- Resumen
- 1. Introducción
- 2. Material y métodos
- 2.1. Material vegetal
- 2.2. Extracción de ADN
- 2.3. Análisis de microsatélites
- 2.4. Análisis estadístico
- 3. Resultados y discusión
- 3.1. Desarrollo de sistemas de pruebas basados en SSR para la identificación de genotipos en Aspen
- 3.2. Análisis de la estructura clonal en rodales nativos de álamo temblón
- 3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
- 4. Conclusión
- Conflicto de intereses
- Agradecimientos
Resumen
Se desarrollaron sistemas de prueba para la identificación molecular de genotipos de élite de álamo temblón micropropagado (Populus tremula L.) sobre la base de loci microsatélites (SSR). De los 33 loci microsatélites probados, se seleccionaron 14 debido a la amplificación sostenible por PCR y a la variabilidad sustancial en los clones de élite de álamo temblón destinados al establecimiento de plantaciones forestales de rotación rápida. Los ocho clones analizados tenían diferentes genotipos multilocus. Entre 114 árboles de tres rodales nativos de referencia situados cerca de las plantaciones establecidas, se identificaron 80 haplotipos, mientras que algunos genotipos repetidos se atribuyeron a clones naturales que aparecieron como resultado de la brotación. El conjunto seleccionado de marcadores SSR mostró una identificación individual fiable con una baja probabilidad de aparición de genotipos de álamo idénticos (un mínimo de y 1 × 10-4 para individuos no relacionados y relacionados, respectivamente). Se describen estudios de caso que demuestran las aplicaciones prácticas del sistema de prueba, incluyendo el análisis de la estructura clonal y los niveles de diversidad genética en tres rodales naturales de álamo que crecen en las regiones donde se establecieron las plantaciones hechas de clones de élite.
1. Introducción
La continua degradación de los bosques nativos en todo el mundo debido a la sobreexplotación requiere la introducción de formas intensivas de silvicultura que favorezcan no sólo el efecto económico sino también la conservación de los recursos genéticos de las plantas leñosas. Esta tarea declara la obtención y el mantenimiento de genotipos de élite de árboles forestales destinados a plantaciones forestales de rotación rápida. Los nuevos cultivares y variedades altamente productivos y sostenibles a los factores abióticos, las plagas y los patógenos aparecen como resultado del mejoramiento, la selección de mutaciones y/o la ingeniería genética. La propagación clonal de estos individuos sobresalientes asegura la fijación de sus rasgos útiles tanto para posteriores experimentos de mejora como para el establecimiento de plantaciones forestales específicas. En particular, la propagación microclonal a través del cultivo in vitro permite una clonación rápida, a gran escala y rentable de los individuos con los rasgos deseados, especialmente cuando las yemas o los injertos tradicionales son imposibles o requieren esfuerzos especiales.
Dado que los clones de plantas morfológica y anatómicamente diferentes pueden tener un aspecto similar, es esencial identificar de forma fiable aquellos que incluyen la discriminación entre sí y de los individuos coespecíficos o representantes de otras especies estrechamente relacionadas. En la silvicultura, el problema de la identificación individual es especialmente crucial, ya que el aspecto externo de los árboles depende en gran medida de los parámetros ambientales. En determinadas fases de la ontogénesis natural de los árboles forestales, por ejemplo, las plántulas y los brinzales, y especialmente como callos o explantes en cultivos celulares in vitro, los individuos pueden ser indiscernibles no sólo individualmente sino también en lo que respecta al diagnóstico de las especies. El largo tiempo de generación y la maduración ontogenéticamente tardía hacen que la tarea de pasporización genética de clones de élite en plantas leñosas sea real. El complejo proceso de múltiples etapas de obtención, propagación e introducción de cultivares de élite por mejoramiento o ingeniería genética aumenta la probabilidad de varios errores.
