L’alpha-synucléine est une protéine de liaison à l’ADN qui module la réparation de l’ADN avec des implications pour les troubles à corps de Lewy

Humains

Les tissus des sujets humains ont été obtenus par le biais de l’Oregon Alzheimer’s Disease Center (ADC) et du département de pathologie de l’OHSU et les sujets affectés avaient des diagnostics cliniques et pathologiques établis (démence à corps de Lewy). L’utilisation des tissus a été approuvée par l’IRB de l’OHSU et réalisée conformément aux directives en vigueur. Un consentement éclairé a été obtenu de tous les participants et/ou de leurs représentants légaux.

Animaux

Les animaux ont été hébergés par le département de médecine comparée de l’OHSU dans un vivarium à cycle lumière-obscurité et à température et humidité contrôlées et maintenus sous un régime ad libitum de nourriture et d’eau. Toutes les expériences ont été approuvées par l’IACUC de l’OHSU, toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et règlements pertinents, et tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et leur souffrance.

Génération de modèles de souris

Lignes de souris transgéniques

En utilisant le noyau de modèles de souris transgéniques de l’OHSU, nous avons créé une souris exprimant l’alpha-synucléine humaine fusionnée à la GFP améliorée (étiquette C-terminale) contenant une mutation ponctuelle à l’alanine 53 (GCA > ACA) causant un changement d’acide aminé thréonine (A53T Syn-GFP). La séquence A53T-Syn-GFP a été clonée dans le vecteur MoPrp.Xho (don de David Borchelt)74 au site XhoI. L’expression est sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de la protéine prion de souris. La séquence de liaison de 30 pb entre A53T Syn et GFP est GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC, ce qui se traduit par GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr. Cette lignée de souris montre une expression de A53T Syn-GFP dans >90% des neurones corticaux et <10% des astrocytes (A.J.S. et V.K.U., données non publiées). Les souris transgéniques 142E Syn-GFP32,33,39,75 et les lignées de souris 142E Syn-GFP/mouse mSynKO ont été obtenues auprès des créateurs de la lignée, Edward Rockenstein et Eliezer Masliah. Les souris transgéniques TdTomato-NLS à localisation nucléaire ont été obtenues auprès des Laboratoires Jackson (stock# 023035). Les animaux knock-out alpha-synucléine et les souris témoins appropriées ont été obtenus auprès des Laboratoires Jackson (stock# 016123, 005304).

Génération de virus AAV8

Nous avons créé des constructions virales de A53T Syn-GFP contenant des mutations ponctuelles dans l’alpha-synucléine au niveau de la sérine-129 provoquant soit un changement d’acide aminé alanine (TCT > GCT) ou aspartique (TCT > GAT) (constructions offertes par Pamela McLean). Ces constructions ont été clonées dans le vecteur viral AAV8 auto-complémentaire pTRS-KS/CBh-GFP (du National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, IN), sous le contrôle transcriptionnel du promoteur CBh (Chicken Beta Actin Short), en utilisant les sites d’enzymes de restriction AgeI et ApaI. La séquence de liaison de 30 pb entre la GFP renforcée par l’alpha-Syn & est GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC. Les virus finaux scAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFP et scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP ont été réalisés par le Gene Transfer Vector Core du Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, MA.

Injections intraventriculaires de virus AAV8

Les ICV chez les nouveau-nés P0 ont été réalisés en suivant le protocole main libre76. Nous avons injecté 2 µL de virus non dilué dans chaque ventricule latéral à des titres ~1E12 copies génomiques par millilitre. Le seul écart par rapport à ce protocole publié est que nous n’avons pas dilué le virus dans le bleu trypan.

Induction de la pathologie de Lewy chez la souris

Des souris mâles de 2 à 3 mois ont été injectées avec des PFF de séquence WT de souris selon nos protocoles publiés précédemment25. 2,5 μl (2 mg/ml) de PFF fraîchement soniqués ou 2,5 μl de PBS ont été injectés dans le cortex sensori-moteur primaire de l’hémisphère droit chez des animaux anesthésiés à l’isoflurane (1 % à 2 %) et renvoyés dans leur cage d’origine. Ils ont été sacrifiés et préparés pour l’IHC comme décrit ci-dessous après un intervalle post-injection de 3 à 6 mois (6-9 mois).

