Winthrop egyik legmaradandóbb hozzájárulása a Massachusetts-öböl gyarmatához az volt, hogy erősen támaszkodott a vallásra. Még az Arbella fedélzetén Winthrop és a többi alapító lefektették az új gyarmattal kapcsolatos vallási reményeiket az “A keresztény szeretet modellje” című dokumentumban. Ebben leírta, hogy a puritánok hogyan maradjanak tiszták, hogy Isten továbbra is megáldja a telepeseket, míg ők arra várnak, hogy visszatérjenek, és megmentsék Angliát az örök pokol tüzétől. Elutasította az anglikán egyházat, annak hierarchiáját és szertartásait. Azonban egy vékony határvonalon mozogtak, mivel a király visszavonta volna a chartát, ha rájön, hogy megtagadták az anglikán hitet.
Az új gyarmat szentségének megőrzése érdekében a fegyelem lett az egyik legnagyobb kérdés a vallási csoporton belül, amelynek nagy része családi szinten zajlott. Valójában a családi fegyelem olyan fontos lett, hogy a kolónia megtiltotta, hogy bárki egyedül éljen, és az egyedülálló férfiaknak és nőknek más családokkal kellett összeköltözniük.Azok az ügyek, amelyek túl nagyok voltak ahhoz, hogy egy család ellenőrizze őket – amelyek az egész közösséget érintették -, a Törvényszék elé kerültek, hogy az istenfélő kolónia az ördög befolyásától szenvedett. Winthrop gondosan feljegyezte naplójában a gyarmattársai vétkeit. A megtorlás mindig gyors és kemény volt. Az egyik legbizarrabb esetben például George Spencert kivégezték, miután az egyik disznója egy emberre hasonlító malacot nemzett. Az új gyarmat “szentjei” könnyűnek találták, hogy kemény ítéletet hozzanak a közöttük lévő bűnösök ellen, mivel tudták, hogy Isten ítélete ugyanolyan gyors lesz. Ha Angliában a templom és Isten a mindennapi élet része volt, a telepesek az Újvilágban szándékosan az egész életük részévé tették.
Az első massachusettsi templomot, a salemi kongregációs templomot egy évvel Winthrop csapatának megérkezése előtt alapították. 1635-re már több mint egy tucatnyi templom volt szétszórva a területen. A gyülekezethez való csatlakozás szigorú volt, mivel a tagoknak be kellett jelentkezniük a lelkésznél, és meg kellett magyarázniuk megtérésüket. Winthrop azonban úgy vélte, hogy a legtöbb ember, aki az Újvilágba utazott, már bizonyította Isten iránti elkötelezettségét azzal, hogy tiszta környezetet keresett.
A puritán hit erősen hitt az egyén erejében, és elkerülték az olyan bevett egyházak hierarchiáját, mint az anglikán egyház és a római katolikus egyház.Az egyik probléma ezzel a hittel azonban az volt, hogy a puritán egyház nem rendelkezett konkrét ortodoxiával vagy ellenőrzéssel az egyes egyházak tanításai felett – ez a felügyelet több súlyos válságot okozott az új gyarmat számára.
1631-ben George Phillips, a watertowni templom lelkésze azt kezdte tanítani a gyülekezetének, hogy mind az anglikán, mind a katolikus egyház “igaz” egyház – az ellenkezőjét annak, amit a puritán hit vallott, vagyis hogy mindkettő túl romlott Isten számára. Winthrop Watertownba utazott, hogy a gyülekezet előtt vitatkozzon a lelkésszel. Az este végén három kivételével a gyülekezet minden tagja elismerte, hogy Phillips tanításai és az ő hitük tévedésben volt.
