Az alfa-szinuklein egy DNS-kötő fehérje, amely modulálja a DNS-javítást, ami hatással van a Lewy-test rendellenességekre

Az emberek

Az emberi alanyok szövetét az Oregoni Alzheimer-kór Központ (ADC) és az OHSU Patológiai Tanszékén keresztül szerezték be, és az érintett alanyok megállapított klinikai és patológiai diagnózissal rendelkeztek (Lewy-testes demencia). A szövetek felhasználását az OHSU IRB jóváhagyta, és a vonatkozó irányelveknek megfelelően végezték. Minden résztvevőtől és/vagy törvényes képviselőjétől tájékozott beleegyezést kaptak.

Állatok

Az állatokat az OHSU Összehasonlító Orvostudományi Tanszékén fény-sötét ciklusban, hőmérséklet- és páratartalom-szabályozott vivariumban tartották, és ad libitum táplálék és víz mellett tartották. Az OHSU IACUC minden kísérletet jóváhagyott, minden kísérletet a vonatkozó irányelveknek és előírásoknak megfelelően végeztek, és minden erőfeszítést megtettek a felhasznált állatok számának és szenvedésének minimalizálása érdekében.

Egerek modellgenerálása

Transzgenikus egérvonalak

Az OHSU transzgenikus egérmodell magjának felhasználásával olyan egeret hoztunk létre, amely humán alfa-szinukleint expresszál, amely megerősített GFP-vel fuzionált (C-terminális tag), amely egy pontmutációt tartalmaz az 53-as alaninnál (GCA > ACA), ami egy treonin aminosavváltozást okoz (A53T Syn-GFP). Az A53T-Syn-GFP szekvenciát a MoPrp.Xho vektorba (David Borchelt ajándéka)74 klónoztuk az XhoI helyen. Az expresszió az egér prionfehérje promóterének transzkripciós kontrollja alatt áll. Az A53T Syn és a GFP közötti 30 bp linker szekvencia a GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC, ami GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr-nek fordítható. Ez az egérvonal A53T Syn-GFP expressziót mutat az agykérgi neuronok >90%-ában és az asztrociták <10%-ában (A.J.S. és V.K.U., publikálatlan adatok). A 142E Syn-GFP transzgenikus egereket32,33,39,75 és a 142E Syn-GFP/mouse mSynKO egérvonalakat a vonal létrehozóitól, Edward Rockensteintől és Eliezer Masliah-tól kaptuk. A nukleárisan lokalizált TdTomato-NLS transzgenikus egereket a Jackson Laboratories-tól szereztük be (stock# 023035). Az alfa-szinuklein kiütött állatokat és a megfelelő kontroll egereket a Jackson Laboratories-tól szereztük be (stock# 016123, 005304).

AAV8 vírus előállítása

A53T Syn-GFP víruskonstrukciókat hoztunk létre, amelyek az alfa-szinukleinben a szerin-129-nél pontmutációkat tartalmaznak, amelyek vagy alanin (TCT > GCT) vagy aszparaginsav (TCT > GAT) aminosavváltozást okoznak (a konstrukciók Pamela McLean ajándéka). Ezeket a konstrukciókat a pTRS-KS/CBh-GFP önkomplementer AAV8 vírusvektorba klónoztuk (National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, IN), a CBh (Chicken Beta Actin Short) promóter transzkripciós kontrollja alatt, az AgeI és ApaI restrikciós enzimhelyek segítségével. Az alfa-Syn & továbbfejlesztett GFP közötti 30 bp linker szekvencia GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC. A végleges scAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFP és scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP vírusokat a Massachusetts Eye and Ear Infirmary (Boston, MA) Géntranszfer Vektor Magja készítette.

Intraventrikuláris AAV8 vírusinjekciók

A P0 újszülöttekbe a szabadkézi protokoll76 szerint végeztük az injekciókat. Mindkét oldalkamrába 2 µl hígítatlan vírust fecskendeztünk ~1E12 genomiális kópia/milliliter titerrel. Az egyetlen eltérés ettől a publikált protokolltól az, hogy a vírust nem hígítottuk trypan-kékben.

Egerek Lewy-kórosodásának indukciója

2-3 hónapos hím egerekbe korábban publikált protokolljaink25 szerint injektáltunk egér WT szekvencia PFF-eket. 2,5 μl (2 mg/ml) frissen szonikázott PFF-et vagy 2,5 μl PBS-t injektáltunk a jobb félteke primer szenzomotoros kéregébe izoflurán (1-2%) altatásban lévő állatokba, majd visszahelyeztük őket a házi ketrecükbe. Az állatokat 3-6 hónapos (6-9 hónapos) injekciót követő intervallum után feláldozták és az alábbiakban leírtak szerint előkészítették az IHC vizsgálathoz.

