Alpha-Synuclein ist ein DNA-bindendes Protein, das die DNA-Reparatur moduliert und Auswirkungen auf Lewy-Körperchen-Erkrankungen hat | Scientific Reports

Mensch

Gewebe von menschlichen Probanden wurde durch das Oregon Alzheimer’s Disease Center (ADC) und die Abteilung für Pathologie der OHSU beschafft, und bei den betroffenen Probanden wurden klinische und pathologische Diagnosen gestellt (Demenz mit Lewy-Körperchen). Die Verwendung des Gewebes wurde vom IRB der OHSU genehmigt und in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien durchgeführt. Von allen Teilnehmern und/oder ihren gesetzlichen Vertretern wurde eine informierte Zustimmung eingeholt.

Tiere

Die Tiere wurden in der Abteilung für Vergleichende Medizin der OHSU in einem Vivarium mit Licht-Dunkel-Zyklus und kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit untergebracht und mit Futter und Wasser nach Belieben versorgt. Alle Experimente wurden vom IACUC der OHSU genehmigt, alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und deren Leiden zu minimieren.

Erzeugung von Mausmodellen

Transgene Mauslinien

Mit Hilfe des OHSU Transgenic Mouse Model Core haben wir eine Maus erzeugt, die menschliches Alpha-Synuclein exprimiert, das mit verstärktem GFP (C-terminaler Tag) fusioniert ist und eine Punktmutation an Alanin 53 (GCA > ACA) enthält, die zu einer Veränderung der Threonin-Aminosäure führt (A53T Syn-GFP). Die A53T-Syn-GFP-Sequenz wurde in den MoPrp.Xho-Vektor (Geschenk von David Borchelt)74 an der XhoI-Stelle kloniert. Die Expression erfolgt unter transkriptioneller Kontrolle des Mausprionprotein-Promotors. Die 30 bp Linker-Sequenz zwischen A53T Syn und GFP ist GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC, was GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr bedeutet. Diese Mauslinie zeigt A53T Syn-GFP-Expression in >90% der kortikalen Neuronen und <10% der Astrozyten (A.J.S. und V.K.U., unveröffentlichte Daten). 142E Syn-GFP transgene Mäuse32,33,39,75 und 142E Syn-GFP/mouse mSynKO Mauslinien wurden von den Schöpfern der Linie, Edward Rockenstein und Eliezer Masliah, zur Verfügung gestellt. Nukleär lokalisierte TdTomato-NLS transgene Mäuse wurden von den Jackson Laboratories (Stock# 023035) bezogen. Alpha-Synuclein-Knock-out-Tiere und entsprechende Kontrollmäuse wurden von den Jackson Laboratories bezogen (Stock# 016123, 005304).

AAV8-Virusgenerierung

Wir erstellten virale Konstrukte von A53T Syn-GFP, die Punktmutationen in Alpha-Synuclein an Serin-129 enthalten, die entweder eine Alanin- (TCT > GCT) oder Asparaginsäure- (TCT > GAT) Aminosäureänderung verursachen (Konstrukte Geschenk von Pamela McLean). Diese Konstrukte wurden in den selbstkomplementären AAV8-Virusvektor pTRS-KS/CBh-GFP (aus dem National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, IN) unter Transkriptionskontrolle des CBh-Promotors (Chicken Beta Actin Short) mit Hilfe der Restriktionsenzymstellen AgeI und ApaI kloniert. Die 30 bp Linker-Sequenz zwischen alpha-Syn & und verstärktem GFP ist GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC. Die endgültigen Viren scAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFP und scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP wurden vom Gene Transfer Vector Core am Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, MA, hergestellt.

Intraventrikuläre AAV8-Virusinjektionen

ICV bei P0-Neugeborenen wurden nach dem Freihandprotokoll76 durchgeführt. Wir injizierten 2 µL unverdünntes Virus in jeden Seitenventrikel bei Titern von ~1E12 genomischen Kopien pro Milliliter. Die einzige Abweichung von diesem veröffentlichten Protokoll besteht darin, dass wir das Virus nicht in Trypanblau verdünnt haben.

Induktion der Lewy-Pathologie bei Mäusen

2 bis 3 Monate alte männliche Mäuse wurden mit Maus-WT-Sequenz-PFFs gemäß unseren zuvor veröffentlichten Protokollen25 injiziert. 2,5 μl (2 mg/ml) frisch beschallte PFFs oder 2,5 μl PBS wurden in den primären sensorisch-motorischen Kortex der rechten Hemisphäre injiziert, wobei die Tiere mit Isofluran (1 % bis 2 %) betäubt und in ihren Heimkäfig zurückgebracht wurden. Nach einem Intervall von 3-6 Monaten nach der Injektion (6-9 Monate alt) wurden die Tiere getötet und wie unten beschrieben für die IHC vorbereitet.

