Méthodes
Le protocole EMSA classique comporte 4 étapes majeures : 1) L’isolement des protéines à partir des cellules. Comme la grande majorité des protéines actives de liaison à l’ADN sont présentes dans le noyau, on utilise un protocole séquentiel de lyse membranaire qui permet d’obtenir des protéines nucléaires purifiées. 2) Fabrication et radiomarquage de la sonde ADN. Le phosphore 32 (32P) est fixé aux extrémités 5′ de la sonde d’ADN par l’utilisation de 32P-γATP comme substrat de la polynucléotide kinase T4. Les sondes d’ADN peuvent être achetées ou fabriquées sur mesure. 3) Les protéines purifiées et les sondes d’ADN radiomarquées sont co-incubées avec un tampon de liaison EMSA pour favoriser la liaison des protéines avec la sonde d’ADN. Si une EMSA de type « supershift » est réalisée, la réaction contient également un anticorps sélectif qui, lorsqu’il se lie aux complexes protéine-ADN, provoque un retard supplémentaire dans le gel. 4) Les complexes ADN-protéine sont chargés et passés sur un gel de polyacrylamide non dénaturant, ce qui entraîne la séparation des complexes ADN-protéine des sondes d’ADN libres. Les gels de polyacrylamide sont ensuite séchés et analysés par autoradiographie.