Au fost dezvoltate numeroase abordări alternative la clonarea PCR (1), inclusiv clonarea TA (2), clonarea independentă de ligatură (LIC) (3-4), clonarea dependentă de recombinază (5-7) și clonarea mediată de PCR (8-10). Utilitatea practică a oricărei metode de clonare se bazează pe fiabilitatea acesteia, mai degrabă decât pe comoditatea, prețul sau eficiența sa în condiții optime. Metodele care sunt cel mai ușor de monitorizat și de optimizat se dovedesc în cele din urmă a fi cele mai fiabile. Clonarea TA și LIC necesită modificări terminale care nu pot fi monitorizate prin electroforeză pe gel. Recombinazele sunt, în general, vândute ca componente brevetate ale kiturilor de clonare, astfel încât puțini consumatori optimizează reacțiile de recombinare in vitro. Clonarea PCR cu extensie de suprapunere, descrisă aici, nu este prima formă de clonare mediată de PCR (8-10). Cu toate acestea, este relativ simplă, eficientă și fiabilă.
Prima dintre cele două PCR-uri (figura 1A) creează o inserție liniară cu secvențe plasmidice la ambele capete (a se vedea Materiale suplimentare pentru metode și instrucțiuni pentru proiectarea amorselor). Aceste prelungiri permit ulterior ca șirurile produsului PCR (figura 1A) să acționeze ca o pereche de primeri supradimensionați pe fragmentul de vector (figura 1B). După denaturare și aneantizare, șirurile inserției se hibridizează cu vectorul și se extind pentru a forma o nouă plasmidă bicatenară. ADN polimeraza Phusion ADN (nr. de catalog F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, SUA), crucială pentru realizarea tehnicii, nu posedă activitate de deplasare a catenei. Prin urmare, produsul final al reacției este o plasmidă de fuziune bicatenară cu două crestături (una pe fiecare catenă). Această plasmidă bicatenară relaxată este apoi transformată în celule Escherichia coli competente, care sigilează crestăturile cu enzime de reparare a ADN-ului (figura 1C). Utilizăm aceeași polimerază termostabilă pentru ambele PCR-uri, astfel încât utilizatorii neexperimentați pot clona eficient fără să stăpânească idiosincrasiile mai multor enzime de restricție, polimeraze, glicozilaze, recombinaze și ligaze.
(A) Mai întâi, inserția este amplificată prin PCR cu primeri chimerici, astfel încât produsul PCR final să aibă regiuni de suprapunere cu vectorul. (B) Apoi, vectorul și insertul sunt amestecate, denaturate și aneantizate; insertul hibridizat este apoi extins de către polimeraza Phusion ADN folosind vectorul ca șablon până când polimeraza ajunge la capătul 5′ al insertului. După mai multe cicluri PCR, noua plasmidă cu două crestături (una pe fiecare catenă) se acumulează ca produs. (C) Noua plasmidă poate fi transformată în E. coli după ce plasmidul parental este distrus prin digestia DpnI.
Am folosit mai întâi gfp pentru experimente de probă de principiu. Gena gfp a fost amplificată prin PCR (Figura 1A) cu primeri chimeri (capetele 5′ complementare plasmidului pQE30; capătul 3′ complementar cu gfp). PCR cu extensie de suprapunere (figura 1B) a fost realizată cu cinci ADN polimeraze diferite (tabelul suplimentar S1). Concentrațiile ridicate ale inserției și temperaturile de recoacere relativ scăzute în reacție (5-10°C sub temperatura de topire calculată a complexului amorsă/plasmidă) sunt importante pentru o extensie de suprapunere eficientă. Unii dintre produsele PCR corespund formei relaxate a vectorului dezirabil, așa cum reiese din analiza pe gel de agaroză (figura 2A). Vectorul pQE30 original a fost distrus în reacțiile cu endonucleaza de restricție DpnI (figura 1C). O mică parte aliquotă din fiecare reacție a fost utilizată pentru a transforma celule E. coli.
(A) Produse ale reacției de clonare PCR de extensie suprapusă după 0, 5, 10, 15, 20, 25 și 30 de cicluri prin electroforeză pe gel de agaroză. Trei nanograme de vector pQE30 au fost amestecate cu 175 ng de inserție (exces molar de 250) într-un volum total de 10 μL; o alicotă de 4 μL de reacție a fost separată pe un gel de agaroză 0,8%. M2, scara de ADN de 1 kb; M1, plasmidă asamblată în forme circulară închisă și circulară relaxată. (B) Eficiența clonării PCR prin extensie suprapusă a unei gene gfp în funcție de numărul de cicluri PCR. Douăzeci de microlitri de celule E. coli competente au fost transformate cu 1 μL pQE30/insert overlap extension PCR. Numărul de colonii verzi a fost trasat în funcție de numărul de cicluri PCR pentru fiecare placă. (C) Eficiența clonării prin suprapunerea extensiei PCR în funcție de lungimea inserției. S-a utilizat polimeraza Phusion ADN pentru a amplifica prin PCR produse de diferite dimensiuni: Gena GFP (gfp), gena β-D-glucuronidază (gusA), gena β-galactosidază (lacZ) și operonul luxABCDE din plasmidul purtător pIMBB. Aceste produse au fost purificate pe gel și utilizate în reacția PCR de extensie suprapusă cu vectorul pQE30. Trei nanograme de vector pQE30 au fost amestecate cu 175-500 ng de inserție într-un volum total de reacție de 10 μL și au fost supuse la 18 cicluri de PCR. După tratamentul cu DpnI, produsele PCR de extensie suprapusă au fost utilizate pentru a transforma celule E. coli competente. Numărul de colonii pe placă a fost trasat în funcție de dimensiunea inserției.
