- Abstract
- 1. Introdução
- 2. Material e Métodos
- 2.1. Material Vegetal
- 2.2. Extração de DNA
- 2.3. Análise por Microssatélite
- 2.4. Análise estatística
- 3. Resultados e Discussão
- 3,1. Desenvolvimento de Sistemas de Teste Baseados em SSR para Identificação de Genótipo em Aspen
- 3.2. Análise da Estrutura Clonal em Estandes de Aspen Nativos
- 3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
- 4. Conclusão
- Conflito de Interesses
- Agradecimentos
- Materiais Suplementares
Abstract
Sistemas de teste para identificação molecular de genótipos micropropagados de Aspen Elite (Populus tremula L.) foram desenvolvidos na base de microsatellite (SSR) loci. Dos 33 micro loci satélites testados, 14 foram seleccionados devido à amplificação sustentável por PCR e à variabilidade substancial dos clones de elite do álamo destinados ao estabelecimento de plantações florestais de rotação rápida. Todos os oito clones testados tinham diferentes genótipos multilocus. Entre 114 árvores de três povoamentos nativos de referência localizados perto das plantações estabelecidas, 80 haplótipos foram identificados, enquanto alguns genótipos repetidos foram atribuídos a clones naturais que surgiram como resultado da germinação. O conjunto selecionado de marcadores de SSR mostrou identificação individual confiável com baixa probabilidade de aparecimento de genótipos aspen idênticos (um mínimo de e 1 × 10-4 para indivíduos não relacionados e relacionados, resp.). São descritos estudos de caso que demonstram aplicações práticas do sistema de teste, incluindo análise da estrutura clonal e níveis de diversidade genética em três povoamentos naturais de álamo que crescem nas regiões onde foram estabelecidas plantações de clones de elite.
1. Introdução
A contínua degradação das florestas nativas no mundo devido à superexploração requer a introdução de formas intensivas de silvicultura que favoreçam não só o efeito econômico, mas também a conservação dos recursos genéticos das plantas lenhosas. Esta tarefa declara a obtenção e manutenção de genótipos de elite de árvores florestais destinadas a plantações florestais de rotação rápida. Novos fatores altamente produtivos e sustentáveis abióticos, pragas e cultivares patogênicos e variedades aparecem como resultado da reprodução, seleção de mutações e/ou engenharia genética. A propagação clonal de tais indivíduos excepcionais assegura a fixação de seus traços úteis tanto para experimentos futuros de reprodução quanto para o estabelecimento de plantações florestais direcionadas. Em particular, a propagação microclonal através do cultivo in vitro permite a clonagem rápida, em larga escala e com boa relação custo-benefício de indivíduos com as características desejadas, especialmente quando a brotação ou enxertia tradicional é impossível ou requer esforços especiais .
Os clones de plantas morfológica e anatomicamente diferentes podem parecer semelhantes, é essencial identificar de forma confiável aqueles que incluem discriminação uns dos outros e de indivíduos específicos ou representantes de outras espécies intimamente relacionadas. Na silvicultura, o problema da identificação individual é especialmente crucial, pois o aspecto externo das árvores é altamente dependente dos parâmetros ambientais. Em determinados estágios da ontogênese natural das árvores florestais, por exemplo, mudas e mudas, e especialmente como calosidades ou explantes in vitro de cultivo celular, os indivíduos podem ser indiscerníveis não apenas individualmente, mas também no que diz respeito ao diagnóstico das espécies. O longo tempo de geração e a maturação ontogenética tardia torna real a tarefa de pasteurização genética de clones de elite em plantas lenhosas. O complexo processo multiestágio de obtenção, propagação e introdução de cultivares de elite por cruzamento ou engenharia genética aumenta a probabilidade de vários erros.