Egerek agyának in vivo képalkotása & elemzés

A koponyaablak műtétjét és a képalkotást a korábban publikált25,39 protokoll szerint végeztük izofluránban altatott állatokon, egy Zeiss LSM 7MP multifoton mikroszkópot használtunk, amely kétcsatornás BiG (bináris GaAsP) detektorokkal és egy Coherent Technologies Chameleon titán-zafír femtoszekundumos impulzuslézerforrással volt felszerelve (860 nm-re hangolva a Syn-GFP képalkotásához). A Zeiss Zen 2011 képgyűjtő szoftvert használták. A nukleáris lézerindukált károsodási (LID) kísérletekhez a Zenben található Bleaching funkciót használtuk a magon belüli kis, szubmikron méretű régiók megvilágítására a ~730 nm-re hangolt Chameleon lézerrel <1 ms-ig). A lézer LID (~730 nm) hullámhosszra és onnan való átkapcsolásához ~4 másodperces időkésleltetés szükséges. A kísérletek egy alcsoportjában olyan állatokat hoztak létre, amelyek Syn-GFP-t és nukleárisan lokalizált TdTomato-NLS-t egyidejűleg expresszáltak. Ezek azt mutatták, hogy a LID-impulzus lokalizálása a sejt perifériájától >2 μm-re lévő régiókra mindig a sejtmagban helyezkedett el. Ezt a kritériumot használtuk a LID-impulzus in vivo Syn-GFP-t expresszáló agykérgi neuronok magjain belüli lokalizálására. Az LID-képeket az ImageJ segítségével elemeztük, hasonlóan a korábban leírt FRAP-kísérleteinkhez25,39. A magon belüli LID- és kontroll-ROI-k átlagos fluoreszcenciaértékeinek meghatározásához kiválasztottuk az érdeklődési területeket (ROI-k). Az egyes időpontokban a LID és a kontroll ROI-k jelének arányát használtuk az Enrichment Ratio kiszámításához. A LID utáni FRAP-kísérletekhez hasonló fotobleaching és elemzési protokollt alkalmaztunk, mint a korábban publikált munkáinkban25,39. Az adatokat a Prism 6 (GraphPad) programban elemeztük, hogy a helyreállítási időfolyamra, valamint az immobilis és mobilis frakciókra egyetlen exponenciális illesztést kapjunk. Minden felhasznált állat 5-9 hónapos volt.

Egerek agykérgi neurontenyészete és képalkotás

C57/BL6 egereket használtunk az embrionális egerekből izolált primer neurontenyészetek létrehozására, Kaech és Banker77 módszere alapján, valamint Gray és munkatársai78 adaptációjával. Röviden, az embriókat a vemhesség 18. napján szedtük le altatott nőstényekből. A kéregállományt felboncoltuk, óvatosan feldaraboltuk és tripszinizáltuk, hogy a szétszórt neuronok szuszpenzióit hozzuk létre. A frissen izolált agykérgi neuronokat két humán alfa-szinuklein-konstrukciót kódoló plazmiddal elektroporáltuk, amelyeket fokozott GFP-vel jelöltünk (scAAV-huSyn_s129A:EGFP, scAAV-hySyn_s129D:EGFP). Mindegyik konstrukcióból 330 000 elektroporált agykérgi neuront ültettünk ki poli-L-lizinnel bevont fedőlapokat tartalmazó tányérokra MEM táptalajban (GIBCO/Life Technologies), 5% FBS-ben (Atlanta Biologicals) és 0,6% glükózban (Sigma-Aldrich). 4 óra elteltével a tápfolyadékot eltávolítottuk, és 1 × GlutaMAX-szal (GIBCO/Life Technologies) és 1 × GS21-gyel (MTI-GlobalStem) kiegészített Neurobasal Mediummal helyettesítettük. Minden tálat hetente etettünk 0,5 ml GlutaMAX-szal és GS21-gyel kiegészített Neurobasal médiummal, az első etetés (5 nap in vitro (DIV) után) AraC-t tartalmazott. 7 DIV után az egyes konstrukciókból tenyésztett neuronok fedőlapjait zárt képalkotó kamrával ellátott élősejtes rendszerrel képeztük le. A sejtkultúrákban végzett nukleáris LID-kísérleteket ugyanazon a képalkotó platformon végeztük, ugyanazokat a képalkotási és elemzési protokollokat alkalmazva, mint a fent leírt in vivo nukleáris LID-kísérleteinket.