Los marcadores genéticos moleculares (MGM) demostraron ser herramientas muy eficientes para la identificación individual. Entre las diferentes clases de MGM, los microsatélites o las repeticiones de secuencias simples (SSR) son los que mejor se adaptan a los requisitos de los sistemas de pruebas para la identificación, debido a su especificidad, codominancia, neutralidad selectiva, suficiente riqueza alélica y heterocigosidad causada por una alta tasa de mutación. Además, debido al relativo conservadurismo del genoma dentro de los géneros y familias de plantas, los marcadores SSR y los cebadores PCR para su amplificación pueden ser transferibles de un taxón a otro.
En varias especies de álamo, se demostró el éxito de la huella de ADN y la diferenciación de clones, cultivares y variedades mediante marcadores moleculares que incluyen loci SSR.
En este trabajo informamos sobre el desarrollo de un sistema de pruebas basado en SSR para la identificación genética molecular de genotipos de élite micropropagados de álamo temblón, Populus tremula L., destinado al establecimiento de plantaciones forestales de crecimiento rápido en varias regiones de la Federación Rusa y se presentan los resultados de su aplicación para la discriminación de genotipos individuales, los estudios de la estructura clonal en rodales naturales de álamo temblón y la estimación de la variabilidad genética en las poblaciones.
2. Material y métodos
El desarrollo del sistema de pruebas para la identificación de genotipos de élite comprendió la selección de un conjunto de marcadores específicos que se ajustan a los requisitos de discriminación de alta resolución de los clones y la prueba de su fiabilidad y poder de identificación en un conjunto de genotipos de élite y un número suficiente de representantes de una especie estudiada.
2.1. Material vegetal
Los clones de élite de álamo e híbridos utilizados para el desarrollo de los sistemas de prueba para la identificación molecular se han obtenido a partir de cultivos celulares micropropagados mantenidos en la sucursal de Pushchino del Instituto de Química Bioorgánica Shemyakin y Ovchinnikov, de la Academia de Ciencias de Rusia (Pushchino, Rusia). Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.
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Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.
Prisady. Parcela experimental situada a 1 km al oeste del asentamiento de Prisady en el Raion (distrito) Serpukhovsky del oblast’ de Moscú (Rusia). Se utilizaron como población de referencia las hojas de 52 álamos jóvenes o de mediana edad (aproximadamente entre 10 y 25 años) de un rodal natural de varios años situado muy cerca (1 km) de esta parcela.
Voronezh. Se tomaron muestras de 17 árboles en un rodal adyacente a la parcela experimental establecida en Voronezh Oblast. Otros 13 árboles se recogieron a lo largo de la orilla del río Voronezh dentro de la ciudad de Voronezh, cerca de la plantación.
Yoshkar-Ola. Un rodal nativo joven de álamo temblón fue la fuente de árboles utilizados como población de referencia para una parcela experimental situada cerca de la ciudad de Yoshkar-Ola, República de Mari-El. Se recogieron hojas de 32 árboles.
Para minimizar el muestreo ocasional de individuos de origen vegetativo (a través de la brotación) se recogieron hojas de árboles a una distancia no inferior a 15-20 m entre sí. Este enfoque se empleó para incluir en las muestras de referencia plántulas predominantemente de polinización abierta que tuvieran la máxima diversidad genética. Sin embargo, basándose exclusivamente en el aspecto externo de los árboles y en la distancia entre ellos, no se pudo evitar el muestreo de los ramets que aparecían como resultado de la brotación, y el posterior análisis genético lo confirmó.
Los brotes con hojas se cortaron mediante una cortadora mecánica con un mástil telescópico de aluminio. Los brotes recogidos con hojas se colocaron en bolsas de plástico durante no más de 6 días a +4°С hasta su procesamiento. La preparación de las muestras incluyó la extracción de ADN y la colocación de los fragmentos de tejido foliar de reserva en bolsas zip etiquetadas con gel de sílice para su almacenamiento a largo plazo. Fuera del periodo de vegetación activa, las yemas vegetativas latentes pueden utilizarse con éxito para la extracción de ADN.
2.2. Extracción de ADN
Para la extracción de ADN se utilizaron fragmentos de hojas de aproximadamente 350-500 mg tomados de explantes que crecían in vitro en un medio especial (REF) en placas de Petri.