Marcadores genéticos moleculares (MGM) provaram ser ferramentas muito eficientes para a identificação individual. Entre as diferentes classes de MGM os microssatélites ou repetições de sequência simples (SSR) se ajustam melhor aos requisitos dos sistemas de teste para identificação devido à sua especificidade, codominância, neutralidade seletiva, riqueza alélica suficiente e heterozigosidade causada pela alta taxa de mutação. Além disso, devido ao conservadorismo relativo do genoma dentro dos géneros e famílias de plantas, os marcadores de SSR e os iniciadores de PCR para a sua amplificação podem ser transferíveis de um táxon para outro.
Em várias espécies de álamo, o sucesso da impressão digital de DNA e diferenciação de clones, cultivares e variedades foi demonstrado por marcadores moleculares incluindo loci SSR .
Neste trabalho relatamos o desenvolvimento de um sistema de testes baseado em SSR para identificação genética molecular de genótipos micropropagados de elite de aspen, Populus tremula L., visando o estabelecimento de plantações florestais alvo de rápido crescimento em várias regiões da Federação Russa e apresentar os resultados de sua aplicação para discriminação de genótipos individuais, estudos de estrutura clonal em povoamentos de aspen natural, e estimativa da variabilidade genética em populações.
2. Material e Métodos
O desenvolvimento do sistema de testes para a identificação de genótipos de elite compreendeu a seleção de um conjunto de marcadores específicos que se ajustassem aos requisitos de discriminação de clones de alta resolução e testassem sua confiabilidade e poder de identificação sobre um conjunto de genótipos de elite e um número suficiente de representantes de uma espécie estudada.
2.1. Material Vegetal
Elite aspen e clones híbridos utilizados no desenvolvimento de sistemas de teste para identificação molecular foram obtidos a partir de culturas de células micropropagadas mantidas no ramo Pushchino do Shemyakin e Instituto Ovchinnikov de Química Bioorgânica, Academia Russa de Ciências (Pushchino, Rússia). Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.
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Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.
Prisady. Lote experimental localizado 1 km a oeste do assentamento Prisady em Serpukhovsky Raion (distrito) de Moscou oblast’ (Rússia). Folhas de 52 árvores jovens ou de meia-idade (aproximadamente 10-25 anos) de um povoamento natural multienvelhas localizado nas proximidades (1 km) desta parcela foram utilizadas como população de referência.
Voronezh. Dezessete árvores foram amostradas em um povoamento adjacente à parcela experimental estabelecida em Voronezh Oblast. 13 árvores adicionais foram coletadas ao longo da margem do rio Voronezh, dentro da cidade de Voronezh, próximo à plantação.
Yoshkar-Ola. O jovem povoamento nativo de aspen foi a fonte das árvores utilizadas como população de referência para uma parcela experimental localizada perto da cidade de Yoshkar-Ola, República de Mari-El. Foram coletadas folhas de 32 árvores.
Para minimizar a amostragem ocasional de indivíduos de origem vegetativa (através da brotação), coletamos folhas de árvores a uma distância não inferior a 15-20 m uma da outra. Esta abordagem foi empregada para inclusão em amostras de referência de plântulas predominantemente polinizadas a céu aberto, com a máxima diversidade genética. Entretanto, com base exclusivamente no aspecto externo das árvores e na distância entre elas, não foi possível evitar a amostragem dos rameiros que surgiram como resultado da brotação, e a análise genética posterior confirmou isso.
Os brotos com folhas foram cortados por meio de um cortador mecânico com mastro telescópico de alumínio. Os brotos coletados com folhas foram colocados em sacos plásticos por não mais que 6 dias a +4°С até o processamento. A preparação da amostra incluiu a extração de DNA e a colocação de fragmentos de tecido foliar de reserva em sacos de zíper rotulados com sílica gel para armazenamento a longo prazo. Fora do período de vegetação ativa, botões vegetativos dormentes podem ser usados com sucesso para extração de DNA.
2.2. Extração de DNA
Fragmentos de folhas aproximadamente 350-500 mg retirados de explantes crescendo in vitro em um meio especial (REF) em placas de Petri foram usados para extração de DNA.
