Bylo vyvinuto mnoho alternativních přístupů ke klonování pomocí PCR (1), včetně klonování pomocí TA (2), klonování nezávislého na ligaci (LIC) (3-4), klonování závislého na rekombináze (5-7) a klonování pomocí PCR (8-10). Praktická využitelnost každé metody klonování závisí spíše na její spolehlivosti než na její pohodlnosti, ceně nebo účinnosti za optimálních podmínek. Nejspolehlivější se nakonec ukáží metody, které lze nejsnáze sledovat a optimalizovat. Klonování TA a LIC vyžadují koncové modifikace, které nelze sledovat pomocí gelové elektroforézy. Rekombinázy se obvykle prodávají jako patentované součásti klonovacích souprav, takže jen málo spotřebitelů optimalizuje rekombinační reakce in vitro. Zde popsané klonování pomocí PCR s překrývajícím se prodloužením není první formou klonování zprostředkovaného PCR (8-10). Je však relativně jednoduchá, účinná a spolehlivá.
První ze dvou PCR (obrázek 1A) vytváří lineární insert se sekvencemi plazmidu na obou koncích (metody a pokyny pro návrh primerů viz doplňkové materiály). Tato prodloužení následně umožňují, aby vlákna produktu PCR (Obrázek 1A) fungovala jako dvojice naddimenzovaných primerů na fragmentu vektoru (Obrázek 1B). Po denaturaci a žíhání se vložená vlákna hybridizují s vektorem a prodlouží se za vzniku nového dvouřetězcového plazmidu. Phusion DNA polymeráza (kat. č. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, USA), která je rozhodující pro provedení této techniky, nemá aktivitu vytěsňování vláken. Proto je konečným produktem reakce dvouřetězcový fúzní plazmid se dvěma zářezy (jeden na každém vlákně). Tento uvolněný dvouřetězcový plazmid se poté transformuje do kompetentních buněk Escherichia coli, které zapečetí zářezy pomocí enzymů opravujících DNA (obrázek 1C). Pro obě PCR používáme stejnou termostabilní polymerázu, takže nezkušení uživatelé mohou účinně klonovat, aniž by museli zvládat idiosynkrazie mnoha restrikčních enzymů, polymeráz, glykosyláz, rekombináz a ligáz.
(A) Nejprve je insert PCR amplifikován pomocí chimérických primerů tak, aby výsledný produkt PCR měl překrývající se oblasti s vektorem. (B) Poté se vektor a insert smíchají, denaturují a žíhají; hybridizovaný insert se poté prodlužuje pomocí Phusion DNA polymerázy s použitím vektoru jako templátu, dokud polymeráza nedosáhne 5′ konce insertu. Po několika cyklech PCR se jako produkt nahromadí nový plazmid se dvěma zářezy (jeden na každém vlákně). (C) Nový plazmid lze transformovat do E. coli poté, co je rodičovský plazmid zničen digescí DpnI.
Nejprve jsme použili gfp pro důkazní experimenty. Gen gfp byl amplifikován metodou PCR (obr. 1A) pomocí chimérických primerů (5′ konce komplementární k plazmidu pQE30; 3′ konec komplementární ke gfp). PCR s překrývajícím se prodloužením (obrázek 1B) byla provedena s pěti různými DNA polymerázami (doplňková tabulka S1). Vysoká koncentrace inzertu a relativně nízké teploty žíhání v reakci (5-10 °C pod vypočtenou teplotou tání komplexu primer/plazmid) jsou důležité pro efektivní overlap extension. Některé produkty PCR odpovídají uvolněné formě žádoucího vektoru, jak bylo zjištěno analýzou na agarosovém gelu (obr. 2A). Původní vektor pQE30 byl zničen v reakcích s restrikční endonukleázou DpnI (obrázek 1C). Malý alikvot z každé reakce byl použit k transformaci buněk E. coli.
(A) Produkty klonovací reakce PCR s přesahem po 0, 5, 10, 15, 20, 25 a 30 cyklech pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Tři nanogramy vektoru pQE30 byly smíchány se 175 ng insertu (250 molární přebytek) v 10 μl celkového objemu; 4 μl alikvot reakce byl separován na 0,8% agarózovém gelu. M2, 1 kb DNA žebřík; M1, sestavený plazmid v uzavřené kruhové a uvolněné kruhové formě. (B) Účinnost klonování gfp genu pomocí PCR s překrývajícím se prodloužením v závislosti na počtu cyklů PCR. Dvacet mikrolitrů kompetentních buněk E. coli bylo transformováno 1 μl pQE30/insert overlap extension PCR. Počet zelených kolonií byl vynesen do grafu v závislosti na počtu cyklů PCR pro každou destičku. (C) Účinnost klonování pomocí overlap extension PCR v závislosti na délce inzertu. K PCR-amplifikaci produktů různých velikostí byla použita polymeráza Phusion DNA: GFP (gfp) gen, β-D-glukuronidázový (gusA) gen, β-galaktosidázový (lacZ) gen a operon luxABCDE z nosného plazmidu pIMBB. Tyto produkty byly přečištěny v gelu a použity v reakci PCR s překrývající se extenzí s vektorem pQE30. Tři nanogramy vektoru pQE30 byly smíchány s 175-500 ng insertu v celkovém objemu reakce 10 μl a podrobeny 18 cyklům PCR. Po ošetření DpnI byly produkty overlap extension PCR použity k transformaci kompetentních buněk E. coli. Počet kolonií na destičku byl vynesen do grafu v závislosti na velikosti inzertu.