Imagerie in vivo du cerveau de souris & analyse

La chirurgie de la fenêtre crânienne et l’imagerie ont été effectuées en utilisant le même protocole que celui que nous avons précédemment publié25,39 chez des animaux anesthésiés à l’isoflurane, à l’aide d’un microscope multiphotonique Zeiss LSM 7MP équipé de détecteurs BiG (GaAsP binaire) à double canal et d’une source laser à impulsions femtosecondes Coherent Technologies Chameleon titane-saphir (accordée à 860 nm pour l’imagerie de la Syn-GFP). Le logiciel d’acquisition d’images Zeiss Zen 2011 a été utilisé. Pour les expériences de dommages nucléaires induits par laser (LID), la fonction Bleaching de Zen a été utilisée pour éclairer de petites régions de taille submicronique dans le noyau avec le laser Chameleon accordé à ~730 nm pendant <1 ms). Un délai d’environ 4 secondes est nécessaire pour passer du laser à la longueur d’onde LID (~730 nm) et inversement. Dans un sous-ensemble d’expériences, des animaux ont été générés qui exprimaient Syn-GFP simultanément avec TdTomato-NLS localisé dans le noyau. Celles-ci ont démontré que la localisation de l’impulsion LID à des régions >2 μm de la périphérie de la cellule étaient toujours positionnées dans le noyau. Ce critère a été utilisé pour localiser l’impulsion LID dans les noyaux des neurones corticaux exprimant Syn-GFP in vivo. Les images LID ont été analysées avec ImageJ de manière similaire à nos expériences FRAP décrites précédemment25,39. Des régions d’intérêt (ROI) ont été sélectionnées pour obtenir les valeurs de fluorescence moyennes dans les ROIs de LID et de contrôle à l’intérieur du noyau. Le rapport du signal à chaque point temporel des régions d’intérêt de la LID par rapport aux régions d’intérêt du contrôle a été utilisé pour calculer le rapport d’enrichissement. Pour les expériences FRAP après LID, un protocole de photoblanchiment et d’analyse similaire à celui de nos travaux publiés précédemment25,39 a été utilisé. Les données ont été analysées dans Prism 6 (GraphPad) pour obtenir des ajustements exponentiels uniques du temps de récupération et des fractions immobiles et mobiles. Tous les animaux utilisés étaient âgés de 5 à 9 mois.

Cultures de neurones corticaux de souris et imagerie

Les souris C57/BL6 ont été utilisées pour générer des cultures neuronales primaires isolées à partir de souris embryonnaires, sur la base des méthodes de Kaech et Banker77, et adaptées de Gray et ses collègues78. En bref, les embryons ont été récoltés à 18 jours de gestation sur des femelles anesthésiées. Le cortex a été disséqué, doucement haché et trypsinisé pour générer des suspensions de neurones dispersés. Des neurones corticaux fraîchement isolés ont été électroporés avec des plasmides codant pour deux constructions d’alpha-synucléine humaine marquées par une GFP améliorée (scAAV-huSyn_s129A:EGFP, scAAV-hySyn_s129D:EGFP). 330 000 neurones corticaux électroporés de chaque construction ont été placés sur des plats contenant des lamelles recouvertes de poly-L-lysine dans un milieu MEM (GIBCO/Life Technologies), 5 % de FBS (Atlanta Biologicals) et 0,6 % de glucose (Sigma-Aldrich). Après 4 heures, le milieu a été retiré et remplacé par le milieu Neurobasal complété par 1 × GlutaMAX (GIBCO/Life Technologies) et 1× GS21 (MTI-GlobalStem). Chaque boîte a été alimentée chaque semaine avec 0,5 ml de milieu Neurobasal plus GlutaMAX et GS21, la première alimentation (à 5 jours in vitro (DIV)) contenant de l’AraC. Après 7 DIV, les lamelles de neurones cultivés de chaque construction ont été imagées en utilisant un système de cellules vivantes avec une chambre d’imagerie fermée. Les expériences de LID nucléaire en culture cellulaire ont été réalisées sur la même plateforme d’imagerie en utilisant les mêmes protocoles d’imagerie et d’analyse que nos expériences de LID nucléaire in vivo décrites ci-dessus.