Para árvores de populações nativas, extraímos DNA de fragmentos de 350-500 mg de fragmentos de folhas frescas ou 200-300 mg de sílica seca por um método modificado de brometo de cethyltrimethylammonium (CTAB) .
2.3. Análise por Microssatélite
Microssatélites, ou SSR, representam uma classe de sequências de DNA repetidas em tandemly com motivos curtos (1-6 pares de nucleotídeos, bp) que diferem em número de cópias entre os indivíduos devido à alta taxa de mutação. Alelos múltiplos geralmente encontrados em loci de microsatélites codominantes criam uma grande variedade de combinações genotípicas únicas que garantem sua identificação confiável, especialmente quando um número suficiente de loci é empregado. Tecnicamente, a análise do polimorfismo SSR requer apenas Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e subsequente eletroforese (gel ou capilar) para análise de fragmentos. Para o desenvolvimento do sistema de teste escolhemos a variante do método que utiliza apenas equipamento básico e reagentes simples. Isso garantiu maior reprodutibilidade dos procedimentos em qualquer laboratório de PCR e permitiu alcançar um alto custo-benefício da análise, que é crucial para a identificação prática de clones em larga escala.
Desde que o número substancial de loci SSR nuclear para álamos foi encontrado na literatura e bases de dados de primers, decidimos selecionar entre várias publicações e primers de teste que podem ser usados para identificação de genótipos de rotina com base em equipamentos muito simples, sem o uso de analisadores de DNA. Um conjunto inicial de cartilhas SSR para seu uso potencial como elementos do sistema de teste de identificação molecular em álamos foi resultado de pesquisa em bases de dados bibliográficas (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) e na Base de Dados de Cartilhas de Recursos Ecológicos Moleculares (http://tomato.bio.trinity.edu/).
A amplificação do DNA foi realizada utilizando kits PCRCore (Isogen Laboratories, Ltd, Moscovo, Rússia) na BioRad Inc. (EUA) Dyad Thermo cycler. Microsatellite loci (listados na Tabela 2) da série ORPM e WPMS foram amplificados com primers específicos na concentração de 1 mmol/mL e 5-10 ng de DNA alvo usando o seguinte perfil de temperatura: (1) desnaturação inicial a 94°С durante 3 min; (2) 30 ciclos que consistem em 30 segundos de desnaturação a 94°С, recozimento primário a temperatura e tempo variáveis (ver tabela 3 para temperatura de recozimento final recomendada após ajuste do procedimento), e alongamento a 72°С durante 1,5 min seguido de (3) alongamento final a 72°С durante 10 min e (4) arrefecimento da mistura de PCR a 4°С.
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| Comments: 1Tuskan et al., 2004 ; 2Smulders et al., 2001 ; 3by literature data in different Populus species (P. tremula, P. x canescens, and P. alba). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 1P: polymorphic, M: monomorphic, and N: no PCR amplification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.4. Análise estatística
Identidade do clone foi determinada usando análise de correspondência multilocus para os dados codominantes. A probabilidade genotípica (GP), ou seja, a probabilidade de aparecimento de determinada combinação multilocus na população, e a probabilidade de identidade, estimando a probabilidade de correspondência aleatória de dois indivíduos não relacionados (PI) ou relacionados (PIsib) por determinado conjunto de loci, foram calculadas com base na distribuição de frequências de alelos em amostras populacionais.
Correspondência das distribuições genotípicas observadas para cada locus SSR ao esperado de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testada pelo critério do qui-quadrado. O número de alelos e as heterozigossidades observadas e esperadas foram calculados para cada amostra nativa. Utilizamos a estatística F de Wright para avaliação da subdivisão genética entre as amostras da população estudada. Todos os cálculos acima mencionados foram realizados no add-in para MS Excel, GenAlEx 6,5 .