Para los árboles de poblaciones autóctonas, se extrajo ADN de fragmentos de 350-500 mg de tejidos foliares frescos o de 200-300 mg de tejidos foliares secados con sílice mediante un método modificado de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB).
2.3. Análisis de microsatélites
Los microsatélites, o SSR, representan una clase de secuencias de ADN repetidas en tándem con motivos cortos (1-6 pares de nucleótidos, pb) que difieren en el número de copias entre individuos debido a la alta tasa de mutación. Los alelos múltiples que suelen encontrarse en los loci de microsatélites codominantes crean una gran variedad de combinaciones genotípicas únicas que garantizan su identificación fiable, especialmente cuando se emplea un número suficiente de loci. Técnicamente, el análisis del polimorfismo SSR sólo requiere la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la posterior electroforesis (en gel o capilar) para el análisis de los fragmentos. Para el desarrollo del sistema de pruebas, elegimos la variante del método que utiliza únicamente un equipo básico y reactivos sencillos. Esto aseguró una mayor reproducibilidad de los procedimientos en cualquier laboratorio de PCR y permitió lograr una alta rentabilidad del análisis, lo cual es crucial para la identificación práctica de clones a gran escala.
Dado que se encontró un número sustancial de loci SSR nucleares para álamos en la literatura y en las bases de datos de cebadores, decidimos seleccionar de entre varias publicaciones y cebadores de prueba que pueden ser utilizados para la identificación rutinaria de genotipos basada en un equipo muy simple sin utilizar analizadores de ADN. Un conjunto inicial de cebadores SSR para su uso potencial como elementos del sistema de pruebas de identificación molecular en el álamo temblón fue el resultado de la búsqueda en las bases de datos bibliográficas (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) y en Molecular Ecology Resources Primer Database (http://tomato.bio.trinity.edu/).
La amplificación del ADN se llevó a cabo utilizando kits PCRCore (Isogen Laboratories, Ltd., Moscú, Rusia) en BioRad Inc. (USA) Dyad Thermo cycler. Los loci de microsatélites (enumerados en la Tabla 2) de las series ORPM y WPMS se amplificaron con cebadores específicos a una concentración de 1 mmol/mL y 5-10 ng de ADN objetivo utilizando el siguiente perfil de temperatura (1) desnaturalización inicial a 94°С durante 3 min; (2) 30 ciclos consistentes en 30 s de desnaturalización a 94°С, recocido de cebadores a temperatura y tiempo variables (véase la Tabla 3 para la temperatura de recocido final recomendada tras el ajuste del procedimiento), y elongación a 72°С durante 1,5 min, seguidos de (3) elongación final a 72°С durante 10 min y (4) enfriamiento de la mezcla de PCR a 4°С.
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| Comments: 1Tuskan et al., 2004 ; 2Smulders et al., 2001 ; 3by literature data in different Populus species (P. tremula, P. x canescens, and P. alba). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 1P: polymorphic, M: monomorphic, and N: no PCR amplification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en bloques de gel de poliacrilamida al 6% utilizando el sistema de tampón Tris-EDTA-borato. Tras teñir los geles de electroforesis con una solución de bromuro de etidio y visualizarlos con luz ultravioleta, se capturaron y guardaron imágenes gráficas con el sistema de documentación de geles Doc-Print II Vilber Lourmat y se procesaron en editores gráficos. El tamaño de los fragmentos se estimó mediante un software especializado (Photo-Capt). El ADN del plásmido pBR322 de E. coli, restringido por la endonucleasa HpaII se utilizó como marcador de peso molecular.
2.4. Análisis estadístico
La identidad de los clones se determinó mediante un análisis de coincidencias multilocus para datos codominantes. La probabilidad de genotipo (GP), que significa la probabilidad de aparición de una combinación multilocus particular en la población, y la probabilidad de identidad, que estima la probabilidad de coincidencia aleatoria de dos individuos no emparentados (PI) o emparentados (PIsib) por un conjunto particular de loci, se calcularon basándose en la distribución de las frecuencias alélicas en las muestras de la población.