Cultures d’hippocampe de souris & Ensemencement de PFF

Les cultures d’hippocampe de souris et la formation de pathologie de Lewy induite par ensemencement de PFF ont été réalisées en utilisant nos techniques précédemment décrites79,80. En bref, des cultures neuronales primaires ont été préparées à partir de cerveaux de souris E16-E18 CD1 (Charles River). Toutes les procédures ont été réalisées conformément au guide NIH pour le soin et l’utilisation des animaux expérimentaux et ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Pennsylvanie. Les neurones hippocampiques dissociés ont été placés sur des lamelles recouvertes de poly-D-lysine (Carolina Biological Supply) à une densité d’environ 50 000 cellules/cm2. Des PFF d’alpha-synucléine humaine recombinante portant la mutation pathogène S87N81 ont été diluées dans du PBS à 0,1 mg/mL, soniquées et diluées dans le milieu neuronal. Les neurones ont été traités à 5 ug/ml à DIV 7 et incubés pendant 12 jours. Les cellules ont été fixées dans du PFA à 4%/4% de saccharose pendant 15 min à température ambiante, puis perméabilisées dans du Tx-100 à 0,3% et bloquées pendant 1 heure à température ambiante dans du FBS à 3%/3% de BSA. Les anticorps primaires (anti-α-Synucléine PhosphoSer129 clone 81 A, dilution 1:2000, Biolegend cat#825701 ; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) clone JBW301, dilution 1:500, Millipore cat#05-636) ont été dilués dans le tampon de blocage et incubés à température ambiante pendant 3 heures. Les lamelles ont ensuite été lavées avec du PBS 3 fois et incubées avec les anticorps secondaires appropriés marqués au Alexa-fluor. Les lamelles lavées ont été montées sur des lames en utilisant Fluoromount-G avec DAPI (Fisher Scientific).

Anticorps secondaires : Alexa 488, chèvre anti IgG2a de souris, dilution 1:1000, Fisher Scientific ; Alexa 594, chèvre anti IgG1 de souris, dilution 1:1000, Fisher Scientific.

Un scanner PE lamina a été utilisé pour imager les lamelles. Le logiciel HALO (Indica Labs) a été utilisé pour compter les foyers γH2AX et les noyaux colorés au DAPI situés à 1,5 mm du bord de chaque lamelle. L’analyse statistique des données a été réalisée à l’aide de Graphpad Prism version 4.

Analyse par immunofluorescence &

Cellules HAP1

Les lignées cellulaires Hap1 parentales WT contrôle (item #C631 lot 29663) et Hap1 Human SNCA 103 bp deletion knockout (item #HZGHC003210c003 lot 2) ont été obtenues auprès d’Horizon Discovery et cultivées dans un milieu IMDM (Gibco# 11995-065) + 10% de sérum bovin fœtal + Pen-Strep et cultivées dans un incubateur humidifié à 37 C avec 5% de CO2. Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles #1.5 recouvertes de PLL dans des boîtes de 35 mm un jour avant la fixation et cultivées jusqu’à ~80% de confluence. Les cellules ont été fixées dans du PFA à 4% dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante (RT), lavées une fois dans du PBS et conservées à 4°C dans du PBS jusqu’à la procédure de coloration. Les cellules fixées ont été perméabilisées avec 1 ml de PBS + 0,25% de Triton-X 100 en agitant doucement à température ambiante pendant 20 minutes. La solution a été retirée et les cellules ont été bloquées pendant 20 minutes dans 1 ml de tampon de blocage (0,1% de Triton-X 100, 10% de sérum de chèvre normal dans du PBS). Les anticorps primaires ont été dilués dans le tampon d’incubation (dilution 1:5 du tampon de blocage dans du PBS) et incubés pendant la nuit à température ambiante sous légère agitation. Le jour suivant, les cellules ont été lavées 3 fois dans du PBS pendant 15 minutes. Des anticorps secondaires complémentaires marqués par fluorescence ont été dilués au 1:1000 dans le tampon d’incubation, ajoutés aux cellules et incubés à température ambiante, dans l’obscurité, pendant la nuit, sous légère agitation. Le jour suivant, les cellules ont été lavées 3 fois dans du PBS pendant 20 minutes. La coloration nucléaire a été effectuée juste avant le dernier lavage au PBS avec 2,5ug/mL de DAPI (Sigma D9542) dans du PBS pendant 20 minutes. Avant le montage, les cellules ont été lavées brièvement dans de l’eau désionisée. Les lamelles de couverture ont été montées avec 13 µL de solution antifadente CitiFluor CFMR2 et scellées avec la colle pour lamelles de couverture CoverGrip de Biotium. Les lames ont été imagées sur un microscope confocal à balayage laser Zeiss Elyra PS.1 710 avec le logiciel Zen. Des piles Z de pas de 0,5 µm ont été acquises au zoom 63×1, en prenant soin de ne jamais saturer le signal de l’anticorps dans le noyau.

Les anticorps primaires utilisés étaient : anti-Syn1, dilution 1:500, monoclonal de souris, BD Biosciences, cat. 610786 ; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymère clone 10 H, dilution 1:500, polyclonal de poulet, Tulip BioLabs, cat. 1023 ; anti-Phospho-Histone H2A.X, dilution 1:500, monoclonal de lapin, Cell Signaling, cat. 9718 ; anti-phosphoS129-Syn EP1536Y, dilution 1:500, monoclonal de lapin, Abcam, ab51253 ; anti-phosphoS129-Syn 81 A, monoclonal de souris dilution 1:667, Covance, cat. 825701 ; anti-Syn 4B12, dilution 1:500, monoclonal de souris, Biolegend, cat. 807804 ; et anti-Syn EPR20535, dilution 1:100, monoclonal de lapin, Abcam, ab212184. Les anticorps secondaires utilisés étaient : Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin, ThermoFisher cat.A-21245 ; Alexa Fluor 555 chèvre anti-souris, Abcam ab150114 ; Alexa Fluor 488 âne anti-poulet, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.