3. Resultados e Discussão
3,1. Desenvolvimento de Sistemas de Teste Baseados em SSR para Identificação de Genótipo em Aspen
Para os testes iniciais, selecionamos 33 lócios de microsatélites tri-, tetra-, penta- e hexanucleotídeos heterológicos a partir de dois conjuntos; a série ORPM foi projetada primeiro para Populus trichocarpa e a série WPMS foi projetada para Populus nigra . As características destes loci são apresentadas na Tabela 2. Os testes iniciais foram feitos em amostras de DNA de três clones (47-1, PtV22 и-control) de uma coleção in vitro armazenada e propagada no ramo Pushchino de Shemyakin e Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Academia de Ciências Russa (Pushchino, Moscow Oblast, Rússia). Nesta fase, a sua variabilidade também foi testada em 20-24 espécimes de aspen selvagem de Novosibirsk Oblast (Sibéria Ocidental, Rússia) e Krasnoyarsk Krai (Sibéria Média, Rússia).
Como resultado da primeira fase de testes, 24 loci foram amplificados com sucesso e nove outros loci não conseguiram produzir produtos PCR. Dos 24 loci que produziram fragmentos de PCR, 20 loci mostraram ser variáveis com um número de alelos de dois a nove, enquanto quatro loci que foram amplificados com sucesso eram monomórficos (Tabela 3). Após testes adicionais em regimes de PCR variáveis, finalmente seleccionámos 14 loci com amplificação fiável e nível substancial de polimorfismo para inclusão no sistema de teste para identificação genética molecular. As figuras 2(a) e 2(b) mostram exemplos da variabilidade dos loci dos microsatélites seleccionados no aspen.
(a)
(b)
(a)
(b)
Os genótipos multilocus obtidos de oito clones de elite e genótipos de referência de árvores silvestres de povoamentos nativos estão listados na Tabela S1 no Material Suplementar disponível online em http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. Foram analisados até 8 rampas amostradas em diferentes fases da propagação microclonal. Dentro dos clones, os genótipos foram estáveis e reproduzidos sem ambigüidade entre os rampas, independentemente do estágio de propagação. Após a exclusão de rampas do mesmo gene, tanto os clones de elite como os genótipos de aspen das populações nativas incluídas nas amostras de referência eram 100% diferentes. A probabilidade de aparecimento de genótipos (GP: genotype probability) entre clones de elite variou de 2,4 – 10-21 a 1,7 – 10-11, entre árvores em amostras de referência de 4,0 – 10-24 a 5,8 – 10-9. A probabilidade de coincidência ocasional de dois genótipos não relacionados (PI: probabilidade de identidade) variou de 4,8 – 10-10 em Yoshkar-Ola a 4,3 – 10-13 em Prisady. Ajustada à probabilidade teórica de descendência dos indivíduos comparados dos mesmos antepassados, a estimativa mais conservadora (PIsibs) estava na faixa de 1,0 – 10-4 em Yoshkar-Ola a 9,3 – 10-6 em Voronezh. Todos os valores são bastante baixos, de modo que a frequência teórica de aparecimento de genótipos repetíveis devido à recombinação de diferentes gametas durante a reprodução de sementes não foi superior a cerca de 1 combinação de alelos idêntica acidentalmente encontrada em 10000 comparações. A relação de PI e PIsibs a partir do número de loci utilizados é mostrada na Figura 3 e demonstra uma probabilidade praticamente desprezível de aparecimento de genótipos idênticos ao utilizar os primeiros 7 a 8 loci seleccionados para a inclusão no sistema de teste. A utilização de todos os 14 loci garante confiabilidade e robustez adicionais do procedimento.