Egerek hippokampusztenyészete & PFF-vetés

Egerek hippokampusztenyészeteiben és PFF-vetéssel indukált Lewy-kórkép kialakítását a korábban leírt technikáink79,80 alkalmazásával végeztük. Röviden, primer neuronális kultúrákat készítettünk E16-E18 CD1 egér agyakból (Charles River). Minden eljárást a kísérleti állatok gondozására és felhasználására vonatkozó NIH útmutató szerint végeztünk, és a Pennsylvaniai Egyetem intézményi állatgondozási és -felhasználási bizottsága hagyta jóvá. A disszociált hippokampusz neuronokat poli-D-lizin bevonatú fedőlapokra (Carolina Biological Supply) telepítettük ~50 000 sejt/cm2 sűrűségben. A patogén S87N mutációt81 hordozó rekombináns humán alfa-szinuklein PFF-eket PBS-ben 0,1 mg/ml-ben hígítottuk, szonikáztuk, és neuronális médiumban hígítottuk. A neuronokat 5 ug/ml-rel kezeltük a DIV 7-ben, és 12 napig inkubáltuk. A sejteket 4%-os PFA/4%-os szacharózban fixáltuk 15 percig szobahőmérsékleten, majd 0,3%-os Tx-100-ban permeabilizáltuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten 3%-os FBS/3%-os BSA-ban blokkoltuk. Az elsődleges antitesteket (anti-α-Synuclein PhosphoSer129 81 A klón, 1:2000 hígítás, Biolegend cat#825701; Anti-foszfo-Histone H2A.X (Ser139) JBW301 klón, 1:500 hígítás, Millipore cat#05-636) a blokkoló pufferben hígítottuk és 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A fedőlapokat ezután 3-szor mostuk PBS-szel, majd a megfelelő Alexa-fluor jelölt másodlagos antitestekkel inkubáltuk. A mosott fedőlemezeket DAPI-t tartalmazó Fluoromount-G-vel (Fisher Scientific) rögzítettük tárgylemezekre.

Szekunder antitestek: Alexa 488, kecske anti egér IgG2a, 1:1000 hígítás, Fisher Scientific; Alexa 594, kecske anti egér IgG1, 1:1000 hígítás, Fisher Scientific.

A fedőlapok leképezéséhez PE lamina szkennert használtunk. A HALO szoftver (Indica Labs) segítségével megszámoltuk a γH2AX fókuszokat és a DAPI-val festett sejtmagokat, amelyek az egyes fedőlemezek szélétől 1,5 mm-re helyezkedtek el. Az adatok statisztikai elemzését a Graphpad Prism 4-es verziójával végeztük.

Immunofluoreszcencia & elemzés

HAP1 sejtek

A Hap1 szülői WT kontroll (tétel #C631 tétel 29663) és a Hap1 humán SNCA 103 bp deléció knockout (tétel #HZGHC003210c003 tétel 2) sejtvonalakat a Horizon Discovery-től szereztük be és IMDM médiában (Gibco# 11995.065) + 10% magzati szarvasmarha szérum + Pen-Strep táptalajban tenyésztettük, és 37 C-on, 5% CO2 mellett párásított inkubátorban neveltük. A sejteket egy nappal a fixálás előtt PLL bevonatú #1,5 fedőlapokra vetettük 35 mm-es tányérokba, és ~80%-os konfluenciáig növesztettük. A sejteket 4%-os PFA-ban PBS-ben 10 percig szobahőmérsékleten (RT) fixáltuk, majd 1x PBS-ben mostuk és 4 C-on PBS-ben tároltuk a festési eljárásig. A fixált sejteket 1 ml PBS + 0,25% Triton-X 100 permeabilizáltuk, 20 percig RT-n óvatosan rázva. Az oldatot eltávolítottuk, és a sejteket 1 mL blokkoló pufferben (0,1% Triton-X 100 10% normál kecskeszérum PBS-ben) 20 percig blokkoltuk. Az elsődleges antitesteket inkubációs pufferben hígítottuk (a blokkoló puffer 1:5 arányú hígítása PBS-ben), és egy éjszakán át RT-n inkubáltuk enyhe rázogatás mellett. Másnap a sejteket 3x 15 percig mostuk PBS-ben. A komplementer fluoreszcensen jelölt másodlagos antitesteket 1:1000 arányban hígítottuk az inkubációs pufferben, hozzáadtuk a sejtekhez, és egy éjszakán át RT-n, sötétben, enyhe rázással inkubáltuk. Másnap a sejteket 3x mostuk PBS-ben 20 percig. A nukleáris festést közvetlenül az utolsó PBS mosás előtt végeztük 2,5ug/mL DAPI-val (Sigma D9542) PBS-ben 20 percig. A rögzítés előtt a sejteket rövid ideig ionmentesített H2O-ban mostuk. A fedőlemezeket 13 µL CitiFluor CFMR2 antifadens oldattal szereltük fel, és Biotium CoverGrip fedőlemez tömítőanyaggal zártuk le. A tárgylemezeket Zeiss Elyra PS.1 710 lézerpásztázó konfokális mikroszkópon képeztük le Zen szoftverrel. A 0,5 µm-es lépések Z-halmazait 63x zoom1 mellett vettük fel, ügyelve arra, hogy a sejtmagon belül az antitest jele soha ne telítődjön.