Traitement à la bléomycine ICC : La poudre de sulfate de bléomycine (Selleckchem, cat. S1214) a été diluée dans H2O pour obtenir une solution mère de 10 mg/mL, aliquotée et stockée à -80C. Un jour avant le traitement, les cellules Hap1 WT et Hap1 SNCA KO ont été ensemencées sur des lamelles #1.5 recouvertes de PLL dans des boîtes de 35 mm pour être confluentes à ~80% le jour suivant. Le jour du traitement, le milieu normal a été retiré et 2 mL de milieu chaud frais contenant 10ug/mL de bléomycine ont été ajoutés à chaque plat. On a ajouté à chaque boîte un milieu chaud frais, sans bléomycine, pour les cellules sham. Les cellules ont été placées dans un incubateur humidifié pendant 1 heure à 37 C avec 5 % de CO2. Après le traitement, le milieu a été retiré et les cellules ont été fixées dans du PFA à 4% dans du PBS pendant 10 minutes à RT, lavées 1x dans du PBS et stockées à 4 C dans du PBS jusqu’à la procédure de coloration.

Traitement à la Bléomycine Western Blot : Un jour avant le traitement, les cellules Hap1 WT et Hap1 SNCA KO ont été ensemencées sur 2 × 10 cm plaques par condition pour être ~80% confluentes le jour suivant. Le traitement à la bléomycine a été effectué de la même manière que pour l’ICC. Après le traitement, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées 1x avec du PBS chaud. Les cellules ont été récoltées par trypsinisation et rassemblées dans des tubes coniques de 15 mL, pelletées pendant 5 minutes à 200rcf. Le liquide a été aspiré, les pellets ont été remis en suspension dans 2 mL de PBS et transférés dans 2 × 2 mL de tubes de microcentrifugation. Les protéines ont été extraites dans des fractions cytosoliques et nucléaires en utilisant le kit d’extraction NE-PER (Thermo-Fisher, cat. 78833) selon les recommandations du fabricant avec l’ajout d’une brève sonification (10 secondes, 10 kHz) après la première étape de resuspension nucléaire. Les préproduits protéiques ont été stockés à -80C jusqu’à l’analyse par Western blot.

Pour l’imagerie confocale, les images ont été acquises sur un microscope confocal Zeiss Elyra PS.1 avec un objectif à huile Plan-Apochromat 63x/1,40. Toutes les analyses de colocalisation ont été réalisées à l’aide du logiciel ImageJ (NIH) en créant des ROIs pour chaque noyau à partir d’une seule image située au milieu du noyau dans la direction z. Le plugin CoLoc 2 a été utilisé pour mesurer le coefficient de Pearson entre les signaux et la valeur de fond attendue après translation aléatoire d’un canal par rapport à l’autre.

Cerveau de souris

Les cerveaux de souris mâles (âgés de 3 à 6 mois) ont été disséqués immédiatement post mortem, placés dans 6 mL de PFA frais à 4 % dans du PBS, et fixés avec un Pelco Biowave Pro pendant 90 minutes à 150 W dans un bain-marie circulant. Les cerveaux ont été déplacés à 4 °C pour continuer à être fixés pendant la nuit. Le lendemain, le PFA a été remplacé par de l’azide de sodium à 0,05 % et conservé à 4 °C jusqu’au traitement ultérieur.

Après fixation, les cerveaux ont été tranchés en sections flottantes coronales ou sagittales de 50 µm à l’aide d’un Vibratome Leica VT1000S. Pour certains anticorps, une récupération des épitopes induite par la chaleur (HIER) était nécessaire avant le blocage. La tranche de cerveau a été ajoutée à un tube contenant un tampon HIER (1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0,05% Tween, pH = 8.5), étuvés pendant 20 minutes, et refroidis à température ambiante pendant 20 minutes. Les tissus ont été bloqués pendant 1 heure dans un tampon de blocage (0,1 % de Triton-X, 10 % de sérum de chèvre, dans du PBS). L’anticorps primaire a été dilué dans le tampon d’incubation (dilution 1:5 du tampon de blocage) à une concentration optimisée pour chaque anticorps et incubé pendant la nuit, dans l’obscurité, sous agitation à température ambiante. Le tissu a été lavé pendant 30 min avec du PBS 5 fois. L’anticorps secondaire complémentaire a été dilué dans le tampon d’incubation et incubé de la même manière pendant une nuit à température ambiante. Le jour suivant, le tissu a été lavé avec 5 échanges de PBS. La coloration au DAPI a été effectuée juste avant le dernier lavage. Le tissu a été monté sur une lame dans la solution antifadente CitiFluor CFMR2. Une lamelle couvre-objet #1,5 a été scellée sur le tissu avec le scellant pour lamelles couvre-objet CoverGrip de Biotium.