In-vivo-Bildgebung des Mäusegehirns & Analyse

Die Operation des Schädelfensters und die Bildgebung erfolgten nach demselben Protokoll, das wir bereits in Isofluran betäubten Tieren veröffentlicht haben25,39, Dabei wurde ein Zeiss LSM 7MP-Multiphotonenmikroskop verwendet, das mit Zweikanal-BiG-Detektoren (binäre GaAsP-Detektoren) und einer gepulsten Titan-Saphir-Femtosekunden-Laserquelle von Coherent Technologies Chameleon (abgestimmt auf 860 nm für die Abbildung von Syn-GFP) ausgestattet ist. Es wurde die Bildaufnahmesoftware Zeiss Zen 2011 verwendet. Für die Experimente zur laserinduzierten Schädigung des Zellkerns (LID) wurde die Bleichfunktion in Zen verwendet, um kleine, submikrongroße Bereiche innerhalb des Zellkerns mit dem Chameleon-Laser zu beleuchten, der für <1 ms auf ~730 nm eingestellt war.) Für das Umschalten des Lasers auf die LID-Wellenlänge (~730 nm) und zurück ist eine Zeitverzögerung von ~4 Sekunden erforderlich. In einer Untergruppe von Experimenten wurden Tiere erzeugt, die Syn-GFP gleichzeitig mit nukleär lokalisiertem TdTomato-NLS exprimierten. Dabei zeigte sich, dass die Lokalisierung des LID-Pulses auf Regionen >2 μm von der Peripherie der Zelle immer innerhalb des Zellkerns lag. Dieses Kriterium wurde verwendet, um den LID-Puls innerhalb der Kerne von Syn-GFP-exprimierenden kortikalen Neuronen in vivo zu lokalisieren. Die LID-Bilder wurden mit ImageJ analysiert, ähnlich wie bei unseren zuvor beschriebenen FRAP-Experimenten25,39. Interessante Regionen (ROIs) wurden ausgewählt, um mittlere Fluoreszenzwerte in LID- und Kontroll-ROIs innerhalb des Zellkerns zu erhalten. Das Verhältnis des Signals zu jedem Zeitpunkt von den LID- zu den Kontroll-ROIs wurde zur Berechnung des Anreicherungsverhältnisses verwendet. Für FRAP-Experimente nach LID wurde ein ähnliches Photobleich- und Analyseprotokoll verwendet wie in unserer zuvor veröffentlichten Arbeit25,39. Die Daten wurden in Prism 6 (GraphPad) analysiert, um einfache exponentielle Anpassungen für den Erholungszeitverlauf und die immobilen und mobilen Fraktionen zu erhalten. Alle verwendeten Tiere waren 5 bis 9 Monate alt.

Mauskortikale Neuronenkulturen und Bildgebung

C57/BL6-Mäuse wurden verwendet, um primäre neuronale Kulturen zu erzeugen, die aus embryonalen Mäusen isoliert wurden, basierend auf den Methoden von Kaech und Banker77 und angepasst von Gray und Kollegen78. Kurz gesagt, wurden die Embryonen 18 Tage nach der Trächtigkeit von betäubten Weibchen geerntet. Der Kortex wurde seziert, vorsichtig zerkleinert und trypsinisiert, um Suspensionen von dispergierten Neuronen zu erzeugen. Frisch isolierte kortikale Neuronen wurden mit Plasmiden elektroporiert, die für zwei menschliche Alpha-Synuclein-Konstrukte kodieren, die mit einem verstärkten GFP markiert sind (scAAV-huSyn_s129A:EGFP, scAAV-hySyn_s129D:EGFP). 330.000 elektroporierte kortikale Neuronen jedes Konstrukts wurden auf Schalen mit Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsern in MEM-Medium (GIBCO/Life Technologies), 5% FBS (Atlanta Biologicals) und 0,6% Glukose (Sigma-Aldrich) plattiert. Nach 4 Stunden wurde das Medium entfernt und durch Neurobasal Medium ersetzt, das mit 1 × GlutaMAX (GIBCO/Life Technologies) und 1× GS21 (MTI-GlobalStem) ergänzt war. Jede Schale wurde jede Woche mit 0,5 ml Neurobasal-Medium plus GlutaMAX und GS21 gefüttert, wobei die erste Fütterung (nach 5 Tagen in vitro (DIV)) AraC enthielt. Nach 7 Tagen in vitro wurden Deckgläser von kultivierten Neuronen jedes Konstrukts mit einem Lebendzellsystem mit geschlossener Bildgebungskammer abgebildet. Zellkultur-Kern-LID-Experimente wurden auf derselben Bildgebungsplattform mit denselben Protokollen für die Bildgebung und Analyse durchgeführt wie unsere oben beschriebenen in vivo-Kern-LID-Experimente.

