Se han desarrollado numerosos enfoques alternativos a la clonación por PCR (1), incluyendo la clonación TA (2), la clonación independiente de la ligadura (LIC) (3-4), la clonación dependiente de la recombinasa (5-7) y la clonación mediada por PCR (8-10). La utilidad práctica de cualquier método de clonación se basa en su fiabilidad, más que en su comodidad, precio o eficacia en condiciones óptimas. Los métodos más fáciles de controlar y optimizar acaban siendo los más fiables. La clonación TA y la LIC requieren modificaciones finales que no pueden controlarse mediante electroforesis en gel. Las recombinasas se venden generalmente como componentes propios de los kits de clonación, por lo que pocos consumidores optimizan las reacciones de recombinación in vitro. La clonación por PCR de extensión solapada, descrita aquí, no es la primera forma de clonación mediada por PCR (8-10). Sin embargo, es relativamente sencilla, eficiente y fiable.
La primera de las dos PCRs (Figura 1A) crea un inserto lineal con secuencias de plásmido en ambos extremos (ver Materiales Suplementarios para los métodos e instrucciones para el diseño de los cebadores). Estas extensiones permiten posteriormente que las hebras del producto de la PCR (Figura 1A) actúen como un par de cebadores de gran tamaño en el fragmento del vector (Figura 1B). Tras la desnaturalización y el recocido, las hebras del inserto se hibridan con el vector y se extienden para formar un nuevo plásmido de doble cadena. La ADN polimerasa Phusion (Nº de cat. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, EE.UU.), crucial para la realización de la técnica, no posee actividad de desplazamiento de hebras. Por lo tanto, el producto final de la reacción es un plásmido de fusión de doble cadena con dos muescas (una en cada cadena). Este plásmido de doble cadena relajado se transforma en células competentes de Escherichia coli, que sellan las muescas con enzimas de reparación del ADN (Figura 1C). Empleamos la misma polimerasa termoestable para ambas PCRs, por lo que los usuarios sin experiencia pueden clonar eficientemente sin dominar la idiosincrasia de múltiples enzimas de restricción, polimerasas, glicosilasas, recombinasas y ligasas.
Primero utilizamos gfp para los experimentos de prueba de principio. El gen gfp se amplificó por PCR (Figura 1A) con los cebadores quiméricos (extremos 5′ complementarios al plásmido pQE30; extremo 3′ complementario a gfp). La PCR de extensión de solapamiento (Figura 1B) se realizó con cinco polimerasas de ADN diferentes (Tabla Suplementaria S1). Las altas concentraciones del inserto y las temperaturas de recocido relativamente bajas en la reacción (5-10°C por debajo de la temperatura de fusión calculada del complejo cebador/plásmido) son importantes para una extensión de solapamiento eficiente. Algunos de los productos de la PCR corresponden a la forma relajada del vector deseable, como revela el análisis en gel de agarosa (Figura 2A). El vector original pQE30 se destruyó en las reacciones con la endonucleasa de restricción DpnI (Figura 1C). Se utilizó una pequeña alícuota de cada reacción para transformar células de E. coli.
(A) Productos de la reacción de clonación por PCR de extensión solapada después de 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 ciclos mediante electroforesis en gel de agarosa. Se mezclaron tres nanogramos de vector pQE30 con 175 ng de inserto (250 molares de exceso) en 10 μL de volumen total; se separó una alícuota de 4μL de reacción en un gel de agarosa al 0,8%. M2, escalera de ADN de 1 kb; M1, plásmido ensamblado en forma circular cerrada y circular relajada. (B) Eficiencia de clonación por PCR de extensión solapada de un gen gfp en función del número de ciclos de PCR. Veinte microlitros de células E. coli competentes se transformaron con 1 μL de PCR de extensión solapada pQE30/inserto. El número de colonias verdes se trazó contra el número de ciclos de PCR para cada placa. (C) Eficiencia de la clonación por PCR de extensión solapada en función de la longitud del inserto. Se utilizó la ADN polimerasa Phusion para amplificar por PCR productos de distintos tamaños: El gen de la GFP (gfp), el gen de la β-D-glucuronidasa (gusA), el gen de la β-galactosidasa (lacZ) y el operón luxABCDE del plásmido pIMBB. Estos productos se purificaron en gel y se utilizaron en la reacción de PCR de extensión solapada con el vector pQE30. Se mezclaron tres nanogramos de vector pQE30 con 175-500 ng de inserto en un volumen total de reacción de 10 μL y se sometieron a 18 ciclos de PCR. Tras el tratamiento con DpnI, los productos de la PCR de extensión solapada se utilizaron para transformar células E. coli competentes. El número de colonias por placa se graficó contra el tamaño del inserto.
