Einer der nachhaltigsten Beiträge Winthrops zur Kolonie Massachusetts Bay war sein starkes Engagement für die Religion. Noch an Bord der Arbella legten Winthrop und die anderen Gründer ihre religiösen Hoffnungen für die neue Kolonie in einem Dokument mit dem Titel „Modell der christlichen Nächstenliebe“ nieder. Darin legte er dar, wie die Puritaner rein bleiben sollten, damit Gott die Kolonisten weiterhin segnen würde, während sie auf ihre Chance warteten, zurückzukehren und England vor dem ewigen Höllenfeuer zu retten. Er lehnte die Kirche von England, ihre Hierarchie und ihre Zeremonien ab. Sie bewegten sich jedoch auf einem schmalen Grat, da der König die Charta widerrufen würde, wenn er herausfände, dass sie den anglikanischen Glauben verleugnet hatten.
Um die Heiligkeit der neuen Kolonie zu bewahren, wurde die Disziplin zu einem der wichtigsten Themen innerhalb der religiösen Gruppe, die zu einem großen Teil auf der Ebene der Familie ausgeübt wurde. Tatsächlich wurde die Familiendisziplin so wichtig, dass die Kolonie jedem verbot, allein zu leben, und alleinstehende Männer und Frauen verpflichtet wurden, mit anderen Familien zusammenzuziehen.
Probleme, die zu groß waren, als dass eine Familie sie hätte kontrollieren können, und die die ganze Gemeinschaft betrafen, kamen vor das Allgemeine Gericht, damit die gottesfürchtige Kolonie unter dem Einfluss des Teufels litt. Winthrop hielt die Verfehlungen seiner Mitkolonisten sorgfältig in seinem Tagebuch fest. Die Vergeltung war immer schnell und hart. In einem der bizarrsten Fälle wurde beispielsweise George Spencer hingerichtet, nachdem eines seiner Schweine ein Ferkel mit menschlichen Zügen gezeugt hatte. Den „Heiligen“ der neuen Kolonie fiel es leicht, harte Urteile gegen die Sünder unter ihnen zu fällen, da sie wussten, dass Gottes Urteil ebenso schnell ergehen würde. Hatten Kirche und Gott in England zum Alltag gehört, so machten die Siedler in der Neuen Welt bewusst ihr ganzes Leben daraus.
Die erste Kirche in Massachusetts, eine Kongregationskirche in Salem, war im Jahr vor Winthrops Ankunft gegründet worden. Bis 1635 gab es mehr als ein Dutzend Kirchen in dem Gebiet. Das Verfahren für den Beitritt zu einer Kirche war streng, denn die Mitglieder mussten sich beim Pfarrer melden und ihre Konversion erklären. Winthrop glaubte jedoch, dass die meisten Menschen, die die Reise in die Neue Welt antraten, ihre Hingabe an Gott bereits bewiesen hatten, indem sie eine reine Umgebung suchten.
Der puritanische Glaube glaubte fest an die Stärke des Einzelnen und mied die Hierarchien etablierterer Kirchen wie der Kirche von England und der römisch-katholischen Kirche.Ein Problem mit diesem Glauben war jedoch, dass die puritanische Kirche keine spezifische Orthodoxie oder Kontrolle darüber hatte, was die einzelnen Kirchen lehrten – ein Versäumnis, das mehrere große Krisen für die neue Kolonie verursachte.
Im Jahr 1631 begann George Phillips, der Pastor der Watertownkirche, seine Gemeinde zu lehren, dass sowohl die Kirche von England als auch die katholische Kirche „wahre“ Kirchen seien – das Gegenteil von dem, was der puritanische Glaube vertrat, nämlich dass beide für Gott zu korrupt seien. Winthrop reiste nach Watertown, um den Pastor vor der Gemeinde zur Rede zu stellen. Am Ende des Abends gaben alle bis auf drei Mitglieder der Kirche zu, dass Phillips‘ Lehren und ihr Glaube falsch gewesen waren.
Eine ernstere Krise betraf einen gut sprechenden und charmanten Prediger namens Roger Williams. Das Problem bei der Gründung einer Kolonie, die religiöse Separatisten anziehen sollte, bestand darin, dass diese sich oft nicht scheuten, gegen die Regierung und die etablierten Positionen der Kirche Stellung zu beziehen, selbst wenn es sich um eine separatistische Kirche wie die puritanische Kirche selbst handelte.