br>>>>/div>Desenvolvimento de loci microsatélite para espécies do gênero Populus iniciado no final do século 20, juntamente com tecnologias de marcadores genéticos moleculares. Em 1998, um dos primeiros conjuntos de primers para amplificação de loci SSR dinucleotide foi projetado para choupo tremendo americano, Populus tremuloides . Neste trabalho foi demonstrado um sucesso na amplificação cruzada dos mesmos marcadores para várias outras espécies de álamo, P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis, e P. maximowiczii. Os autores também postularam o amplo espectro de aplicações dos loci SSR para diferentes propósitos incluindo identificação de clones, análise dos acasalamentos controlados, mapeamento do genoma, seleção assistida por marcadores, ensaios de diversidade genética e apoio aos programas de conservação e manejo sustentável dos recursos genéticos florestais. Estudos subsequentes forneceram outros oito loci de SSR dinucleotide para Populus tremuloides . Desde então, foram desenvolvidos micro loci satélites para outras espécies, incluindo P. nigra . Alguns destes loci também foram amplificados em P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans, e P. lasiocarpa. Os primers específicos de loci SSR foram projetados para Populus euphratica . Mais tarde, este conjunto foi usado para o desenvolvimento de painéis multiplex usados para a estimativa da diversidade genética nesta espécie .
A sequência de gerações seguintes foi a forma mais eficiente de detecção de repetições tandem no genoma do álamo e desenho em seus primers SSR de base transferível como foi demonstrado no caso do álamo balsâmico, Populus trichocarpa . Esses loci universais cruzados são utilizados para identificação de espécies e híbridos e para estimativa da diferenciação genética entre espécies congêneres .
Microssatélites também são úteis para verificação da diversidade somaclonal dentro de um conjunto de rampas obtidas por propagação microclonal a partir de uma única árvore doadora , para identificação de clones individuais em um aspecto de sua tolerância aos fatores ambientais . Não observamos nenhuma variação nos padrões de SSR entre rampas da mesma linhagem clonal de elite. Microssatélites nucleares juntamente com outras classes de marcadores moleculares são empregados também para determinação do nível de ploidia em álamos , e foram encontradas indicações de triploidia por nós com respeito a vários genótipos. Os híbridos triplóides de álamo demonstram frequentemente um aumento de vigor e resistência aos agentes patogénicos, pelo que esta matéria deve ser estudada em maior profundidade através da análise cariológica e citometria flutuante.
3.2. Análise da Estrutura Clonal em Estandes de Aspen Nativos
Desde o próprio momento da amostragem de campo do material em povoamentos selvagens, tentamos evitar a inclusão de rampas clonais surgidas como brotos, o que é comum para o aspen. Em todos os povoamentos estudados foi aplicado o mesmo esquema de amostragem, mantendo pelo menos 15-20 m entre as árvores. No entanto, foram encontrados rampas do mesmo clone indicando ocorrência comum de propagações vegetativas em todas as populações naturais estudadas (Tabela S1).
Prisady. Dentre as 52 árvores estudadas, encontramos 41 haplótipos diferentes; um genótipo multilocus foi encontrado nove vezes e um foi encontrado três vezes. Concluímos que essas combinações repetidas de multilóculos resultaram de brotos amostrados serem rametas do mesmo clone.
Voronezh. Entre 17 árvores coletadas nas proximidades do local da plantação experimental, não foram encontrados indivíduos clonais. Treze árvores coletadas na margem do rio Voronezh foram representadas por oito genótipos: quatro delas estavam em uma réplica, três foram encontradas como sendo dois rampas do mesmo clone, e um genótipo foi encontrado em três cópias evidentemente originado de brotos de progenitores já existentes. No total, identificamos 25 haplótipos diferentes nesta amostra de referência da população.
Yoshkar-Ola. Trinta e duas árvores analisadas combinadas em 13 diferentes haplótipos identificados pela análise de combinações multilocus; um genótipo apareceu duas vezes, um genótipo apareceu cinco vezes, um genótipo apareceu sete vezes, e um genótipo apareceu nove vezes. Genótipos repetidos evidentemente corresponderam a rampas resultantes da brotação.