Les anticorps primaires utilisés étaient : anticorps anti-α-Synucléine Phospho (Ser129) clone 81 A, monoclonal de souris, dilution 1:667, Biolegend cat#825701 ; anticorps anti-alpha Synucléine (phospho S129) , monoclonal de lapin, dilution 1:500, Abcam cat#ab51253 ; anti-asyn (Syn1/mSyn), monoclonal de souris, dilution 1 :500 dilution, BD Biosciences cat#610786 ; Anti-pan-ADP-ribose binding reagent, lapin, dilution 1:1000, Millipore cat#MABE1016 ; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, clone 10 H (PADPR), poulet, dilution 1:100, Tulip BioLabs cat#1023 ; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) anticorps clone JBW301, souris, dilution 1:500, Millipore cat#05-636 ; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) anticorps clone 20E3, lapin monoclonal, dilution 1:500, Cell Signaling cat#9718 Les anticorps secondaires utilisés étaient : Alexa 647, chèvre anti-lapin, dilution 1:1000, Invitrogen cat#MPA21245 ; Alexa 647, chèvre anti-souris, dilution 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236 ; Alexa 555, chèvre anti-lapin, dilution 1 :1000 dilution, Abcam cat#ab150078 ; Alexa 555, chèvre anti-souris, 1:1000 dilution, Abcam cat#ab150114 ; Alexa 488, chèvre anti-poulet 1:1000 dilution, Abcam cat# ab150169.

Pour l’imagerie confocale, les images ont été acquises sur un Zeiss Elyra PS.1. microscope confocal avec un objectif à huile Plan-Apochromat 63x/1,40. Des puissances laser de 1-5% ont été utilisées pour acquérir des z-stacks à travers 2-4 régions de cortex par section de tissu. Le logiciel d’imagerie Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) a été utilisé pour analyser les données IHC. Afin de segmenter le noyau du cytoplasme, une surface a été créée en utilisant le canal DAPI. Seuls les noyaux neuronaux entiers ont été analysés. Les informations statistiques (intensité moyenne, intensité totale, nombre total de surfaces) pour chaque canal ont été exportées et analysées dans Prism 6 (GraphPad). Pour l’analyse des foyers à l’intérieur des noyaux, le signal nucléaire du canal choisi a été masqué en utilisant une surface nucléaire créée à partir du canal DAPI. À partir du signal nucléaire du canal masqué souhaité, des surfaces ont été réalisées pour quantifier les foyers nucléaires.

Cerveau humain

Des sections de l’amygdale de cas humains d’autopsie de démence à corps de Lewy ont été prélevées immédiatement après l’autopsie (intervalle post-mortem de 12 à 48 heures), placées dans 6 ml de PFA frais à 4 % dans du PBS, et fixées avec un Pelco Biowave Pro pendant 90 minutes à 150 W dans un bain-marie circulant. Les sections ont été déplacées à 4 °C pour continuer à être fixées pendant la nuit. Le lendemain, le PFA a été remplacé par de l’azide de sodium à 0,05 % et stocké à 4 °C jusqu’au traitement ultérieur.

Après fixation, les sections d’amygdale ont été tranchées en sections flottantes de 50 µm à l’aide d’un Vibratome Leica VT1000S. Les tissus ont été bloqués pendant 1 heure dans un tampon de blocage (0,1% de Triton-X, 10% de sérum de chèvre, dans du PBS). L’anticorps primaire a été dilué dans le tampon d’incubation (dilution 1:5 du tampon de blocage) à une concentration optimisée pour chaque anticorps (voir ci-dessous) et incubé pendant la nuit, dans l’obscurité, sous agitation à température ambiante. Le tissu a été lavé pendant 60 min avec du PBS 5 fois. L’anticorps secondaire complémentaire a été dilué dans le tampon d’incubation et incubé de la même manière pendant une nuit à température ambiante. Le jour suivant, le tissu a été lavé avec 5 échanges de PBS. La coloration au DAPI a été effectuée juste avant le dernier lavage. Le tissu a été monté sur une lame dans la solution antifadente CitiFluor CFMR2. Une lamelle couvre-objet #1.5 a été scellée sur le tissu avec le Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Les anticorps primaires utilisés étaient : anticorps anti-α-Synucléine Phospho (Ser129) clone 81 A, monoclonal de souris, dilution 1:667, Biolegend cat#825701 ; anticorps anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) clone 20E3, monoclonal de lapin, dilution 1:500, Cell Signaling cat#9718. Les anticorps secondaires utilisés étaient : Alexa 647, chèvre anti-souris, dilution 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236 ; Alexa 488, chèvre anti-lapin, dilution 1:1000, Abcam cat#ab150077.