Egy komolyabb válságban egy Roger Williams nevű, jó beszédű és bájos prédikátor volt érintett. A vallási szeparatistákat vonzó gyarmat megalakításával az volt a probléma, hogy ezek gyakran nem féltek kiállni a kormány és az egyház bevett álláspontjai ellen, még egy olyan szeparatista egyház ellen sem, mint maga a puritán egyház.Williams a legkorábbi napok óta részt vett a Massachusetts-öböl projektben, még az első, 1629-es gyűlésen is részt vett. Amikor Williams az első tél közepén külföldre, Lyonba érkezett, Winthrop üdvözölte az “istenfélő lelkész” érkezését. Ezután Williams meghívást kapott, hogy legyen a bostoni egyház lelkésze, de visszautasította, mivel úgy vélte, hogy a bostoni egyház túlságosan tisztátalan számára, mivel az egyházban nem mindenki ítélte el az anglikán egyházat.Winthrop élesen bírálta Williamst, tévesnek nevezte a véleményét, és utalt arra, hogy hatalmát felhasználva megakadályozza, hogy az egyház tárgyalásokat folytasson Williams megszerzéséről. Williams elutazott Salembe, de nem azelőtt, hogy megfenyegette volna, hogy Winthrop polgári hatósága nem avatkozhat be egyházi ügyekbe. A John Endecott által vezetett salemi egyház tárt karokkal fogadta őt, mígnem Winthrop azt írta Endecottnak, hogy “csodálkozik”, hogy a város ilyen veszélyes lelkészt fogad. Williams végül Plymouthban telepedett le, Winthrop befolyási körén kívül. 1633-ban John Bradford, Plymouth kormányzója megjegyezte, hogy William “furcsa nézeteket” kezdett kifejteni és gyakorolni, ami végül azt eredményezte, hogy a prédikátor elhagyta az egyházat. Panasza az volt, hogy amikor a plymouthi polgárok visszatértek Angliába, részt vettek az anglikán istentiszteleteken, és ezzel megfertőzték a plymouthi egyházat visszatérésük után. Williams visszatért Salembe, ahol az emberek kinevezték őt a lelkész segédjévé, és azonnal nekilátott a salemi egyház megtisztításának.
Winthrop és más gyarmati vezetők kérdőre kezdték őt egy Plymouthban tett kijelentése miatt, amely azt tanúsította, hogy a telepeseknek nincs joguk az általuk elfoglalt földhöz. Williams azt állította, hogy a király “ünnepélyes közhazugsággal” kormányzott, és nincs joga földet adni a gyarmatnak. Az általános bíróság azonnal elrendelte, hogy Williams jelenjen meg a következő ülésen, hogy elmarasztalják.Winthrop megpróbálta minimalizálni a szembesítést, és írt Williamsnek, rámutatva arra, hogy miként pontosíthatná a bíróság előtt tett kijelentéseit.Williams a bíróság számára kielégítően viselkedett, és az incidensről nem esett több szó.
1634 novemberében azonban, hat hónappal azután, hogy Winthropot eltávolították a kormányzói posztjáról, a bírósághoz eljutott a hír, hogy Williams ismét önkéntesen kezdte hangoztatni a nézeteit. Azt mondta a telepeseknek, hogy az alapítólevelet át kell írni, különben az egész kolóniát fel kell oszlatni, hogy “megtisztítsák”. Amikor az általános bíróság visszahívta Williamst, a terület lelkészei inkább azt kérték, hogy négyszemközt adjanak tanácsot a vétkesnek – így akadályozva meg, hogy Williams egy megfogalmazott levelet küldjön a királynak, amelyben hazugsággal vádolta őt. A következő évben Williamst újra és újra beidézték, hogy megjelenjen a bíróság előtt, miután minden alkalommal megsértette a puritánok erkölcseit. A büntetés azonban kevés hatással volt a gyülekezetére, és 1635 tavaszán a salemi egyház kinevezte őt teljes jogú lelkésznek.
A Törvényszék és más lelkészek hevesen reagáltak.Míg az egyházak nem tudtak fellépni Salem ellen, hogy megakadályozzák Williams tanításait, a polgári kormánynak nem voltak ilyen aggályai.Salem több földet kért egy közeli félszigeten, és a Törvényszék bejelentette, hogy a város csak akkor kaphat földet, ha eltávolítja Williamst az állásából – ez a lépés feldühítette Salem lakóit. A környék más egyházaihoz fordultak segítségért, de kérésük süket fülekre talált. Miközben a bíróság Salem ellen harcolt, az egész kolónia összeomolhatott volna, ha Williams betegség miatt nem zárkózik be a házába; csak levelek útján tudott kommunikálni, és így mind Salem, mind a bíróság számára elveszett a varázsa. Arra kérte Salem népét, hogy mondjanak le minden más egyházról, és nyilvánítsák magukat az egyetlen “igaz” egyháznak – ez veszélyes és elszigetelő lépés volt. Salem ellenállt.
A végső konfrontációban az általános bíróság 1635 októberében megjelenésre hívta Williamst, ahol felszólította, hogy hat héten belül hagyja el a kolóniát. Később a határidőt a következő tavaszig meghosszabbította, de 1636 januárjában Williams egy csapat követővel együtt elhagyta a Massachusetts-öblöt, és a közeli Rhode Island Narragansett-öböl felé vette az irányt.
Előre a puritán egyház és a hitük biztonságban volt. Winthrop ügyesen kezelte az új gyarmat előtt álló legnagyobb válságot, és ismét megmentette azt a lehetséges pusztulástól.