Concluímos que a brotação e o alto nível de clonalidade são um fenômeno difundido em povoamentos de álamo nativo. No álamo, assim como em muitos outros álamos, os clones vegetativos são capazes de ocupar grandes áreas. Portanto, para a coleta de uma amostra livre de genótipos clonais repetidos, a distância entre as árvores deve ser aumentada até pelo menos 40-50 m. Entretanto, uma estimativa mais precisa da distribuição máxima de um único clone no território do povoamento também requer exploração especial.
entre outras aplicações, os loci SSR nucleares foram úteis para o estudo da estrutura clonal e das relações genéticas entre genótipos de clones em povoamentos nativos ou entre povoamentos nativos e artificiais. Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.
3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).
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| s.e.: standard error. : sample size. : mean number of alleles. : effective number of alleles. : observed heterozygosity. : expected heterozygosity. : unbiased expected heterozygosity. : fixation index (intrapopulation coefficient of inbreeding). |
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The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.
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| s.e.: standard error. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . Os níveis de diversidade genética intrapopulação observados por nós em povoamentos de álamos nativos estavam dentro da faixa de valores comumente observados em álamos e estimados pela análise SSR loci ( e referências nela).
Um número substancial de estudos empregando a técnica do microsatélite foram focados na detecção da hibridação em povoamentos naturais ou artificiais de álamos. Os loci SSR ajudam a revelar mecanismos de cruzamento interespecífico e isolamento reprodutivo . Neste estudo concentrámo-nos na variação amonia-individual e entre populações e não nas diferenças interespecíficas, mas no que diz respeito a alguns dos clones de elite estudados a sua origem híbrida deve ser testada geneticamente utilizando um conjunto complexo de marcadores mas de localização nuclear e citoplasmática. A identificação de alta fidelidade de híbridos interespecíficos e clones industriais foi relatada em um número considerável de publicações . Uma publicação notável relata a identidade genética de alguns clones industriais de choupos previamente tratados como diferentes .
A tarefa prática de monitoramento da identidade de clones comerciais em coleções in vitro foi semelhante à empregada na presente pesquisa. Em todas as aplicações onde foi necessária uma identificação individual confiável os SSRs mostraram alta eficácia.
4. Conclusão
Aplicação de loci de microsatélites nucleares para identificação genética e avaliação da variabilidade genética em clones de aspen elite e povoamentos nativos mostraram alta eficácia do sistema de testes baseado em SSR de baixo custo desenvolvido. A autenticação confiável dos clones garante o monitoramento genético da propagação microclonal e permite revelar a clonalidade em povoamentos nativos. Demonstramos que o mesmo conjunto de loci microsatélite pode ser empregado com sucesso para a estimativa dos níveis de variabilidade genética intra e interpopulação no aspen. A reconstrução do parentesco entre clones de elite individuais ou relações genéticas de populações naturalmente acasaladas são tarefas de perspectiva que podem ser realizadas no futuro usando os mesmos marcadores.
Conflito de Interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste trabalho.
Agradecimentos
Esta pesquisa é apoiada pelo Ministério da Educação e Ciência da Federação Russa (Projeto nº 14.607.21.0044 a partir de 22.08.2014; identificador único RFMEFI60714X0044). Os autores também agradecem E. M. Romanov, A. I. Shurgin, R. V. Sergeev (Universidade Estadual de Tecnologia do Volga, Yoshkar-Ola, República de Mari El, Rússia), M. V. Drapaluk, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikov, E. O. Kolesnikova (Universidade Estadual de Engenharia Florestal de Voronezh, Voronezh, Rússia), e G. B. Kolganikhina (Instituto de Ciências Florestais RAS, Uspenskoe, região de Moscou, Rússia), por sua ajuda na coleta de amostras em estandes nativos. Os autores também são gratos a M. Zeps, D. Auzenbaha, e A. Gailis (Instituto de Pesquisa Florestal do Estado da Letônia “Silava,” Salaspils, Letônia) por compartilharem material biológico e informações sobre clones de elite de aspen.