Maus-Hippocampus-Kulturen & PFF-Seeding

Maus-Hippocampus-Kulturen und PFF-Seeding induzierte Lewy-Pathologie-Bildung wurde mit unseren zuvor beschriebenen Techniken79,80 durchgeführt. Kurz gesagt, wurden primäre neuronale Kulturen aus E16-E18 CD1-Mausgehirnen (Charles River) hergestellt. Alle Verfahren wurden gemäß dem NIH Guide for the Care and Use of Experimental Animals (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania genehmigt. Dissoziierte Hippocampus-Neuronen wurden auf mit Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläser (Carolina Biological Supply) in einer Dichte von ~50.000 Zellen/cm2 plattiert. Rekombinante humane Alpha-Synuclein-PFFs mit der pathogenen S87N-Mutation81 wurden in PBS mit 0,1 mg/mL verdünnt, beschallt und in neuronalen Medien verdünnt. Die Neuronen wurden bei DIV 7 mit 5 ug/ml behandelt und 12 Tage lang inkubiert. Die Zellen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % PFA/4 % Saccharose fixiert und anschließend in 0,3 % Tx-100 permeabilisiert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 3 % FBS/3 % BSA blockiert. Primäre Antikörper (Anti-α-Synuclein PhosphoSer129 Klon 81 A, 1:2000 Verdünnung, Biolegend cat#825701; Anti-phospho-Histon H2A.X (Ser139) Klon JBW301, 1:500 Verdünnung, Millipore cat#05-636) wurden im Blockierungspuffer verdünnt und bei Raumtemperatur 3 Stunden lang inkubiert. Die Deckgläser wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und mit den entsprechenden Alexa-fluor-markierten Sekundärantikörpern inkubiert. Die gewaschenen Deckgläser wurden mit Fluoromount-G mit DAPI (Fisher Scientific) auf Objektträger montiert.

Sekundäre Antikörper: Alexa 488, Ziege anti Maus IgG2a, 1:1000 Verdünnung, Fisher Scientific; Alexa 594, Ziege anti Maus IgG1, 1:1000 Verdünnung, Fisher Scientific.

Zur Abbildung der Deckgläser wurde ein PE-Lamina Scanner verwendet. Mit der HALO-Software (Indica Labs) wurden γH2AX-Foci und DAPI-gefärbte Zellkerne gezählt, die sich 1,5 mm vom Rand jedes Deckglases entfernt befanden. Die statistische Analyse der Daten wurde mit Graphpad Prism Version 4 durchgeführt.

Immunfluoreszenz &-Analyse

HAP1-Zellen

Die elterlichen WT-Kontroll- (Artikel #C631 Batch 29663) und Hap1 Human SNCA 103 bp Deletions-Knockout- (Artikel #HZGHC003210c003 Batch 2) Zelllinien wurden von Horizon Discovery bezogen und in IMDM-Medien (Gibco# 11995-065) + 10 % fötales Rinderserum + Pen-Strep gezüchtet und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden einen Tag vor der Fixierung auf PLL-beschichtete #1,5-Deckgläser in 35-mm-Schalen ausgesät und bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % gezüchtet. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4% PFA in PBS fixiert, 1x in PBS gewaschen und bis zum Färbevorgang bei 4 C in PBS gelagert. Die fixierten Zellen wurden mit 1 ml PBS + 0,25 % Triton-X 100 unter leichtem Schütteln bei RT für 20 Minuten permeabilisiert. Die Lösung wurde entfernt und die Zellen wurden 20 Minuten lang in 1 ml Blocking Buffer (0,1% Triton-X 100, 10% normales Ziegenserum in PBS) blockiert. Die primären Antikörper wurden in Inkubationspuffer (1:5 Verdünnung des Blocking Buffer in PBS) verdünnt und über Nacht bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen dreimal für 15 Minuten in PBS gewaschen. Komplementäre fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper wurden 1:1000 in Inkubationspuffer verdünnt, zu den Zellen gegeben und über Nacht bei RT im Dunkeln und unter leichtem Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen dreimal für 20 Minuten in PBS gewaschen. Die Kernfärbung erfolgte unmittelbar vor dem letzten Waschen in PBS mit 2,5ug/mL DAPI (Sigma D9542) in PBS für 20 Minuten. Vor dem Einbetten wurden die Zellen kurz in deionisiertem H2O gewaschen. Die Deckgläser wurden mit 13 µL CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution montiert und mit Biotium CoverGrip Coverslip Sealant versiegelt. Die Objektträger wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss Elyra PS.1 710 und der Zen-Software abgebildet. Z-Stapel in 0,5 µm-Schritten wurden mit 63-fachem Zoom1 aufgenommen, wobei darauf geachtet wurde, dass das Antikörpersignal innerhalb des Zellkerns nicht gesättigt wurde.

