Methods
Das klassische EMSA-Protokoll besteht aus 4 Hauptschritten: 1) Die Isolierung von Proteinen aus Zellen. Da die überwiegende Mehrheit der aktiven DNA-Bindungsproteine im Zellkern vorhanden ist, wird ein sequenzielles Membranlyseprotokoll verwendet, das gereinigtes Kernprotein liefert. 2) Herstellung und Radiomarkierung der DNA-Sonde. Phosphor 32 (32P) wird an die 5′-Enden der DNA-Sonde durch Verwendung von 32P-γATP als Substrat für die T4-Polynukleotidkinase angehängt. DNA-Sonden können sowohl gekauft als auch selbst hergestellt werden. 3) Gereinigte Proteine und radiomarkierte DNA-Sonden werden mit einem EMSA-Bindungspuffer ko-inkubiert, um die Bindung der Proteine mit der DNA-Sonde zu fördern. Wird eine Supershift-EMSA durchgeführt, enthält die Reaktion auch einen selektiven Antikörper, der, wenn er an die Protein-DNA-Komplexe gebunden ist, eine weitere Verzögerung im Gel bewirkt. 4) Die DNA-Protein-Komplexe werden geladen und auf einem nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gel laufen gelassen, wodurch die DNA-Protein-Komplexe von den freien DNA-Sonden getrennt werden. Die Polyacrylamid-Gele werden dann getrocknet und mittels Autoradiographie analysiert.