ヒト
ヒト被験者組織はオレゴン・アルツハイマー病センター（ADC）とOHSU病理部を通じて調達し、患部の臨床・病理診断（レビー小体型認知症）が確立されているものを使用しました。 組織使用はOHSUのIRBによって承認され、関連ガイドラインに従って実施された。
動物
動物はOHSUの比較医学部門により、明暗周期と温度・湿度が管理されたビバリウムに収容され、自由食と水食の下で維持された。 すべての実験はOHSU IACUCの承認を受け、関連するガイドラインや規則に従って行われ、使用する動物の数とその苦痛を最小限にするためにあらゆる努力がなされた。
マウスモデル作製
トランスジェニックマウス系統
OHSUトランスジェニックマウスモデルコアを利用し、アラニン53の点変異（GCA > ACA）を含む強化GFP（C端タグ）に融合したヒトαシヌクレイン発現マウス（A53T Syn-GFP）作成、スレオニンアミノ酸変化を起こしたものを使用しました。 A53T-Syn-GFP配列をMoPrp.Xhoベクター（David Borcheltの贈り物）74にXhoI部位でクローン化した。 発現は、マウスプリオンタンパク質プロモーターの転写制御下にある。 A53T SynとGFPの間の30bpのリンカー配列はGGTACCGCGGCCCGGATCCATCGCCACCで、これはGlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThrに翻訳される。 このマウスラインは、皮質ニューロンの><10% においてA53T Syn-GFP発現を示す（A.J.S. and V.K.U., unublished data）。 142E Syn-GFPトランスジェニックマウス32,33,39,75および142E Syn-GFP/マウスmSynKOマウスラインは、ラインのクリエイター、Edward RockensteinおよびEliezer Masliahから入手した。 核局在 TdTomato-NLS トランスジェニックマウスは Jackson Laboratories から入手した (stock# 023035)。 αシヌクレインノックアウト動物および適切なコントロールマウスはJackson Laboratoriesから入手した（ストック# 016123, 005304）。
AAV8ウイルス作製
我々は、アラニン（TCT > GCT）またはアスパラギン酸（TCT > GAT）のいずれかのアミノ酸変化を引き起こすセリン129におけるアルファシヌクレインの点突然変異を含むA53T Syn-GFPのウイルス構築物を作った（Pamela McLeanの贈り物による構成物）。 これらのコンストラクトを、制限酵素部位AgeIおよびApaIを用いて、CBh（Chicken Beta Actin Short）プロモーターの転写制御下で、自己相補的AAV8ウイルスベクターpTRS-KS／CBh-GFP（National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, INから）にクローニングした。 α-Syn & enhanced GFP間の30bpリンカー配列はGGTACCGCGGCCCGGATCCATCGCCACCである。 最終的なscAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFPおよびscAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFPウイルスは、マサチューセッツ眼科耳科病院、ボストンの遺伝子導入ベクターコアで作られた。
脳室内AAV8ウイルス注射
P0新生児へのICVはフリーハンドプロトコル76に従って行われた。 我々は、各側脳室に2μLの原液ウイルスを、力価〜1E12ゲノムコピー／ミリリットルで注入した。 この公表されたプロトコルからの唯一の逸脱は、ウイルスをトリパンブルーで希釈しなかったことである。
マウスレビー病理誘導
2〜3ヶ月齢の雄マウスに、我々の以前に公表したプロトコル25に従って、マウスWT配列PFFを注射した。 2.5μl（2mg/ml）の新鮮な超音波処理したPFFまたは2.5μlのPBSを、イソフルラン（1％〜2％）で麻酔した動物の右半球一次感覚-運動野に注射し、ホームケージに戻した。 3-6ヶ月後（6-9ヶ月齢）に屠殺し、後述するIHCの準備を行った。
マウス脳in vivoイメージング & analysis
頭蓋窓手術およびイメージングを、我々が以前に発表したのと同じプロトコル25，39を用いてイソフルラン麻酔の動物で実施した。 Zeiss LSM 7MP多光子顕微鏡にデュアルチャンネルBiG（バイナリーGaAsP）検出器とCoherent Technologies Chameleonチタンサファイアフェムト秒パルスレーザー光源（Syn-GFPイメージング用に860nmにチューニング）を装着して使用した。 Zeiss Zen 2011画像取得ソフトウェアが使用された。 核レーザー誘起損傷（LID）実験では、ZenのBleaching機能を用いて、730nmにチューニングしたChameleonレーザーで核内の小さなサブミクロンサイズの領域を<1ms) 照射した。 LID (~730 nm)波長へのレーザーの切り替えには、4秒程度の時間的な遅れが必要です。 実験のサブセットでは、核局在化TdTomato-NLSと同時にSyn-GFPを発現する動物が生成された。 その結果、LIDパルスを細胞周辺から>2 μmの領域に局在させると、常に核内に配置されることが示された。 