Fusion DNA polymeráza byla pro klonování pomocí overlap extension PCR vhodnější než námi testované konkurenční produkty (doplňková tabulka S1), možná díky své vyšší procesivitě a věrnosti (11-12). Phusion DNA polymeráza je 10× procesivnější než nativní Pfu polymeráza (kat. č. 600135; Stratagene, La Jolla, CA, USA) a vytvořila 46× více kolonií (doplňková tabulka S1). Vytvořila také 35× více kolonií než směs Expand Long Template DNA polymerázy (kat. č. 11681834001; Roche, Basel, Švýcarsko), která je většinou Taq DNA polymerázou. Zuo a Rabie vyvinuli podobnou metodu pouze s Taq DNA polymerázou a zaznamenali podobně skromnou účinnost klonování (8). Taq DNA polymeráza je relativně procesní (60 % oproti Phusion), ale celková věrnost směsi je pouze 3,8 % oproti Phusion. Více než 98 % kolonií transformovaných pomocí DNA produkované polymerázou Phusion DNA bylo viditelně zelených, což svědčí o minimální chybě klonování nebo přenosu původního vektoru.
Měřili jsme účinnost klonování pomocí PCR s přesahem v závislosti na teplotních cyklech; počet rekombinantních klonů se geometricky zvyšoval během prvních 15 cyklů a vrcholu dosáhl při 17-18 cyklech (obrázek 2B). Další cykly vedly k mírnému (~30%) poklesu množství vytvořených klonů, což souviselo s hromaděním vysokomolekulárních produktů DNA pozorovaných v agarosových gelech (obr. 2A). Výrazný vliv na výsledek reakce může mít také poměr insert/plazmid. Porovnávali jsme tři různé poměry vektor:insert (1:5; 1:50 a 1:250) v překryvné prodlužovací PCR klonovací reakci s polymerázou Phusion DNA. Všechny tři poměry vedly k výskytu zkrácené formy plazmidu (podle elektroforézy v agarózovém gelu, není uvedeno) a rekombinantních klonů (podle transformace a růstu zelených kolonií). Nejvíce rekombinantních klonů vzniklo při poměru 1:250.
Poté jsme použili klonování pomocí PCR s přesahem, abychom naklonovali geny pro GFP (gfp, 1 kb), β-D-glukuronidázu (gusA, 1,9 kb) a β-galaktosidázu (lacZ, 3,2 kb) a také celý operon luxABCDE (6 kb). Správná struktura všech rekombinantních vektorů byla potvrzena restrikční analýzou a funkcí reportérových proteinů. Zjevná chybovost spojená s naší metodou, posuzovaná podle podílu kolonií, které nevykazovaly plnou aktivitu reportéru, byla <3 % bez ohledu na velikost inzertu (údaje nejsou uvedeny). Zároveň s rostoucí délkou inzertu výrazně klesal počet kolonií, které jsme pozorovali na destičkách po transformaci (obrázek 2C). Graf je téměř lineární, což naznačuje, že 6,7 kb je při této technice horní hranicí pro inserty.
Výsledek každého klonovacího projektu do značné míry závisí na úsilí pracovníka a jeho pozornosti věnované detailům. Zde popsanou klonovací reakci PCR s přesahem lze sledovat a optimalizovat stejně snadno jako jakýkoli jiný dlouhý protokol PCR (13). Obecně platí, že výtěžnost PCR je nízká, pokud jsou podmínky reakce příliš přísné (primery se nepodaří vyžíhat) nebo příliš uvolněné (nespecifické primingy). Obojí se projevuje prázdnými pruhy v agarózových gelech, ačkoli v druhém případě může dojít také k rozmazání nebo nežádoucím pásům (podrobnosti o návrhu primerů a optimalizaci PCR reakce viz Doplňkové materiály). Přísnost PCR lze řídit změnou koncentrace reaktantů (primerů, templátu), teploty žíhání, složek pufru (hořčík, pH, DMSO) nebo počtu teplotních cyklů. Celkově se ukázalo, že tento přístup ke klonování není citlivý na přítomnost vnitřních opakujících se prvků (podrobnosti viz doplňkové materiály). Fúzní DNA polymerázu lze použít jak ke katalýze PCR amplifikace inzertu, tak k prodlužovacím reakcím s přesahem, takže praktici se budou muset seznámit pouze s idiosynkraziemi jednoho enzymu.