A felhasznált elsődleges antitestek: anti-Syn1, 1:500 hígítás, egér monoklonális, BD Biosciences, kat. 610786; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer 10 H klón, 1:500 hígítás, csirke poliklonális, Tulip BioLabs, kat. 1023; anti-foszfo-hiszton H2A.X, 1:500 hígítás, nyúl monoklonális, Cell Signaling, kat. 9718; anti-phosphoS129-Syn EP1536Y, 1:500 hígítás, nyúl monoklonális, Abcam, ab51253; anti-phosphoS129-Syn 81 A, 1:667 hígítású egér monoklonális, Covance, kat. 825701; anti-Syn 4B12, 1:500 hígítás, egér monoklonális, Biolegend, kat. 807804; és anti-Syn EPR20535,1:100 hígítás, nyúl monoklonális, Abcam, ab212184. A másodlagos antitestek a következők voltak: Alexa Fluor 647 kecske antinyúl, ThermoFisher cat.A-21245; Alexa Fluor 555 kecske antiegér, Abcam ab150114; Alexa Fluor 488 szamár anticsirke, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.

Bleomicin kezelés ICC: Bleomicin-szulfát (Selleckchem, kat. S1214) port H2O-ban 10 mg/ml törzsoldat készítéséhez hígítottuk, aliquotáltuk és -80C-on tároltuk. A kezelés előtt egy nappal a Hap1 WT és Hap1 SNCA KO sejteket PLL bevonatú #1,5 fedőlapokra vetettük 35 mm-es csészékbe, hogy másnapra ~80%-ban konfluensek legyenek. A kezelés napján a normál médiumot eltávolítottuk, és minden tálba 2 ml friss meleg, 10ug/mL bleomycint tartalmazó médiumot adtunk. A látszólagos sejtekhez minden tálba friss meleg médiumot adtunk, Bleomicin nélkül. A sejteket párásított inkubátorba helyeztük 1 órára 37 C-on, 5% CO2 mellett. A kezelés után a médiumot eltávolítottuk, és a sejteket 4%-os PFA-ban PBS-ben 10 percig RT-n fixáltuk, majd 1x PBS-ben mostuk, és 4 C-on PBS-ben tároltuk a festési eljárásig.

Bleomicin kezelés Western Blot: Egy nappal a kezelés előtt a Hap1 WT és Hap1 SNCA KO sejteket feltételenként 2 × 10 cm-es lemezekre vetettük, hogy másnapra ~80%-ban konfluensek legyenek. A bleomicin kezelést ugyanúgy végeztük, mint az ICC esetében. A kezelés után a médiumot eltávolítottuk, és a sejteket 1x mostuk meleg PBS-szel. A sejteket tripszinizálással szedtük ki, és 15 ml-es kúpos csövekbe gyűjtöttük, 5 percig pelletáltuk 200rcf. A folyadékot leszívtuk, a pelleteket 2 ml PBS-ben reszuszpendáltuk, és 2 × 2 ml-es mikrocentrifugacsövekbe helyeztük át. A fehérjéket citoszolikus és nukleáris frakciókba extraháltuk a NE-PER extrakciós készlet (Thermo-Fisher, kat. 78833) segítségével a gyártó ajánlásainak megfelelően, az első nukleáris reszuszpenziós lépés után rövid szonifikációval (10 másodperc, 10 kHz). A fehérje prepeket -80C-on tároltuk a Western blot elemzésig.

A konfokális képalkotáshoz a képeket egy Zeiss Elyra PS.1 konfokális mikroszkópon készítettük Plan-Apochromat 63x/1,40 olaj objektívvel. Minden kolokalizációs elemzést az ImageJ (NIH) szoftverrel végeztünk úgy, hogy minden egyes sejtmaghoz ROI-t hoztunk létre egyetlen képből, amely a sejtmag közepén helyezkedik el a z irányban. A CoLoc 2 plugint használtuk a Pearson-koefficiens mérésére a jelek és a várható háttérérték között az egyik csatorna véletlenszerű transzlációja után a másikhoz képest.

Egerek agya

A hím egér agyát (3-6 hónapos korúak) közvetlenül a halál után boncoltuk, 6 ml friss 4%-os PFA-ba helyeztük PBS-ben, és Pelco Biowave Pro készülékkel 90 percig 150 W-on, keringető vízfürdőben rögzítettük. Az agyakat 4 °C-ra vittük, hogy egy éjszakán át fixálódjanak. Másnap a PFA-t 0,05%-os nátrium-aziddal helyettesítettük, és a további feldolgozásig 4 °C-on tároltuk.