Die verwendeten primären Antikörper waren: Anti-Syn1, 1:500-Verdünnung, monoklonale Maus, BD Biosciences, Kat. 610786; Anti-Poly(ADP-Ribose)-Polymer Klon 10 H, 1:500-Verdünnung, Hühnerpolyklonal, Tulip BioLabs, Kat. 1023; Anti-Phospho-Histon H2A.X, 1:500-Verdünnung, monoklonal, Kaninchen, Cell Signaling, Kat. 9718; Anti-PhosphoS129-Syn EP1536Y, 1:500-Verdünnung, monoklonales Kaninchen, Abcam, ab51253; Anti-PhosphoS129-Syn 81 A, 1:667-Verdünnung, monoklonale Maus, Covance, Kat. 825701; Anti-Syn 4B12, 1:500-Verdünnung, monoklonale Maus, Biolegend, Kat. 807804; und Anti-Syn EPR20535, Verdünnung 1:100, monoklonales Kaninchen, Abcam, ab212184. Als sekundäre Antikörper wurden verwendet: Alexa Fluor 647 Ziege gegen Kaninchen, ThermoFisher, Kat. A-21245; Alexa Fluor 555 Ziege gegen Maus, Abcam, ab150114; Alexa Fluor 488 Esel gegen Huhn, Jackson ImmunoResearch, Kat. 703-545-155.

Bleomycinbehandlung ICC: Bleomycinsulfat (Selleckchem, Kat. S1214) wurde in H2O verdünnt, um eine 10 mg/mL Stammlösung herzustellen, aliquotiert und bei -80C gelagert. Einen Tag vor der Behandlung wurden Hap1-WT- und Hap1-SNCA-KO-Zellen auf PLL-beschichteten #1,5-Deckgläsern in 35-mm-Schalen ausgesät, so dass sie am nächsten Tag zu 80 % konfluent waren. Am Tag der Behandlung wurde das normale Medium entfernt und 2 ml frisches warmes Medium mit 10ug/ml Bleomycin in jede Schale gegeben. Für die Scheinzellen wurde frisches warmes Medium ohne Bleomycin in jede Schale gegeben. Die Zellen wurden 1 Stunde lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gelagert. Nach der Behandlung wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden in 4% PFA in PBS für 10 Minuten bei RT fixiert, 1x in PBS gewaschen und bei 4 C in PBS bis zum Färbeverfahren gelagert.

Bleomycin-Behandlung Western Blot: Einen Tag vor der Behandlung wurden Hap1 WT- und Hap1 SNCA KO-Zellen auf 2 × 10 cm Platten pro Bedingung ausgesät, so dass sie am nächsten Tag zu ~80% konfluent waren. Die Bleomycin-Behandlung erfolgte auf die gleiche Weise wie bei ICC. Nach der Behandlung wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden 1x mit warmem PBS gewaschen. Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und in konischen 15-mL-Röhrchen gesammelt und 5 Minuten bei 200rcf pelletiert. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt, die Pellets wurden in 2 mL PBS resuspendiert und in 2 × 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Proteine wurden mit dem NE-PER-Extraktionskit (Thermo-Fisher, Kat. 78833) gemäß den Empfehlungen des Herstellers in zytosolische und nukleäre Fraktionen extrahiert, wobei nach dem ersten Schritt der Resuspension des Kerns eine kurze Beschallung (10 Sekunden, 10 kHz) erfolgte. Die Proteinpräparate wurden bis zur Western-Blot-Analyse bei -80 °C gelagert.

Für die konfokale Bildgebung wurden Bilder mit einem Zeiss Elyra PS.1 Konfokalmikroskop mit einem Plan-Apochromat 63x/1,40 Ölobjektiv aufgenommen. Alle Kolokalisationsanalysen wurden mit der Software ImageJ (NIH) durchgeführt, indem für jeden Zellkern aus einem einzigen Bild, das sich in der Mitte des Zellkerns in z-Richtung befindet, ROIs erstellt wurden. Das CoLoc 2-Plugin wurde verwendet, um den Pearson-Koeffizienten zwischen den Signalen und dem erwarteten Hintergrundwert nach zufälliger Verschiebung eines Kanals gegenüber dem anderen zu messen.

Mausgehirn

Männliche Mäusegehirne (Alter 3-6 Monate) wurden sofort post mortem seziert, in 6 ml frisches 4%iges PFA in PBS gelegt und mit einem Pelco Biowave Pro für 90 Minuten bei 150 W in einem zirkulierenden Wasserbad fixiert. Die Gehirne wurden zur weiteren Fixierung über Nacht auf 4 °C gebracht. Am nächsten Tag wurde das PFA durch 0,05%iges Natriumazid ersetzt und bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C gelagert.

Nach der Fixierung wurden die Gehirne mit einem Vibratome Leica VT1000S in 50 µm koronale oder sagittale Schwebeschnitte geschnitten. Bei bestimmten Antikörpern war vor der Blockierung ein hitzeinduzierter Epitopabruf (HIER) erforderlich. Die Hirnschnitte wurden in ein Röhrchen mit HIER-Puffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0,05% Tween, pH = 8.5), 20 Minuten lang gedämpft und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur abgekühlt. Das Gewebe wurde 1 Stunde lang in Blocking-Puffer (0,1 % Triton-X, 10 % Ziegenserum, in PBS) blockiert. Der primäre Antikörper wurde in Inkubationspuffer (1:5-Verdünnung des Blockierungspuffers) in einer für jeden Antikörper optimierten Konzentration verdünnt und über Nacht im Dunkeln unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gewebe wurde 30 Minuten lang 5-mal mit PBS gewaschen. Der komplementäre Sekundärantikörper wurde in Inkubationspuffer verdünnt und ebenfalls über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Gewebe mit 5maligem Austausch von PBS gewaschen. Die DAPI-Färbung erfolgte kurz vor dem letzten Waschgang. Das Gewebe wurde auf einen Objektträger in CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution montiert. Ein Deckglas der Größe 1,5 wurde mit Biotium CoverGrip Coverslip Sealant über dem Gewebe versiegelt.