Phusion ADN polimeraza a fost mai potrivită pentru clonarea PCR de extensie a suprapunerii decât concurenții pe care i-am testat (tabelul suplimentar S1), poate datorită procesivității și fidelității sale superioare (11-12). Polimeraza ADN Phusion este de 10× mai procesivă decât polimeraza nativă Pfu (nr. de catalog 600135; Stratagene, La Jolla, CA, SUA) și a produs de 46× mai multe colonii (tabelul suplimentar S1). De asemenea, a produs de 35× mai multe colonii decât Expand Long Template DNA polymerase mix (nr. de catalog 11681834001; Roche, Basel, Elveția), care este în mare parte Taq ADN polimerază. Zuo și Rabie au dezvoltat o metodă similară doar cu Taq ADN polimeraza Taq și au raportat eficiențe de clonare la fel de modeste (8). Taq ADN polimeraza este relativ procesivă (60% din cea a Phusion), dar fidelitatea globală a amestecului este de numai 3,8% din cea a Phusion. Mai mult de 98% din coloniile transformate cu ADN produs de polimeraza ADN Phusion au fost vizibil verzi, ceea ce indică o eroare minimă de clonare sau un transfer minim al vectorului original.
Am măsurat eficiența clonării PCR de extensie prin suprapunere în funcție de ciclurile de temperatură; numărul de clone recombinante a crescut geometric în timpul primelor 15 cicluri și a atins un vârf la 17-18 cicluri (figura 2B). Ciclurile suplimentare au dus la o scădere ușoară (~30%) a cantității de clone produse, asociată cu acumularea produselor de ADN cu greutate moleculară mare observate în gelurile de agaroză (Figura 2A). Raportul inserție/plasmidă poate avea, de asemenea, un efect pronunțat asupra rezultatului reacției. Am comparat trei rapoarte diferite vector:inserție (1:5; 1:50 și 1:250) în reacția de clonare PCR de extensie suprapusă cu polimeraza Phusion ADN. Toate cele trei rapoarte au dus la apariția formei crestate a plasmidului (după cum se apreciază prin electroforeza pe gel de agaroză, nu este prezentată) și a clonelor recombinante (după cum se apreciază prin transformare și creșterea coloniilor verzi). Raportul 1:250 a produs cele mai multe clone recombinante.
Apoi am aplicat clonarea PCR cu extensie suprapusă pentru a clona genele pentru GFP (gfp, 1 kb), β-D-glucuronidază (gusA, 1,9 kb) și β-galactosidază (lacZ, 3,2 kb), precum și întregul operon luxABCDE (6 kb). Structura corectă a tuturor vectorilor recombinanți a fost confirmată prin analiza de restricție și funcția proteinei reporter. Rata de eroare aparentă asociată metodei noastre, evaluată prin fracțiunea de colonii care nu au prezentat o activitate completă a reporterului, a fost de <3%, indiferent de dimensiunea inserției (datele nu sunt prezentate). În același timp, numărul de colonii pe care le-am observat pe plăci după transformare a scăzut considerabil odată cu creșterea lungimii inserției (figura 2C). Graficul este aproape liniar, ceea ce sugerează că 6,7 kb este limita superioară pentru inserții cu această tehnică.
Rezultatul oricărui proiect de clonare depinde în mare măsură de efortul și de atenția la detalii a lucrătorului. Reacția de clonare PCR cu extensie de suprapunere descrisă aici este la fel de ușor de monitorizat și de optimizat ca orice alt protocol PCR lung (13). În general, randamentele PCR sunt slabe atunci când condițiile de reacție sunt prea stricte (amorsele nu reușesc să se aneantizeze) sau prea relaxate (amorsare nespecifică). Ambele se manifestă prin benzi goale în gelurile de agaroză, deși aceasta din urmă poate duce, de asemenea, la frotiuri sau benzi nedorite (a se vedea Materiale suplimentare pentru detalii privind proiectarea amorselor și optimizarea reacției PCR). Rigurozitatea PCR poate fi controlată prin modificarea concentrațiilor de reactanți (primeri, șablon), a temperaturii de recoacere, a ingredientelor tamponului (magneziu, pH, DMSO) sau a numărului de cicluri de temperatură. În general, această abordare de clonare s-a dovedit a fi insensibilă la prezența elementelor repetate interne (a se vedea Materiale suplimentare pentru detalii). ADN-polimeraza Phusion poate fi utilizată pentru a cataliza atât amplificarea PCR a inserției, cât și reacțiile de extindere a suprapunerii, astfel încât practicienii vor trebui doar să se familiarizeze cu idiosincrasiile unei singure enzime.
.