La correspondencia de las distribuciones de genotipos observadas para cada locus SSR con la esperada según el equilibrio de Hardy-Weinberg se comprobó mediante el criterio de chi-cuadrado. Se calculó el número de alelos y las heterocigosidades observadas y esperadas para cada muestra nativa. Se empleó el estadístico F de Wright para evaluar la subdivisión genética entre las muestras de la población estudiada. Todos los cálculos mencionados se realizaron en el complemento para MS Excel, GenAlEx 6.5 .
3. Resultados y discusión
3.1. Desarrollo de sistemas de pruebas basados en SSR para la identificación de genotipos en Aspen
Para las pruebas iniciales, seleccionamos 33 loci microsatélites heterológicos tri-, tetra-, penta- y hexanucleótidos de dos conjuntos; la serie ORPM fue diseñada primero para Populus trichocarpa y la serie WPMS fue diseñada para Populus nigra . Las características de estos loci se indican en la Tabla 2. Las pruebas iniciales se realizaron en muestras de ADN de tres clones (47-1, PtV22 и С-control) de una colección in vitro almacenada y propagada en la sucursal de Pushchino del Instituto de Química Bioorgánica Shemyakin y Ovchinnikov, de la Academia Rusa de Ciencias (Pushchino, Moscow Oblast, Rusia). En esta fase, también se probó su variabilidad en 20-24 especímenes de álamo silvestre de Novosibirsk Oblast (Siberia Occidental, Rusia) y Krasnoyarsk Krai (Siberia Media, Rusia).
Como resultado de la primera fase de pruebas, 24 loci se amplificaron con éxito y otros nueve no produjeron productos de PCR. De los 24 loci que produjeron fragmentos de PCR, 20 loci se mostraron variables con un número de alelos de dos a nueve, mientras que cuatro loci que han sido amplificados con éxito eran monomórficos (Tabla 3). Tras realizar pruebas adicionales con regímenes de PCR variables, finalmente seleccionamos 14 loci con una amplificación fiable y un nivel de polimorfismo sustancial para incluirlos en el sistema de pruebas para la identificación genética molecular. En las figuras 2(a) y 2(b) se muestran ejemplos de la variabilidad de los loci microsatélites seleccionados en el álamo temblón.
(a)
(b)
(a)(a)
(b)
Los genotipos multilocus obtenidos de ocho clones de élite y los genotipos de referencia de los árboles silvestres de los rodales nativos se enumeran en la Tabla S1 del Material Suplementario disponible en línea en http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. Analizamos hasta 8 ramets muestreados en diferentes fases de la propagación microclonal. Dentro de los clones, los genotipos fueron estables y se reprodujeron sin ambigüedad entre los ramets independientemente de la fase de propagación. Tras la exclusión de los ramets del mismo genet, tanto los clones de élite como los genotipos de álamo de las poblaciones nativas incluidas en las muestras de referencia fueron 100% diferentes. La probabilidad de aparición de genotipos (GP: genotype probability) entre los clones de élite varió de 2,4 – 10-21 a 1,7 – 10-11, entre los árboles de las muestras de referencia de 4,0 – 10-24 a 5,8 – 10-9. La probabilidad de coincidencia ocasional de dos genotipos no relacionados (PI: probabilidad de identidad) varió de 4,8 – 10-10 en Yoshkar-Ola a 4,3 – 10-13 en Prisady. Ajustada a la probabilidad teórica de descendencia de los individuos comparados a partir de los mismos ancestros, la estimación más conservadora (PIsibs) se situó en el rango de 1,0 – 10-4 en Yoshkar-Ola a 9,3 – 10-6 en Voronezh. Todos los valores son bastante bajos, por lo que la frecuencia teórica de aparición de genotipos repetibles debido a la recombinación de diferentes gametos en el curso de la reproducción de la semilla no superaba alrededor de 1 combinación alélica idéntica encontrada accidentalmente de cada 10000 comparaciones. La relación de PI y PIsibs del número de loci utilizados se muestra en la Figura 3 y demuestra una probabilidad prácticamente insignificante de aparición de genotipos idénticos mientras se utilizan los primeros 7 a 8 loci seleccionados para la inclusión en el sistema de prueba. El uso de los 14 loci garantiza una fiabilidad y robustez adicionales del procedimiento.