Die verwendeten primären Antikörper waren: Anti-α-Synuclein Phospho (Ser129) Antikörper Klon 81 A, Maus monoklonal, 1:667 Verdünnung, Biolegend cat#825701; Anti-alpha Synuclein (Phospho S129) Antikörper, Kaninchen monoklonal, 1:500 Verdünnung, Abcam cat#ab51253; Anti-asyn (Syn1/mSyn), Maus monoklonal, 1:500 Verdünnung, BD Biosciences cat#610786; Anti-Pan-ADP-Ribose-Bindungsreagenz, Kaninchen, 1:1000 Verdünnung, Millipore cat#MABE1016; Anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, Klon 10 H (PADPR), Huhn, 1:100 Verdünnung, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-phospho-Histon H2A.X (Ser139) Antikörper Klon JBW301, Maus, 1:500 Verdünnung, Millipore cat#05-636; Anti-phospho-Histon H2A.X (Ser139) Antikörper Klon 20E3, Kaninchen monoklonal, 1:500 Verdünnung, Cell Signaling cat#9718 Als sekundäre Antikörper wurden verwendet: Alexa 647, Ziege Anti-Kaninchen, 1:1000 Verdünnung, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, Ziege Anti-Maus, 1:1000 Verdünnung, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, Ziege Anti-Kaninchen, 1:1000 Verdünnung, Abcam cat#ab150078; Alexa 555, Ziege anti-Maus, 1:1000 Verdünnung, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, Ziege anti-Huhn, 1:1000 Verdünnung, Abcam cat#ab150169.

Für die konfokale Bildgebung wurden die Bilder mit einem Zeiss Elyra PS.1 konfokalen Mikroskop mit einem Plan-Apochromat 63x/1,40 Ölobjektiv aufgenommen. Mit Laserleistungen von 1-5% wurden z-Stapel durch 2-4 Regionen des Kortex pro Gewebeschnitt aufgenommen. Zur Analyse der IHC-Daten wurde die Bildgebungssoftware Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) verwendet. Um den Zellkern vom Zytoplasma abzugrenzen, wurde eine Oberfläche mit dem DAPI-Kanal erstellt. Es wurden nur ganze neuronale Kerne analysiert. Die statistischen Informationen (mittlere Intensität, Gesamtintensität, Gesamtzahl der Flächen) wurden für jeden Kanal exportiert und in Prism 6 (GraphPad) weiter analysiert. Für die Analyse von Foci innerhalb der Kerne wurde das Kernsignal des gewählten Kanals mit einer Kernoberfläche maskiert, die aus dem DAPI-Kanal erstellt wurde. Aus dem Kernsignal des gewünschten maskierten Kanals wurden Flächen zur Quantifizierung von Kernfoci erstellt.

Humanes Gehirn

Schnitte aus der Amygdala von menschlichen Demenz mit Lewy-Körperchen wurden unmittelbar nach der Autopsie (Post-mortem-Intervall 12-48 Stunden) entnommen, in 6 ml frisches 4%iges PFA in PBS gelegt und mit einem Pelco Biowave Pro für 90 Minuten bei 150 W in einem zirkulierenden Wasserbad fixiert. Die Schnitte wurden bei 4 °C gelagert, um über Nacht zu fixieren. Am nächsten Tag wurde das PFA durch 0,05%iges Natriumazid ersetzt und bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C gelagert.

Nach der Fixierung wurden die Amygdala-Schnitte mit einem Vibratome Leica VT1000S in 50 µm große, fließende Schnitte geschnitten. Das Gewebe wurde 1 Stunde lang in Blocking-Puffer (0,1 % Triton-X, 10 % Ziegenserum, in PBS) blockiert. Der primäre Antikörper wurde in Inkubationspuffer (1:5-Verdünnung des Blockierungspuffers) in einer für jeden Antikörper optimierten Konzentration (siehe unten) verdünnt und über Nacht im Dunkeln unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gewebe wurde 60 Minuten lang 5-mal mit PBS gewaschen. Der komplementäre Sekundärantikörper wurde in Inkubationspuffer verdünnt und ebenfalls über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Gewebe mit 5maligem Austausch von PBS gewaschen. Die DAPI-Färbung erfolgte kurz vor dem letzten Waschgang. Das Gewebe wurde auf einen Objektträger in CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution montiert. Ein Deckglas der Größe 1,5 wurde mit Biotium CoverGrip Coverslip Sealant über dem Gewebe versiegelt.