A rögzítést követően az agyakat 50 µm-es koronális vagy sagittális lebegő metszetekre vágtuk egy Vibratome Leica VT1000S segítségével. Bizonyos antitestek esetében a blokkolás előtt hőindukált epitóp-visszanyerésre (HIER) volt szükség. Az agyszeletet egy HIER-puffert (1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0,05% Tween, pH = 8.5), 20 percig párolták, majd 20 percig szobahőmérsékleten hűtötték. A szövetet 1 órán át blokkoltuk blokkoló pufferben (0,1% Triton-X, 10% kecskeszérum, PBS-ben). Az elsődleges ellenanyagot inkubációs pufferben (blokkoló puffer 1:5 arányú hígítása) hígítottuk az egyes ellenanyagokhoz optimalizált koncentrációban, és egy éjszakán át, sötétben, szobahőmérsékleten rázva inkubáltuk. A szövetet 30 percig ötször mostuk PBS-szel. A komplementer másodlagos ellenanyagot inkubációs pufferben hígítottuk és hasonlóan inkubáltuk egy éjszakán át szobahőmérsékleten. Másnap a szövetet 5 csere PBS-szel mostuk. A DAPI festést közvetlenül az utolsó mosás előtt végeztük el. A szövetet a CitiFluor CFMR2 antifoszfor oldatban egy tárgylemezre szereltük. Egy #1,5-es fedőlemezt Biotium CoverGrip fedőlemez tömítőanyaggal zártunk a szövet fölé.

A felhasznált elsődleges antitestek a következők voltak: anti-α-Synuclein Phospho (Ser129) antitest 81 A klón, egér monoklonális, 1:667 hígítás, Biolegend cat#825701; Anti-alfa Synuclein (phospho S129) antitest , nyúl monoklonális, 1:500 hígítás, Abcam cat#ab51253; Anti-asyn (Syn1/mSyn), egér monoklonális, 1:500 hígítás, BD Biosciences cat#610786; Anti-pan-ADP-ribóz kötő reagens, nyúl, 1:1000 hígítás, Millipore cat#MABE1016; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, 10 H klón (PADPR), csirke, 1:100 hígítás, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-foszfo-Histone H2A.X (Ser139) antitest JBW301 klón, egér, 1:500 hígítás, Millipore cat#05-636; Anti-foszfo-Histone H2A.X (Ser139) antitest 20E3 klón, nyúl monoklonális, 1:500 hígítás, Cell Signaling cat#9718 Másodlagos antitesteket használtunk: Alexa 647, kecske antinyúl, 1:1000 hígítás, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, kecske antiegér, 1:1000 hígítás, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, kecske antinyúl, 1:1000 hígítás, Abcam cat#ab150078; Alexa 555, kecske anti-mouse, 1:1000 hígítás, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, kecske anti-chicken, 1:1000 hígítás, Abcam cat# ab150169.

A konfokális képalkotáshoz a képeket egy Zeiss Elyra PS.1 Plan-Apochromat 63x/1,40-es olajobjektívvel felszerelt konfokális mikroszkóppal készítettük. Az 1-5%-os lézerteljesítményeket használtuk, hogy szövetszelvényenként 2-4 kéregrégión keresztül z-halmokat készítsünk. Az IHC-adatok elemzéséhez Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) képalkotó szoftvert használtunk. A sejtmag és a citoplazma elkülönítése érdekében a DAPI-csatorna segítségével felületet hoztunk létre. Csak a teljes neuronmagokat elemeztük. Az egyes csatornákra vonatkozó statisztikai információkat (átlagos intenzitás, intenzitás összege, felületek száma összesen) exportáltuk és a Prism 6 (GraphPad) programban tovább elemeztük. A sejtmagokon belüli fókuszok elemzéséhez a választott csatorna nukleáris jelét a DAPI-csatornából létrehozott nukleáris felülettel maszkoltuk. A kívánt maszkolt csatorna nukleáris jeléből felületek készültek a nukleáris fókuszok számszerűsítéséhez.

Emberi agy

Az emberi Dementia with Lewy Body boncolási esetek amygdalájából származó metszeteket közvetlenül a boncoláskor vettük ki (a halál utáni intervallum 12-48 óra), 6 ml friss 4%-os PFA-ba helyeztük PBS-ben, és Pelco Biowave Pro készülékkel 90 percig 150 W-on, keringtetett vízfürdőben fixáltuk. A metszeteket 4 °C-ra vittük, hogy egy éjszakán át fixálódjanak. Másnap a PFA-t 0,05%-os nátrium-aziddal helyettesítettük, és a további feldolgozásig 4 °C-on tároltuk.

A fixálás után az amygdala metszeteket 50 µm-es lebegő metszetekre vágtuk egy Vibratome Leica VT1000S segítségével. A szöveteket 1 órán át blokkoltuk blokkoló pufferben (0,1% Triton-X, 10% kecskeszérum, PBS-ben). Az elsődleges antitestet inkubációs pufferben (blokkoló puffer 1:5 arányú hígítása) hígítottuk az egyes antitestekhez optimalizált koncentrációban (lásd alább), és egy éjszakán át, sötétben, szobahőmérsékleten rázva inkubáltuk. A szövetet 60 percig ötször mostuk PBS-szel. A komplementer másodlagos ellenanyagot inkubációs pufferben hígítottuk, és ugyanígy inkubáltuk egy éjszakán át szobahőmérsékleten. Másnap a szövetet 5 csere PBS-szel mostuk. A DAPI festést közvetlenül az utolsó mosás előtt végeztük el. A szövetet a CitiFluor CFMR2 antifoszforáló oldatban egy tárgylemezre szereltük. Egy #1,5-es fedőlapot zártunk a szövet fölé Biotium CoverGrip Coverslip Sealant-tal.