El desarrollo de los loci microsatélites para las especies del género Populus comenzó a finales del siglo XX junto con las tecnologías de marcadores genéticos moleculares. En 1998, se diseñó uno de los primeros conjuntos de cebadores para la amplificación de loci SSR dinucleótidos para el álamo temblón americano, Populus tremuloides . En este trabajo se demostró el éxito de la amplificación cruzada de los mismos marcadores para otras especies de álamo, P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis y P. maximowiczii. Los autores también postularon el amplio espectro de aplicaciones de los loci SSR para diferentes fines, incluyendo la identificación de clones, el análisis de los apareamientos controlados, la cartografía del genoma, la selección asistida por marcadores, los ensayos de diversidad genética y el apoyo a los programas de conservación y gestión sostenible de los recursos genéticos forestales. Estudios posteriores proporcionaron otros ocho loci SSR dinucleótidos para Populus tremuloides . Desde entonces, se desarrollaron loci microsatélites para otras especies, incluyendo P. nigra . Algunos de estos loci también se amplificaron en P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans y P. lasiocarpa. Se diseñaron cebadores de loci SSR específicos para Populus euphratica . Posteriormente, este conjunto se utilizó para el desarrollo de paneles multiplexados utilizados para la estimación de la diversidad genética en esta especie.
La secuenciación de próxima generación fue la forma más eficiente de detección de repeticiones en tándem en el genoma del álamo y el diseño en sus bases de cebadores SSR transferibles como se demostró en el caso del álamo balsámico, Populus trichocarpa . Estos loci universales de amplificación cruzada se utilizan para la identificación de especies e híbridos y para la estimación de la diferenciación genética entre especies congéneres.
Los microsatélites también son útiles para la comprobación de la diversidad somaclonal dentro de un conjunto de ramets obtenidos por propagación microclonal de un único árbol donante , para la identificación de clones individuales en un aspecto de su tolerancia a los factores ambientales . No observamos ninguna variación en los patrones SSR entre los ramets del mismo linaje clonal de élite. Los microsatélites nucleares, junto con otras clases de marcadores moleculares, se emplean también para determinar el nivel de ploidía en los álamos, y hemos encontrado indicios de triploidía con respecto a varios genotipos. Los híbridos triploides de álamo a menudo demuestran un mayor vigor y resistencia a los patógenos, por lo que este asunto debe ser estudiado más a fondo por medio de análisis cariológicos y de citometría flotante.
3.2. Análisis de la estructura clonal en rodales nativos de álamo temblón
Desde el mismo momento del muestreo en campo del material en rodales silvestres se trató de evitar la inclusión de ramales clonales surgidos como brotes lo cual es común para el álamo temblón. En todos los rodales estudiados se aplicó el mismo esquema de muestreo manteniendo al menos 15-20 m entre los árboles. No obstante, en todas las poblaciones naturales estudiadas se encontraron ramets del mismo clon que indicaban la existencia común de propagaciones vegetativas (Tabla S1).
Prisady. Entre los 52 árboles estudiados, encontramos 41 haplotipos diferentes; un genotipo multilocus se encontró nueve veces y otro se encontró tres veces. Concluimos que estas combinaciones multilocus repetidas eran el resultado de que los brotes de muestreo eran ramets del mismo clon.
Voronezh. Entre 17 árboles recogidos en las proximidades del lugar de la plantación experimental no se encontró ningún individuo clonal. Trece árboles recogidos en la ribera del río Voronezh estaban representados por ocho genotipos: cuatro de ellos se encontraban en una réplica, en tres se encontraron dos ramets del mismo clon, y un genotipo se encontró en tres ejemplares evidentemente originados por brotes de progenitores ya existentes. En total, identificamos 25 haplotipos diferentes en esta muestra de población de referencia.
Yoshkar-Ola. Treinta y dos árboles analizados se combinaron en 13 haplotipos diferentes identificados por el análisis de coincidencias multilocus; un genotipo apareció dos veces, un genotipo apareció cinco veces, un genotipo apareció siete veces y un genotipo apareció nueve veces. Los genotipos repetidos correspondían evidentemente a ramets resultantes de la brotación.