Die verwendeten primären Antikörper waren: Anti-α-Synuclein Phospho (Ser129) Antikörper Klon 81 A, monoklonale Maus, 1:667 Verdünnung, Biolegend cat#825701; Anti-phospho-Histon H2A.X (Ser139) Antikörper Klon 20E3, monoklonales Kaninchen, 1:500 Verdünnung, Cell Signaling cat#9718. Als sekundäre Antikörper wurden verwendet: Alexa 647, Ziege Anti-Maus, 1:1000 Verdünnung, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, Ziege Anti-Kaninchen, 1:1000 Verdünnung, Abcam cat#ab150077.

Bilder wurden mit einem Zeiss LSM 880 mit Airyscan Mikroskop aufgenommen. Um die spezifischen Antikörpersignale von der erhöhten autofluoreszierenden Hintergrundfärbung innerhalb der menschlichen Gewebeproben zu unterscheiden, wurde ein lineares Unmixing-Protokoll verwendet. Im Lambda-Modus wurden die Parameter für das Objektiv, die Laser und die Dichroika so eingestellt, wie es für die Abbildung der mehrfarbigen Probe erforderlich war. Mit denselben Parametern wurden individuelle Referenzspektren von einfarbig gefärbten Proben erstellt. Zusätzlich wurde eine ungefärbte Probe verwendet, um die Hintergrundreferenzspektren zu bestimmen. Bei der Erstellung der Referenzspektren wurden alle Residuen minimiert. Die mehrfarbige Probe wurde dann unter Angabe der relevanten Hintergrund- und Einfarbspektren abgebildet und mit der Zeiss Zen Software entmischt.

Zur Analyse der IHC-Daten wurde die Bildgebungssoftware Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) verwendet. Um den Zellkern vom Zytoplasma abzugrenzen, wurde eine Oberfläche mit dem DAPI-Kanal erstellt. Es wurden nur ganze neuronale Zellkerne analysiert. Die statistischen Informationen (mittlere Intensität, Summenintensität, Gesamtzahl der Flächen) wurden für jeden Kanal exportiert und in Prism 6 (GraphPad) weiter ausgewertet. Für die Analyse von Foci innerhalb der Kerne wurde das Kernsignal des gewählten Kanals mit einer Kernoberfläche maskiert, die aus dem DAPI-Kanal erstellt wurde. Aus dem Kernsignal des gewünschten maskierten Kanals wurden Flächen zur Quantifizierung von Kernfoci erstellt.

HAP1-Zell-Comet-Assay

HAP1-Zell-neutrale Comet-Assays wurden gemäß den Empfehlungen von Trevigen durchgeführt (Trevigen Comet-Assay-Kit, cat#4250-050-K). Zellsuspensionen (2 × 104 Zellen/ml) in serumfreiem IMDM (Sigma), gemischt im Verhältnis 1:2 mit Comet LMAgarose (Trevigen), wurden auf CometSlidesTM (Trevigen) pipettiert und bei 4 °C für 10-15 min zum Gießen gelagert. Die Objektträger wurden über Nacht in Lysis Solution (Trevigen) bei 4 °C im Dunkeln und anschließend in neutralem Elektrophoresepuffer (300 mM Natriumacetat, 100 mM Tris-HCl, pH 9) für 1 Stunde bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Die Objektträger wurden in frischem Puffer 40 Minuten lang bei 20 V (1 V/cm) bei 4 °C elektrophoretisiert. Nach der Elektrophorese wurden die Objektträger zunächst in DNA-Fällungspuffer (1 M Ammoniumacetat, 86,6 % EtOH) und dann in 70 % EtOH bei Raumtemperatur im Dunkeln jeweils 30 Minuten lang inkubiert und bei 37 °C getrocknet. Die Objektträger wurden mit 1X SYBRTMgreen (Invirogen) in 1X PBS (Gibco) bei Raumtemperatur 30 Minuten lang im Dunkeln gefärbt, zehnmal in dH2O getaucht, um überschüssige Färbung abzuwaschen, und bei 37 °C getrocknet. Die Kometen wurden auf einem Zeiss Apotome mit einem 10X-Objektiv sichtbar gemacht und mit CometScoreTM ausgewertet.

Bleomycin-Behandlung Comet Assay: Einen Tag vor der Behandlung wurden Hap1-WT- und Hap1-SNCA-KO-Zellen auf 2 × 35-mm-Platten pro Bedingung ausgesät, so dass sie am nächsten Tag zu ~80 % konfluent waren. Die Bleomycin- und Sham-Behandlungsprotokolle wurden wie bei der ICC durchgeführt. Nach der Behandlung wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden 1x mit warmem PBS gewaschen. Nach einer Erholungsphase wurde frisches warmes Medium zugegeben, und die Zellen wurden wieder in den Inkubator gegeben. Die Zellen wurden durch Trypsinierung mit 0,05 % Tripsin-EDTA (Gibco Kat. 15400-54) geerntet. Trypsinierte Zellen von 2 × 35-mm-Platten wurden in konischen 15-mL-Röhrchen gesammelt und 5 Minuten bei 200rcf pelletiert. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt, die Pellets wurden in 250uL frischem Medium ohne FBS oder Penn-Strep resuspendiert, in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bis zur Verwendung im Comet-Assay wie oben beschrieben auf Eis gelagert.