A felhasznált elsődleges antitestek a következők voltak: anti-α-Synuclein Phospho (Ser129) antitest 81 A klón, egér monoklonális, 1:667 hígítás, Biolegend cat#825701; Anti-foszfo-Histone H2A.X (Ser139) antitest 20E3 klón, nyúl monoklonális, 1:500 hígítás, Cell Signaling cat#9718. A másodlagos antitestek a következők voltak: Alexa 647, kecske anti-egér, 1:1000 hígítás, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, kecske anti-nyúl, 1:1000 hígítás, Abcam cat#ab150077.

A képeket Zeiss LSM 880 Airyscan mikroszkóppal készítettük. A humán szövetmintákon belüli megnövekedett autofluoreszcens háttérfestésből származó specifikus antitestjelek meghatározásához lineáris keverésmentesítő protokollt alkalmaztunk. Lambda üzemmódban állítottuk be az objektív, a lézerek és a dichroikusok paramétereit a többszínű minta leképezéséhez szükséges módon. Ugyanezen paraméterek használatával egyedi referenciaspektrumokat hoztak létre egyszínű festett mintákból. Ezenkívül egy festetlen mintát is használtak a háttér-referenciaspektrumok meghatározásához. A referenciaspektrumok létrehozásakor minden maradékot minimalizáltunk. Ezután a többszínű mintát a Zeiss Zen szoftverrel képileg leképeztük, megadva a releváns háttér- és egyszínű spektrumokat, majd a Zeiss Zen szoftverrel kikevertük.

Az IHC-adatok elemzéséhez az Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) képalkotó szoftvert használtuk. A sejtmagnak a citoplazmától való elkülönítése érdekében a DAPI-csatorna segítségével egy felületet hoztunk létre. Csak a teljes neuronmagokat elemeztük. Az egyes csatornákra vonatkozó statisztikai információkat (átlagos intenzitás, intenzitás összege, felületek száma összesen) exportáltuk és a Prism 6 (GraphPad) programban tovább elemeztük. A sejtmagokon belüli fókuszok elemzéséhez a választott csatorna nukleáris jelét a DAPI-csatornából létrehozott nukleáris felülettel maszkoltuk. A kívánt maszkolt csatorna nukleáris jeléből felületek készültek a nukleáris fókuszok számszerűsítéséhez.

HAP1 sejt comet assay

A HAP1 sejt semleges comet assay-t a Trevigen ajánlásai szerint végeztük (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). A Comet LMAgarózzal (Trevigen) 1:2 arányban kevert, szérummentes IMDM-ben (Sigma) lévő sejtszuszpenziókat (2 × 104 sejt/ml) CometSlidesTM-re (Trevigen) pipettáztuk, és 4 °C-on 10-15 percig tartottuk öntésre. A tárgylemezeket egy éjszakán át lízisoldatban (Trevigen) inkubáltuk 4 °C-on sötétben, majd semleges elektroforézis pufferben (300 mM nátrium-acetát, 100 mM Tris-HCl, pH 9) 1 órán át 4 °C-on sötétben. A tárgylemezeket friss pufferben 40 percig elektroforizáltuk 20 V-on (1 V/cm) 4 °C-on. Az elektroforézist követően a tárgylemezeket először DNS-precipitációs pufferben (1 M ammónium-acetát, 86,6% EtOH), majd 70%-os EtOH-ban inkubáltuk szobahőmérsékleten, sötétben, egyenként 30 percig, majd 37 °C-on szárítottuk. A tárgylemezeket 1X SYBRTMgreen (Invirogen) 1X PBS-ben (Gibco) lévő 1X SYBRTMgreennel festettük meg szobahőmérsékleten, 30 percig sötétben, majd 10 alkalommal dH2O-ban mártottuk a felesleges festék kimosásához, és 37 °C-on szárítottuk. A Comet-eket 10X objektívvel Zeiss Apotome készülékkel vizualizáltuk és a CometScoreTM segítségével pontoztuk.

Bleomicin kezeléssel végzett Comet Assay: A kezelés előtt egy nappal a Hap1 WT és Hap1 SNCA KO sejteket feltételenként 2 × 35 mm-es lemezekre vetettük, hogy másnapra ~80%-ban konfluensek legyenek. A bleomicin és Sham kezelési protokollokat ugyanúgy végeztük, mint az ICC esetében. A kezelés után a médiumot eltávolítottuk, és a sejteket 1x mostuk meleg PBS-szel. Ha regenerálódási időszak következett, akkor friss meleg médiumot adtunk hozzá, és a sejteket visszahelyeztük az inkubátorba. A sejteket 0,05%-os tripsin-EDTA-val (Gibco cat. 15400-54) végzett tripszinizálással szedtük ki. A 2 × 35 mm-es lemezekről származó tripszinált sejteket 15 ml-es kúpos csövekbe gyűjtöttük, és 5 percig 200rcf-en pelletáltuk. A folyadékot leszívtuk, a pelleteket 250 ml friss, FBS vagy Penn-Strep nélküli médiumban reszuszpendáltuk, 2 ml-es mikrocentrifugacsőbe helyeztük, és a fent leírt Comet Assayben való felhasználásig jégen tároltuk.

