și estimate prin analiza locilor SSR ( și referințele aferente).

Un număr substanțial de studii care au utilizat tehnica microsateliților s-au axat pe detectarea hibridizării în arboretele naturale sau artificiale de plopi. Loci SSR ajută la dezvăluirea mecanismelor de încrucișare interspecifică și de izolare reproductivă . În acest studiu ne-am concentrat pe variația între indivizi și între populații mai degrabă decât pe diferențele interspecifice, dar în ceea ce privește unele dintre clonele de elită studiate, originea lor hibridă ar trebui să fie testată genetic folosind un set complex de markeri, dar de localizare nucleară și citoplasmatică. Identificarea de înaltă fidelitate a hibrizilor interspecifici și a clonelor industriale a fost raportată într-un număr considerabil de publicații . O publicație remarcabilă raportează identitatea genetică a unor clone industriale de plopi tratați anterior ca fiind diferiți .

Sarcina practică de monitorizare a identității clonelor comerciale din colecțiile in vitro a fost similară cu cea utilizată în cercetarea de față. În toate aplicațiile în care a fost necesară o identificare individuală fiabilă, SSR-urile au arătat o eficacitate ridicată.

4. Concluzii

Aplicarea lociilor microsateliți nucleari pentru identificarea genetică și evaluarea variabilității genetice la clonele de elită de plop și la arboretele native a arătat o eficacitate ridicată a sistemului de testare dezvoltat, bazat pe SSR-uri cu costuri reduse. Autentificarea fiabilă a clonelor asigură monitorizarea genetică a înmulțirii microclonale și permite dezvăluirea clonalității în arboretele native. Am demonstrat că același set de loci de microsateliți poate fi utilizat cu succes pentru estimarea nivelurilor de variabilitate genetică intra- și interpopulațională la aspen. Reconstrucția rudeniei între clonele individuale de elită sau relațiile genetice ale populațiilor care se împerechează în mod natural sunt sarcini de perspectivă care pot fi realizate în viitor folosind aceiași markeri.

Conflict de interese

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.

Recunoștințe

Această cercetare este susținută de Ministerul Educației și Științei al Federației Ruse (Proiectul nr. 14.607.21.0044 din 22.08.2014; identificator unic RFMEFI60714X0044). De asemenea, autorii le mulțumesc lui E. M. Romanov, A. I. Shurgin, R. V. Sergeev (Universitatea de Stat de Tehnologie Volga, Yoshkar-Ola, Republica Mari El, Rusia), M. V. Drapaluk, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikov, E. O. O. Kolesnikova (Universitatea de Stat de Inginerie Forestieră din Voronej, Voronej, Rusia) și G. B. Kolganikhina (Institutul de Științe Forestiere RAS, Uspenskoe, regiunea Moscova, Rusia), pentru ajutorul acordat la colectarea de probe în arboretele indigene. De asemenea, autorii le sunt recunoscători lui M. Zeps, D. Auzenbaha și A. Gailis (Institutul leton de cercetare forestieră de stat „Silava”, Salaspils, Letonia) pentru punerea la dispoziție a materialului biologic și a informațiilor despre clonele de elită de aspen.

Materiale suplimentare