Comet-Assay an Mäusegehirn

Frisch entnommenes Hirngewebe von männlichen Mäusen (Alter 1, 3, 6-9 Monate) wurde mit einer Rasierklinge fein zerkleinert und in eiskaltem PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) suspendiert und 30 Sekunden lang mit einem Handhomogenisator homogenisiert. Das Gewebe wurde eine Minute lang mikrozentrifugiert und der Überstand 1:10 in PBS verdünnt. Die Zellen wurden mit einem Hämozytometer gezählt und auf 1 × 105/ml verdünnt. Die verdünnten Zellen wurden mit niedrigschmelzender Agarose im Verhältnis 1:2 (v/v) vermischt und auf die Vertiefungen des Comet-Objektträgers aus Glas (Trevigen Comet Assay Kit, cat#4250-050-K) verteilt. Die Objektträger wurden 15 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C getrocknet und über Nacht bei 4 °C in die Lyse-Lösung des Kits gelegt. Überschüssiger Puffer wurde von den Objektträgern abgelassen, bevor sie für 30 Minuten bei 4 °C in 50 ml TBE, pH 7,4, eingelegt wurden. Die Objektträger wurden einer Elektrophorese in TBE, pH 7,4, bei 20 V für 40 Minuten bei 4 °C unterzogen. Überschüssiges TBE wurde abgelassen, und die Objektträger wurden zweimal für 5 Minuten in dH2O eingelegt. Anschließend wurden die Objektträger 5 Minuten lang in 70 %iges EtOH gelegt und 15 Minuten lang bei 37 °C getrocknet. 100 µl 1X SYBR-Green wurden auf jeden Kreis der getrockneten Agarose pipettiert und die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln gefärbt. Überschüssige SYBR-Green-Lösung wurde entfernt und die Objektträger wurden mehrmals in dH2O gespült. Die Objektträger wurden bei 37 °C vollständig trocknen gelassen und bei 4 °C gelagert. Die Kometen wurden auf einem Zeiss ApoTome-Mikroskop unter einem 10X-Objektiv sichtbar gemacht und mit der CometScore™-Software (TriTek) ausgewertet.

Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungstest

DNA-Vorbereitung

300 bp-Fragmente wurden aus einer 100 bp-Leiter (NEB) extrahiert und auf einem 1%igen Agarosegel bei 175 V für 2 Stunden bei RT mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) getrennt. Die DNA wurde mit dem DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research) gereinigt und in 1X TE eluiert. Die Endkonzentration und die DNA-Reinheit wurden mit Nanodrop bestimmt.

Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay

DNA-Fragmente (20 ng) wurden mit rekombinantem hu_ser129_phospho-syn (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg und 16 µg; Proteos, Inc.), rekombinantem hu_α-Synuclein (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg und 16 µg; Proteos, Inc.) oder rekombinanter Glutathion-S-Transferase (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg und 16 µg; GenScript) in einer 20-µl-Reaktion, die 94 mM Tris-Cl, pH 8,0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA und 5 % Ficoll enthält, für 20 Minuten auf Eis und anschließend für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Zugabe von 2 µL 10X Orange Loading Buffer (Licor) wurden 8 μL der Gesamtreaktion in ein 10 %- oder 6 %-Polyacrylamid-TBE-Gel (Novex) geladen und bei 100 V für 2 Stunden bei RT laufen gelassen. Die Gele wurden 30 Minuten lang mit 10X SYBRTM Safe DNA Stain (Invitrogen) in 1X TBE gefärbt. Die Bilder wurden mit dem Fluorchem M Imaging System aufgenommen und mit dem ImageJ Gel Analyzing Tool quantifiziert.

Western blot

10%ige Polyacrylamid-TBE-Gele wurden bei 30 V für 1 Stunde und 16 Minuten auf Eis in 0,5X TBE mit dem Novex XCell II Blotting System (Invitrogen) auf eine Biodyne™ B Nylonmembran (Thermofisher Scientific) übertragen. Die Membranen wurden über Nacht in Odyssey PBS Blocking Buffer (Li-Cor) blockiert und 1 Stunde lang bei RT mit Syn1 (1:1.000; Biolegend) und über Nacht bei 4 °C mit IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10.000; Li-Cor) gefärbt. Die Bilder wurden mit dem Li-Cor Odyssey CLx Imaging System aufgenommen.