Egerek agyszöveti comet assay

Hím egerek (1, 3, 6-9 hónapos korúak) frissen kivont agyszövetét borotvapengével finomra vágtuk, jéghideg PBS-ben (Ca2+ és Mg2+ nélkül) szuszpendáltuk és kézi homogenizátorral 30 másodpercig homogenizáltuk. A szövetet egy percig mikrocentrifugáltuk, és a felülúszót 1:10 arányban PBS-ben hígítottuk. A sejteket hemocitométerrel megszámoltuk és 1 × 105/ml-re hígítottuk. A hígított sejteket alacsony olvadású (LM) agarózzal 1:2 (v/v) arányban egyesítettük, és szétterítettük az üveg üvegtálcán (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). A tárgylemezeket sötétben, 4 °C-on 15 percig szárítottuk, majd a kit lízisoldatába helyeztük 4 °C-on egy éjszakára. A felesleges puffert lecsurgattuk a tárgylemezekről, mielőtt 30 percre 4 °C-on 50 ml TBE-be (pH 7,4) merítettük. A tárgylemezeket TBE-ben, pH 7,4, 20 V-on 40 percig 4 °C-on elektroforézisnek vetettük alá. A felesleges TBE-t leengedtük, és a tárgylemezeket kétszer 5 percre dH2O-ba helyeztük. Ezután a tárgylemezeket 5 percre 70%-os EtOH-ba helyeztük, majd 37 °C-on 15 percig szárítottuk. 100 µl 1X SYBR-zöldet pipettáztunk a szárított agaróz minden egyes körére, és a mintákat 30 percig sötétben, szobahőmérsékleten festettük. A felesleges SYBR-zöld oldatot eltávolítottuk, és a tárgylemezeket többször átöblítettük dH2O-ban. A tárgylemezeket 37 °C-on hagytuk teljesen megszáradni, majd 4 °C-on tároltuk. A Comet-eket Zeiss ApoTome mikroszkópon 10X objektív alatt vizualizáltuk és a CometScore™ szoftver (TriTek) segítségével pontoztuk.

Elektroforetikus mobilitási eltolódás vizsgálat

DNS előkészítés

A 100 bp-s létráról (NEB) 300 bp-s fragmentumokat extraháltunk, amelyeket 1%-os agaróz gélen, 175 V-on 2 órán keresztül, RT-n a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) segítségével elválasztottunk. A DNS-t a DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research) segítségével tisztítottuk, majd 1X TE-ben eluáltuk. A végső koncentrációt és a DNS tisztaságát Nanodrop segítségével határoztuk meg.

Elektroforetikus mobilitási eltolódás vizsgálat

A DNS fragmentumokat (20 ng) rekombináns hu_ser129_phospho-syn (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg és 16 µg; Proteos, Inc.), rekombináns hu_α-szinuklein (250 ng, 1 µg, 1 µg, 4 µg, 8 µg és 16 µg; Proteos, Inc.) vagy rekombináns glutation S-transzferáz (250 ng, 1 µg, 1 µg, 4 µg, 8 µg és 16 µg; GenScript) 20 μL reakcióban, amely 94 mM Tris-Cl, pH 8,0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA és 5% ficoll-t tartalmaz, 20 percig jégen, majd 30 percig szobahőmérsékleten. 2 µL 10X narancssárga töltőpuffer (Licor) hozzáadása után 8 μL teljes reakciót töltöttünk 10%-os vagy 6%-os poliakrilamid TBE gélbe (Novex), és 100 V-on futtattuk 2 órán keresztül RT-n. A géleket 30 percig festettük 10X SYBRTM Safe DNS-festékkel (Invitrogen) 1X TBE-ben 30 percig. A képeket a Fluorchem M képalkotó rendszerrel készítettük és az ImageJ Gel Analyzing eszközzel számszerűsítettük.

Western blot

A 10 %-os poliakrilamid TBE géleket Biodyne™ B nejlonmembránra (Thermofisher Scientific) vittük át 30 V-on 1 óra és 16 percig jégen 0,5X TBE-ben a Novex XCell II Blotting System (Invitrogen) segítségével. A membránokat egy éjszakán át Odyssey PBS blokkoló pufferben (Li-Cor) blokkoltuk, majd 1 órán át RT-n Syn1 (1:1 000; Biolegend) és egy éjszakán át 4 °C-on IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG-vel (1:10 000; Li-Cor) festettük. A képeket a Li-Cor Odyssey CLx Imaging System segítségével készítettük.