Williams war von Anfang an in das Projekt der Massachusetts Bay involviert gewesen und hatte sogar an der ersten Versammlung im Jahr 1629 teilgenommen. Als Williams mitten im ersten Winter im Ausland in Lyon eintraf, begrüßte Winthrop die Ankunft des „gottesfürchtigen Pfarrers“. Dann wurde Williams eingeladen, Pastor der Bostoner Kirche zu werden, lehnte aber ab, da er glaubte, die Bostoner Kirche sei zu unrein für ihn, da nicht alle in der Kirche die anglikanische Kirche verurteilten.Winthrop kritisierte Williams scharf, nannte seine Ansichten falsch und deutete an, dass er seine Autorität nutzen würde, um die Kirche davon abzuhalten, um Williams zu verhandeln. Williams reiste nach Salem ab, aber nicht bevor er drohte, dass Winthrops Zivilbehörde nicht in kirchliche Angelegenheiten eingreifen könne. Die von John Endecott geleitete Kirche von Salem nahm ihn mit offenen Armen auf, bis Winthrop an Endecott schrieb und sich wunderte“, dass die Stadt einen so gefährlichen Geistlichen akzeptierte. Williams ließ sich schließlich in Plymouth nieder, außerhalb von Winthrops Einflussbereich. Dort sollte er nicht lange zufrieden sein.
Im Jahr 1633 stellte der Gouverneur von Plymouth, John Bradford, fest, dass Williams begonnen hatte, „seltsame Meinungen“ zu äußern und zu praktizieren, was schließlich dazu führte, dass der Prediger die Kirche verließ. Er beklagte sich darüber, dass die Bürger von Plymouth bei ihrer Rückkehr nach England an anglikanischen Gottesdiensten teilnehmen würden, wodurch die Kirche von Plymouth nach ihrer Rückkehr kontaminiert würde. Williams kehrte nach Salem zurück, wo man ihn zum Assistenten des Pfarrers ernannte, und er machte sich sofort daran, die Salemer Kirche zu reinigen.
Winthrop und andere Kolonialherren begannen, ihn zu einer Aussage zu befragen, die er in Plymouth gemacht hatte und die besagte, dass die Kolonisten kein Recht auf das Land hätten, das sie besetzten. Williams erklärte, der König regiere auf der Grundlage einer „feierlichen öffentlichen Lüge“ und habe kein Recht, der Kolonie Land zu gewähren. Winthrop versuchte, die Konfrontation herunterzuspielen, und schrieb an Williams, um ihn auf Möglichkeiten hinzuweisen, seine Aussagen vor dem Gericht zu relativieren. Williams verhielt sich für das Gericht zufriedenstellend, und es wurde nichts weiter über den Vorfall gesagt.
Im November 1634, sechs Monate nachdem Winthrop als Gouverneur abgesetzt worden war, erreichte das Gericht jedoch die Nachricht, dass Williams seine Überzeugungen erneut geäußert hatte. Er erklärte den Siedlern, dass die Satzung umgeschrieben werden müsse oder die gesamte Kolonie aufgelöst werden müsse, um sie zu „reinigen“. Als das Gericht Williams zurückrief, baten die Geistlichen der Region darum, den Übertreter privat zu beraten, um zu verhindern, dass Williams einen Brief an den König schickte, in dem er ihn der Lüge bezichtigte. Im Laufe des nächsten Jahres wurde Williams immer wieder vor das Gericht zitiert, jedes Mal, nachdem er gegen die Sitten der Puritaner verstoßen hatte. Die Bestrafung hatte jedoch kaum Auswirkungen auf seine Gemeinde, und im Frühjahr 1635 ernannte die Kirche von Salem ihn zum vollwertigen Pastor.
Das Gericht und andere Geistliche reagierten heftig. Während die Kirchen nicht in der Lage waren, gegen Salem vorzugehen, um die Lehren von Williams zu verhindern, hatte die Zivilregierung keine derartigen Skrupel.
Salem hatte um mehr Land auf einer nahe gelegenen Halbinsel gebeten, und das Gericht verkündete, dass die Stadt das Land nur erhalten könne, wenn sie Williams von seinem Posten absetzte – ein Schritt, der die Einwohner von Salem verärgerte. Sie baten andere Kirchen in der Gegend um Hilfe, aber ihre Appelle stießen auf taube Ohren. Während das Gericht gegen Salem kämpfte, hätte die gesamte Kolonie zusammenbrechen können, wenn Williams nicht wegen einer Krankheit in seinem Haus gefangen gewesen wäre; er konnte nur durch Briefe kommunizieren und so ging sein Charme sowohl für Salem als auch für das Gericht verloren. Er forderte die Einwohner von Salem auf, sich von allen anderen Kirchen loszusagen und sich selbst zur einzigen „wahren“ Kirche zu erklären – ein gefährlicher und isolierender Schritt. Salem sträubte sich dagegen.
In einer letzten Konfrontation rief das Gericht William im Oktober 1635 vor und befahl ihm, die Kolonie innerhalb von sechs Wochen zu verlassen. Später wurde die Frist bis zum nächsten Frühjahr verlängert, doch im Januar 1636 verließ Williams die Massachusetts Bay mit einer Gruppe von Anhängern und machte sich auf den Weg zur Narragansett Bay im nahe gelegenen Rhode Island.
Vorerst waren die puritanische Kirche und ihre Glaubensgrundsätze sicher. Winthrop hatte die größte Krise, mit der die neue Kolonie konfrontiert war, geschickt gemeistert und sie einmal mehr vor dem möglichen Untergang bewahrt.