Western Blot für Hap1 Nuclear Protein Preps: Die Konzentrationen der zytoplasmatischen und nukleären Hap1 NE-PER-Proteinpräparate wurden mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce, Kat. 23225) quantifiziert und auf einem Multiskan FC Microplate Photometer (Fisher, Kat. 51119000) mit einer Auslesung von 550 nm abgelesen. 5 µg & 10 µg Kernprotein wurden in SDS-Probenpuffer (Novex, Kat. LC2676) + BME (Gibco, Kat. 21985-023) verdünnt und auf ein 10-20%iges Tris-Glycine-Gel (Novex, Kat. XP10202BOX) geladen. 3 µL einer farblich vorgefärbten Proteinleiter (NEB, Kat. P7719) wurden als Referenz geladen. Das Gel wurde mit dem Novex Xcell Blotting System in SDS-Laufpuffer (Novex, Kat. LC2675) für 70 Minuten bei 120 V gelaufen. Das Gel wurde zerlegt und für den Transfer auf eine Immobilon-FL PVDF-Membran (Millipore, Kat. IPF00010) vorbereitet. Das Gel wurde in Tris-Glycin-Transferpuffer (Novex, Kat. LC3675) auf Eis für 2 Stunden bei 25 V transferiert. Nach dem Transfer wurde die Membran entfernt und sofort in 4% PFA + 0,01% Glutaraldehyd für 10 Minuten unter leichtem Schütteln bei RT fixiert. Die Membran wurde 1x in milliQ H2O gewaschen und mit dem REVERT total protein stain kit (LI-COR, Kat. 926-11010) gemäß dem Herstellerprotokoll gefärbt. Das gefärbte Gesamtprotein wurde mit dem LI-COR Odyssey CLx Imager aufgenommen. Nach der Umkehrung der REVERT-Färbung wurde die Membran 1x in milliQ H2O gewaschen und in Odyssey Blocking Buffer (LI-COR, Kat. 927-40000) über Nacht bei 4 C unter leichtem Schütteln blockiert. Die primären Antikörper wurden 1:1000 in Blocking Buffer verdünnt und 2 Stunden bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Membran wurde 3x in 0,1% Tween20 in PBS für 10 Minuten gewaschen. Sekundäre Antikörper (LI-COR IR680LT Esel-Anti-Kaninchen Kat. 926-68023; IR800CW Esel-Anti-Maus Kat. 926-32212) wurden 1:10000 in Blocking-Puffer verdünnt und 1 Stunde bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Membran wurde 3x in 0,1% Tween20 in PBS für 10 Minuten und 1x in PBS für 10 Minuten bei RT gewaschen. Die Bilder wurden mit dem LI-COR Odyssey CLx Imager aufgenommen. Die Analyse erfolgte auf FIJI unter Verwendung des Gelanalysators. Das Antikörpersignal wurde auf das REVERT-Gesamtprotein normalisiert.

T4-Ligase-vermittelter DNA-Endjoining-Assay

Jede Endjoining-Reaktion enthält 150 ng eines 1,2 kb DNA-PCR-Produkts, das am 5′- und 3′-Ende mit dem Restriktionsenzym XhoI (NEB RO146S) für kohäsive Enden verdaut wurde. Die Reaktionen werden in 20 µL Reaktionsvolumen durchgeführt, das 150 ng verdaute DNA, 2,8 µL Proteinpuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µL 20%iges Glycerin in PBS + Mg + Ca, 2 µL T4-Ligasepuffer, 200 ng oder 40,5 ng Protein, 25U T4-Ligase (NEB M0202) und steriles H2O bis zum Volumen enthält. Alle Komponenten außer der T4-Ligase wurden kombiniert und 15 Minuten lang auf Eis inkubiert. 25U T4-Ligase wurden der Reaktion zugegeben und 90 Minuten lang bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktion sofort mit einer Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 Säule (Zymo Research) aufgereinigt und in 15 µL sterilem H2O eluiert. Die DNA wurde mit SybrGreen und Ladepuffer versetzt, und die Proben wurden 1 Stunde lang bei 135 V in einem TAE-Gel mit 1% Agarose elektrophoretisiert und mit einem Syngene G:BOX Chemilumineszenz- und Fluoreszenz-Imager abgebildet. ImageJ wurde zur Analyse des Gelbildes verwendet und die Daten wurden mit Prism 6 (GraphPad) grafisch dargestellt.

Experimental design & statistical analysis

Alle quantifizierten Werte werden als Mittelwert ± SEM angegeben. Die Art und Anzahl der Proben (N) sowie die statistischen Tests, die zur Bewertung der Signifikanz für jedes Experiment verwendet wurden, sind bei jedem Datensatz angegeben. Die in den einzelnen Experimenten verwendeten Stichprobengrößen basierten auf Schätzungen der erwarteten Effektgrößen (~10-50 %) und Standardabweichungen aus vorläufigen Daten und waren so ausgelegt, dass Unterschiede mit einem Signifikanzniveau (α) von 0,05 und einer Potenz von 0,9 (1-β) festgestellt werden konnten.