Les images ont été capturées sur un Zeiss LSM 880 avec microscope Airyscan. Pour déterminer les signaux spécifiques des anticorps à partir de la coloration de fond autofluorescente accrue au sein des échantillons de tissus humains, un protocole de démixage linéaire a été utilisé. Le mode Lambda a été utilisé pour régler les paramètres de l’objectif, des lasers et des dichroïques nécessaires à l’imagerie de l’échantillon multicolore. En utilisant les mêmes paramètres, des spectres de référence individuels ont été créés à partir d’échantillons colorés unicolores. En outre, un échantillon non coloré a été utilisé pour déterminer les spectres de référence de fond. Tous les résidus ont été minimisés lors de la création des spectres de référence. L’échantillon multicolore a ensuite été imagé, en spécifiant le fond pertinent et les spectres unicolores, et démixé à l’aide du logiciel Zeiss Zen.

Le logiciel d’imagerie Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) a été utilisé pour analyser les données IHC. Afin de segmenter le noyau du cytoplasme, une surface a été créée en utilisant le canal DAPI. Seuls les noyaux neuronaux entiers ont été analysés. Les informations statistiques (intensité moyenne, intensité totale, nombre total de surfaces) pour chaque canal ont été exportées et analysées dans Prism 6 (GraphPad). Pour l’analyse des foyers à l’intérieur des noyaux, le signal nucléaire du canal choisi a été masqué en utilisant une surface nucléaire créée à partir du canal DAPI. A partir du signal nucléaire du canal masqué souhaité, des surfaces ont été réalisées pour quantifier les foyers nucléaires.

Essai des comètes sur cellules HAP1

Les essais des comètes sur cellules HAP1 neutres ont été réalisés selon les recommandations de Trevigen (kit d’essai des comètes Trevigen, cat#4250-050-K). Des suspensions cellulaires (2 × 104 cellules/ml) dans de l’IMDM sans sérum (Sigma) mélangées dans un rapport 1:2 avec du LMAgarose Comet (Trevigen) ont été déposées à la pipette sur des CometSlidesTM (Trevigen) et placées à 4 °C pendant 10-15 min pour être coulées. Les lames ont été incubées pendant une nuit dans la solution de lyse (Trevigen) à 4 °C dans l’obscurité, puis dans un tampon d’électrophorèse neutre (acétate de sodium 300 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 9) pendant 1 heure à 4 °C dans l’obscurité. Les lames ont été électrophorisées dans un tampon frais pendant 40 minutes à 20 V (1 V/cm) à 4 °C. Après l’électrophorèse, les lames ont été incubées d’abord dans un tampon de précipitation de l’ADN (acétate d’ammonium 1 M, EtOH 86,6 %), puis dans de l’EtOH 70 % à température ambiante dans l’obscurité, pendant 30 minutes chacune, puis séchées à 37 °C. Les lames ont été colorées avec du SYBRTMgreen 1X (Invirogen) dans du PBS 1X (Gibco) à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité, plongées dans du dH2O 10 fois pour laver l’excès de colorant, puis séchées à 37 °C. Les comètes ont été visualisées sur un Apotome Zeiss à l’aide d’une lentille 10X et notées à l’aide de CometScoreTM.

Traitement à la bléomycine : test des comètes : Un jour avant le traitement, les cellules Hap1 WT et Hap1 SNCA KO ont été ensemencées sur 2 × 35 mm plaques par condition pour être ~80% confluentes le jour suivant. Les protocoles de traitement à la bléomycine et au Sham ont été effectués de la même manière que pour l’ICC. Après le traitement, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées 1x avec du PBS chaud. Si une période de récupération a suivi, alors un milieu chaud frais a été ajouté et les cellules ont été replacées dans l’incubateur. Les cellules ont été récoltées par trypsinisation avec de la Tripsine-EDTA à 0,05% (Gibco cat. 15400-54). Les cellules trypsinisées des plaques de 2 × 35 mm ont été recueillies dans des tubes coniques de 15 mL et pelletées pendant 5 min 200rcf. Le liquide a été aspiré, les pellets ont été remis en suspension dans 250uL de milieu frais sans FBS ni Penn-Strep, transférés dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et conservés sur la glace jusqu’à leur utilisation dans le test Comet comme décrit ci-dessus.