La ADN polimerasa Phusion fue más adecuada para la clonación por PCR de extensión de solapamiento que los competidores que probamos (Tabla Suplementaria S1), tal vez debido a su procesabilidad y fidelidad superiores (11-12). La Phusion DNA polimerasa es 10 veces más procesable que la Pfu polimerasa nativa (Cat. no. 600135; Stratagene, La Jolla, CA, USA), y produjo 46 veces más colonias (Tabla Suplementaria S1). También produjo 35× más colonias que la mezcla de ADN polimerasa Expand Long Template (Nº de cat. 11681834001; Roche, Basilea, Suiza), que es principalmente ADN polimerasa Taq. Zuo y Rabie desarrollaron un método similar con la ADN polimerasa Taq sola, e informaron de eficiencias de clonación igualmente modestas (8). La ADN polimerasa Taq es relativamente procesable (60% la de Phusion), pero la fidelidad global de la mezcla es sólo un 3,8% la de Phusion. Más del 98% de las colonias transformadas con ADN producido por la ADN polimerasa Phusion eran visiblemente verdes, lo que indica un mínimo error de clonación o arrastre del vector original.
Medimos la eficiencia de la clonación por PCR de extensión de solapamiento en función de los ciclos de temperatura; el número de clones recombinantes aumentó geométricamente durante los primeros 15 ciclos y alcanzó un máximo a los 17-18 ciclos (Figura 2B). Los ciclos posteriores dieron lugar a una ligera (~30%) disminución de la cantidad de clones producidos, asociada a la acumulación de los productos de ADN de alto peso molecular observados en los geles de agarosa (Figura 2A). La relación inserto/plásmido también puede tener un efecto pronunciado en el resultado de la reacción. Comparamos tres proporciones diferentes de vector:inserto (1:5; 1:50 y 1:250) en una reacción de clonación por PCR de extensión solapada con la ADN polimerasa Phusion. Las tres proporciones dieron lugar a la aparición de la forma mellada del plásmido (según la electroforesis en gel de agarosa, no mostrada) y de clones recombinantes (según la transformación y el crecimiento de colonias verdes). La proporción 1:250 produjo la mayor cantidad de clones recombinantes.
A continuación, aplicamos la clonación por PCR de extensión solapada para clonar los genes de GFP (gfp, 1 kb), β-D-glucuronidasa (gusA, 1,9 kb) y β-galactosidasa (lacZ, 3,2 kb), así como todo el operón luxABCDE (6 kb). La estructura correcta de todos los vectores recombinantes fue confirmada por el análisis de restricción y la función de la proteína reportera. La tasa de error aparente asociada a nuestro método, a juzgar por la fracción de colonias que no mostraron una actividad reportera completa, fue del <3%, independientemente del tamaño del inserto (datos no mostrados). Al mismo tiempo, el número de colonias que observamos en las placas tras la transformación disminuyó considerablemente con el aumento de la longitud del inserto (Figura 2C). El gráfico es casi lineal, lo que sugiere que 6,7 kb es el límite superior para los insertos con esta técnica.
El resultado de cualquier proyecto de clonación depende en gran medida del esfuerzo y la atención al detalle del trabajador. La reacción de clonación por PCR de extensión solapada descrita aquí es tan fácil de supervisar y optimizar como cualquier otro protocolo de PCR largo (13). En general, los rendimientos de la PCR son pobres cuando las condiciones de la reacción son demasiado estrictas (los cebadores no se anillan) o demasiado relajadas (cebado no específico). Ambas cosas se manifiestan mediante carriles vacíos en los geles de agarosa, aunque esto último también puede dar lugar a borrones o bandas no deseadas (véase el material suplementario para obtener detalles sobre el diseño de los cebadores y la optimización de la reacción de PCR). La rigurosidad de la PCR puede controlarse alterando las concentraciones de reactivos (cebadores, plantilla), la temperatura de recocido, los ingredientes del tampón (magnesio, pH, DMSO) o el número de ciclos de temperatura. En general, este enfoque de clonación demostró ser insensible a la presencia de los elementos repetidos internos (véase el material suplementario para más detalles). La ADN polimerasa Phusion puede utilizarse para catalizar tanto la amplificación por PCR del inserto como las reacciones de extensión de solapamiento, por lo que los profesionales sólo tendrán que familiarizarse con la idiosincrasia de una sola enzima.