Concluimos que la brotación y el alto nivel de clonalidad son un fenómeno generalizado en los rodales de álamo nativo. En el álamo temblón, así como en muchos otros álamos, los clones vegetativos son capaces de ocupar grandes áreas. Por lo tanto, para la recogida de una muestra libre de genotipos clonales repetidos las distancias entre los árboles deben aumentarse hasta al menos 40-50 m. Sin embargo, una estimación más precisa de la propagación máxima de un solo clon sobre el territorio del rodal también requiere una exploración especial.
Entre otras aplicaciones, los loci SSR nucleares fueron útiles para los estudios de la estructura clonal y las relaciones genéticas entre los genotipos clonales en rodales nativos o entre rodales nativos y artificiales . Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.
3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).
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| s.e.: standard error. : sample size. : mean number of alleles. : effective number of alleles. : observed heterozygosity. : expected heterozygosity. : unbiased expected heterozygosity. : fixation index (intrapopulation coefficient of inbreeding). |
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The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.
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| s.e.: standard error. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . Los niveles de diversidad genética intrapoblacional observados por nosotros en los rodales de álamo nativo estaban dentro del rango de valores comúnmente observados en los álamos y estimados por el análisis de los loci SSR ( y sus referencias).
Un número sustancial de estudios que emplean la técnica de microsatélites se centraron en la detección de la hibridación en rodales naturales o artificiales de álamos. Los loci SSR ayudan a revelar los mecanismos de cruce interespecífico y aislamiento reproductivo. En este estudio nos concentramos en la variación entre individuos y entre poblaciones más que en las diferencias interespecíficas, pero con respecto a algunos de los clones de élite estudiados, su origen híbrido debería ser comprobado genéticamente utilizando un conjunto complejo de marcadores pero de localización nuclear y citoplasmática. La identificación de alta fidelidad de los híbridos interespecíficos y de los clones industriales fue reportada en un número considerable de publicaciones . Una notable publicación informa sobre la identidad genética de algunos clones industriales de álamos previamente tratados como diferentes.
La tarea práctica de seguimiento de la identidad de clones comerciales en colecciones in vitro fue similar a la empleada en la presente investigación. En todas las aplicaciones en las que se requería una identificación individual fiable, los SSR mostraron una alta eficacia.
4. Conclusión
La aplicación de los loci microsatélites nucleares para la identificación genética y la evaluación de la variabilidad genética en clones de élite de álamo y rodales autóctonos mostró una alta eficacia del sistema de pruebas basado en SSR de bajo coste desarrollado. La autentificación fiable de los clones asegura el seguimiento genético de la propagación microclonal y permite revelar la clonalidad en los rodales nativos. Demostramos que el mismo conjunto de loci microsatélites puede emplearse con éxito para estimar los niveles de variabilidad genética intra e interpoblacional en el álamo temblón. La reconstrucción del parentesco entre clones individuales de élite o las relaciones genéticas de las poblaciones que se aparean de forma natural son tareas en perspectiva que pueden realizarse en el futuro utilizando los mismos marcadores.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.
Agradecimientos
Esta investigación cuenta con el apoyo del Ministerio de Educación y Ciencia de la Federación Rusa (Proyecto nº 14.607.21.0044 del 22.08.2014; identificador único RFMEFI60714X0044). Los autores también agradecen a E. M. Romanov, A. I. Shurgin, R. V. Sergeev (Universidad Estatal de Tecnología del Volga, Yoshkar-Ola, República de Mari El, Rusia), M. V. Drapaluk, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikov, E. O. Kolesnikova (Universidad Estatal de Ingeniería Forestal de Voronezh, Voronezh, Rusia), y G. B. Kolganikhina (Instituto de Ciencias Forestales RAS, Uspenskoe, región de Moscú, Rusia), por su ayuda en la recogida de muestras en rodales nativos. Los autores también agradecen a M. Zeps, D. Auzenbaha y A. Gailis (Instituto Estatal de Investigación Forestal de Letonia «Silava», Salaspils, Letonia) por compartir el material biológico y la información sobre los clones de élite de álamo.