Test des comètes sur tissu cérébral de souris

Le tissu cérébral fraîchement extrait de souris mâles (âgées de 1, 3, 6-9 mois) a été finement haché avec une lame de rasoir et suspendu dans du PBS glacé (sans Ca2+ et Mg2+) et homogénéisé pendant 30 secondes à l’aide d’un homogénéisateur manuel. Le tissu a été micro-centrifugé pendant une minute et le surnageant dilué au 1:10 dans du PBS. Les cellules ont été comptées à l’aide d’un hémocytomètre et diluées à 1 × 105/ml. Les cellules diluées ont été combinées avec de l’agarose à faible point de fusion (LM) dans un rapport de 1:2 (v/v) et étalées sur le puits de la lame de verre pour le test des comètes (kit de test des comètes Trevigen, cat#4250-050-K). Les lames ont été séchées dans l’obscurité à 4 °C pendant 15 minutes et ont été placées dans la solution de lyse du kit à 4 °C pendant la nuit. L’excès de tampon a été évacué des lames avant l’immersion dans 50 ml de TBE, pH 7,4, pendant 30 minutes à 4 °C. Les lames ont été soumises à une électrophorèse dans du TBE, pH 7.4, à 20 V pendant 40 minutes à 4 °C. L’excès de TBE a été drainé et les lames ont été placées dans du dH2O deux fois pendant 5 minutes. Les lames ont ensuite été placées dans de l’EtOH à 70 % pendant 5 minutes et séchées à 37 °C pendant 15 minutes. 100 µl de SYBR-Green 1X ont été pipetés sur chaque cercle d’agarose séché et les échantillons ont été colorés pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. L’excès de solution SYBR-Green a été éliminé et les lames ont été rincées dans du dH2O plusieurs fois. Les lames ont été laissées sécher complètement à 37 °C et stockées à 4 °C. Les comètes ont été visualisées sur un microscope Zeiss ApoTome sous un objectif 10X et notées en utilisant le logiciel CometScore™ (TriTek).

Electrophoretic mobility shift assay

Préparation de l’ADN

Des fragments de 300 pb ont été extraits d’une échelle de 100 pb (NEB) séparés sur un gel d’agarose à 1% à 175 V pendant 2 heures à RT en utilisant le kit d’extraction de gel QIAquick (Qiagen). L’ADN a été nettoyé à l’aide du kit de nettoyage et de concentration d’ADN (Zymo Research), et élué dans du TE 1X. La concentration finale et la pureté de l’ADN ont été déterminées par Nanodrop.

Electrophoretic mobility shift assay

Des fragments d’ADN (20 ng) ont été mélangés avec de la protéine recombinante hu_ser129_phospho-syn (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg et 16 µg ; Proteos, Inc.), de la hu_α-synucléine recombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg et 16 µg ; Proteos, Inc.) ou de la glutathion S-transférase recombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg et 16 µg ; GenScript) dans une réaction de 20 μL contenant 94 mM Tris-Cl, pH 8,0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA et 5 % de ficoll sur glace pendant 20 min, puis à température ambiante pendant 30 min. Après l’ajout de 2 µL de tampon de chargement orange 10X (Licor), 8 μL de la réaction totale ont été chargés dans un gel TBE de polyacrylamide à 10 % ou 6 % (Novex) et passés à 100 V pendant 2 heures à RT. Les gels ont été colorés pendant 30 minutes avec 10X SYBRTM Safe DNA Stain (Invitrogen) dans 1X TBE. Les images ont été acquises à l’aide du système d’imagerie Fluorchem M et quantifiées à l’aide de l’outil d’analyse de gel ImageJ.

Western blot

Les gels de polyacrylamide TBE à 10 % ont été transférés sur une membrane en nylon Biodyne™ B (Thermofisher Scientific) à 30 V pendant 1 heure et 16 min sur glace dans du TBE 0,5X à l’aide du système de buvardage Novex XCell II (Invitrogen). Les membranes ont été bloquées pendant la nuit dans le tampon bloquant Odyssey PBS (Li-Cor) et colorées pendant 1 heure à température ambiante avec Syn1 (1:1 000 ; Biolegend) et pendant la nuit à 4 °C avec IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10 000 ; Li-Cor). Les images ont été acquises à l’aide du système d’imagerie Li-Cor Odyssey CLx.