Western Blot a Hap1 nukleáris fehérje preparátumokra: A Hap1 NE-PER citoplazmatikus és nukleáris fehérje prepek koncentrációját a Pierce BCA Protein Assay kit (Pierce, kat. 23225) segítségével számszerűsítettük, és egy 550 nm-es leolvasással rendelkező Multiskan FC Microplate Photometerrel (Fisher, kat. 51119000) olvastuk le. 5 µg & 10 µg nukleáris fehérjét SDS mintapufferben (Novex, kat. LC2676) + BME (Gibco, kat. 21985-023) hígítottunk és 10-20%-os Tris-Glicin gélre (Novex, kat. XP10202BOX) töltöttük. Referenciaként 3 µl színes előfestett fehérje létrát (NEB, kat. P7719) töltöttünk be. A gélt a Novex Xcell Blotting System segítségével SDS futópufferben (Novex, kat. LC2675) 70 percig futtattuk 120 V-on. A gélt szétbontottuk és előkészítettük az Immobilon-FL PVDF membránra (Millipore, kat. IPF00010) történő átvitelhez. A gélt Tris-Glicin transzferpufferben (Novex, kat. LC3675), 25 V-on, jégen 2 órán keresztül vittük át. A transzfer után a membránt eltávolítottuk, és azonnal 4%-os PFA + 0,01%-os glutaraldehidben fixáltuk 10 percig, enyhe rázogatás mellett, RT-nél. A membránt 1x mostuk milliQ H2O-ban, majd a REVERT total protein stain kit (LI-COR, kat. 926-11010) segítségével festettük meg a gyártó protokollja szerint. Az összes festett fehérjét a LI-COR Odyssey CLx Imager készülékkel vettük fel. A REVERT festés visszafordítása után a membránt 1x mostuk milliQ H2O-ban, majd egy éjszakán át Odyssey blokkoló pufferben (LI-COR, kat. 927-40000) blokkoltuk 4 C-on, enyhe rázás mellett. Az elsődleges antitesteket 1:1000 arányban hígítottuk blokkoló pufferben, és 2 órán át inkubáltuk RT-n, enyhe rázással. A membránt 3x mostuk 0,1%-os Tween20-ban PBS-ben 10 percig. A másodlagos antitesteket (LI-COR IR680LT szamár antinyúl kat. 926-68023; IR800CW szamár anti-egér kat. 926-32212) 1:10000 arányban hígítottuk blokkoló pufferben, és 1 órán át inkubáltuk RT-n, enyhe rázás mellett. A membránt 3x mostuk 0,1%-os Tween20-ban PBS-ben 10 percig és 1x PBS-ben 10 percig, RT-nél. A képeket a LI-COR Odyssey CLx Imager készülékkel készítettük. Az elemzést a FIJI gélanalizátor segítségével végeztük. Az antitest jelét a REVERT teljes fehérjéhez normalizáltuk.

T4 ligáz által közvetített DNS végillesztési vizsgálat

Minden végillesztési reakció 150 ng 1,2 kb DNS PCR terméket tartalmaz, amelyet az 5′ és 3′ végén XhoI (NEB RO146S) kohéziós végű restrikciós enzimmel emésztettünk. A reakciókat 20 µl reakciótérfogatban végezzük, amely tartalmaz 150 ng emésztett DNS-t, 2,8 µl fehérjepuffert (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µl 20% glicerint PBS + Mg + Ca-ban, 2 µl T4 ligáz puffert, 200 ng vagy 40,5 ng fehérjét, 25U T4 ligázt (NEB M0202) és steril H2O-t térfogatig. A T4 ligáz kivételével minden komponenst egyesítettünk, és 15 percig jégen inkubáltuk. 25U T4 ligázt adtunk a reakcióhoz, és 90 percig RT-n inkubáltuk. Az inkubáció után a reakciót azonnal megtisztítottuk egy Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 oszlopon (Zymo Research), és 15 µl steril H2O-ban eluáltuk. A DNS-hez SybrGreen és töltőpuffert adtunk, majd a mintákat 1%-os agaróz TAE gélben 1 órán keresztül 135 V-on elektroforizáltuk, és Syngene G:BOX kemilumineszcens és fluoreszcens imagerrel képet készítettünk. A gélkép elemzéséhez az ImageJ-t használtuk, az adatokat pedig a Prism 6 (GraphPad) segítségével ábrázoltuk.

Kísérleti terv & statisztikai elemzés

Minden számszerűsített értéket átlag ± SEM-ben adunk meg. A vonatkozó mintatípus és -szám (N), valamint a szignifikancia értékeléséhez használt statisztikai tesztek minden egyes kísérlet esetében az egyes adatsoroknál szerepelnek. Az egyes kísérletekben használt mintanagyságok a várható hatásméretek (~10-50%) és az előzetes adatokból származó standard eltérések becslésein alapultak, és 0,05 szignifikancia (α) szint és 0,9 teljesítmény (1-β) mellett a különbségek kimutatására szolgáltak.