Western Blot pour les préparations de protéines nucléaires Hap1 : Les concentrations des préproduits de protéines cytoplasmiques et nucléaires de Hap1 NE-PER ont été quantifiées à l’aide du kit de dosage des protéines BCA de Pierce (Pierce, cat. 23225) et lues sur un photomètre de microplaques Multiskan FC (Fisher, cat. 51119000) avec une lecture à 550 nm. 5 µg & 10 µg de protéine nucléaire ont été dilués dans un tampon d’échantillon SDS (Novex, cat. LC2676) + BME (Gibco, cat. 21985-023) et chargés sur un gel Tris-Glycine 10-20% (Novex, cat. XP10202BOX). 3 µL d’échelle de protéines pré-colorées (NEB, cat. P7719) ont été chargés pour référence. Le gel a été analysé à l’aide du système de transfert Novex Xcell dans un tampon SDS (Novex, cat. LC2675) pendant 70 minutes à 120 V. Le gel a été désassemblé et préparé pour le transfert sur une membrane Immobilon-FL PVDF (Millipore, cat. IPF00010). Le gel a été transféré dans un tampon de transfert Tris-Glycine (Novex, cat. LC3675) sur glace pendant 2h à 25 V. Après le transfert, la membrane a été retirée et immédiatement fixée dans du PFA à 4 % + 0,01 % de glutaraldéhyde pendant 10 minutes avec une légère agitation à température ambiante. La membrane a été lavée 1x dans du milliQ H2O et colorée avec le kit de coloration des protéines totales REVERT (LI-COR, cat. 926-11010) selon le protocole du fabricant. La protéine totale colorée a été acquise en utilisant l’imageur LI-COR Odyssey CLx. Après l’inversion de la coloration REVERT, la membrane a été lavée 1x dans du milliQ H2O et bloquée dans le tampon de blocage Odyssey (LI-COR, cat. 927-40000) pendant une nuit à 4°C avec une légère agitation. Les anticorps primaires ont été dilués au 1:1000 dans le Blocking Buffer et incubés pendant 2 heures à température ambiante avec une légère agitation. La membrane a été lavée 3 fois dans du Tween20 à 0,1 % dans du PBS pendant 10 minutes. Les anticorps secondaires (LI-COR IR680LT donkey anti-rabbit cat. 926-68023 ; IR800CW anti-souris d’âne cat. 926-32212) ont été dilués au 1:10000 dans un tampon de blocage et incubés pendant 1 heure à température ambiante avec une légère agitation. La membrane a été lavée 3x dans du Tween20 à 0,1% dans du PBS pendant 10 minutes et 1x dans du PBS pendant 10 minutes, à température ambiante. Les images ont été acquises à l’aide de l’imageur LI-COR Odyssey CLx. L’analyse a été faite sur FIJI en utilisant l’analyseur de gel. Le signal de l’anticorps a été normalisé par rapport à la protéine totale de REVERT.

T4 ligase-mediated DNA end-joining assay

Chaque réaction d’end-joining contient 150 ng d’un produit PCR d’ADN de 1,2 kb digéré aux extrémités 5′ et 3′ avec l’enzyme de restriction XhoI à extrémité cohésive (NEB RO146S). Les réactions sont effectuées dans un volume réactionnel de 20 µl contenant 150 ng d’ADN digéré, 2,8 µl de tampon protéique (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µl de glycérol à 20 % dans PBS + Mg + Ca, 2 µl de tampon de ligase T4, 200 ng ou 40,5 ng de protéines, 25U de ligase T4 (NEB M0202) et de l’eau stérile jusqu’au volume. Tous les composants, à l’exception de la T4 ligase, ont été combinés et incubés sur glace pendant 15 min. 25U de T4 ligase ont été ajoutées à la réaction et incubées à RT pendant 90 min. Après incubation, la réaction a été immédiatement nettoyée avec une colonne Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research) et éluée dans 15 µL de H2O stérile. Du SybrGreen et du tampon de chargement ont été ajoutés à l’ADN et les échantillons ont été électrophorés dans un gel TAE d’agarose à 1 % pendant 1 heure à 135 V et imagés sur un imageur à chimiluminescence et fluorescence Syngene G:BOX. ImageJ a été utilisé pour analyser l’image du gel et les données ont été représentées graphiquement à l’aide de Prism 6 (GraphPad).

Conception expérimentale & analyse statistique

Toutes les valeurs quantifiées sont rapportées en tant que moyenne ± SEM. Le type et le nombre (N) d’échantillons pertinents, ainsi que les tests statistiques utilisés pour évaluer la signification de chaque expérience sont présentés avec chaque ensemble de données. Les tailles d’échantillon utilisées dans chaque expérience étaient basées sur des estimations des tailles d’effet attendues (~10-50%) et des écarts types à partir de données préliminaires et étaient alimentées pour détecter des différences avec un niveau de signification (α) de 0,05 et une puissance de 0,9 (1-β).