この基準を用いて、in vivoでSyn-GFPを発現する皮質ニューロンの核内にLIDパルスを局在させることができた。 LID画像は、以前に説明したFRAP実験25,39と同様に、ImageJで解析した。 関心領域（ROI）は、核内のLIDとコントロールのROIで平均蛍光値を得るために選択された。 LIDとコントロールのROIの各時点でのシグナルの比率をEnrichment Ratioの算出に用いた。 LID後のFRAP実験では、我々の既報25,39と同様のフォトブリーチングと解析プロトコルを使用した。 データはPrism 6 (GraphPad) で解析し、回復時間経過と不動画分および可動画分に対する単指数フィットを得た。 使用した動物はすべて5～9ヶ月齢である。
マウス皮質ニューロン培養とイメージング
C57/BL6マウスを用いて、Kaech and Banker77の方法に基づいて、Grayら78から適応した胚性マウスから分離した神経細胞初代培養物を作成した。 簡単に言うと、胚は麻酔した雌から妊娠18日目に採取された。 皮質を剥離し，静かにミンチにしてトリプシン処理し，分散したニューロンの懸濁液を作製した． 新鮮な皮質ニューロンを、強化GFPでタグ付けされた2つのヒトα-シヌクレイン構築物をコードするプラスミドで電気穿孔した（scAAV-huSyn_s129A：EGFP、 scAAV-hySyn_s129D：EGFP ）。 各コンストラクトから33万個の電気穿孔した皮質ニューロンを、MEM培地（GIBCO/Life Technologies）、5% FBS（Atlanta Biologicals）、および0.6% グルコース（Sigma-Aldrich）中のポリL-リジンコーティングしたカバーリップを含む皿にプレーティングした。 4時間後、培地を除去し、1×GlutaMAX（GIBCO/Life Technologies）および1×GS21（MTI-GlobalStem）を添加したNeurobasal Mediumに置き換えた。 各ディッシュに0.5 mlのNeurobasal培地とGlutaMAXおよびGS21を1週間ごとに供給し、最初の供給（in vitro 5日目（DIV））にはAraCを含有させた。 7 DIV後、各コンストラクトの培養神経細胞のカバースリップを、密閉式イメージングチャンバーを備えたライブセルシステムを使用してイメージングした。 細胞培養核LID実験は、上記のin vivo核LID実験と同じイメージングおよび分析のための同じプロトコルを使用して、同じイメージングプラットフォーム上で実施された。
マウス海馬培養& PFF播種
マウス海馬培養およびPFF播種によるレビー病理形成は、以前に記載した技術79、80を用いて実施された。 簡単に言うと、神経細胞の初代培養は、E16-E18 CD1マウス脳（Charles River）から調製された。 すべての手順は、NIH Guide for the Care and Use of Experimental Animals に従って行われ、ペンシルバニア大学の Institutional Animal Care and Use Committee によって承認された。 解離した海馬ニューロンをポリ-D-リジンコートしたカバースリップ（Carolina Biological Supply）上に、〜50,000細胞/cm2の密度でプレーティングした。 病原性S87N変異81を有するリコンビナントヒトαシヌクレインPFFをPBSで0.1 mg/mLに希釈し、超音波処理し、ニューロン培地中で希釈した。 神経細胞はDIV 7に5ug/mlで処理し、12日間インキュベートした。 細胞は4% PFA/4% ショ糖で15分間室温で固定し、0.3% Tx-100で透過処理し、3% FBS/3% BSAで1時間室温でブロッキングした。 一次抗体（抗α-シヌクレインPhosphoSer129クローン81 A、1：2000希釈、Biolegend cat#825701; 抗ホスホヒストンH2A.X (Ser139) クローンJBW301、1：500希釈、Millipore cat#05-636 ）をブロッキングバッファで希釈して室温で3時間インキュベートした。 その後、カバースリップをPBSで3回洗浄し、適切なAlexa-fluor標識二次抗体とインキュベートした。 洗浄したカバースリップは、Fluoromount-G with DAPI (Fisher Scientific) を用いてスライドにマウントした。
二次抗体。 Alexa 488, goat anti mouse IgG2a, 1:1000 dilution, Fisher Scientific; Alexa 594, Goat anti mouse IgG1, 1:1000 dilution, Fisher Scientific.
PEラミナスキャナーは、カバースリップの画像化に使用されました。 HALOソフトウェア（Indica Labs）を使用して、各カバースリップの端から1.5mmの位置にあるγH2AX病巣とDAPI染色した核をカウントした。 データの統計解析は、Graphpad Prism Version 4を使用して行われた。
免疫蛍光& analysis
HAP1細胞
Hap1親WTコントロール（項目#C631バッチ29663）およびHap1 Human SNCA 103 bp deletionノックアウト（項目#HZGHC003210c003バッチ2）細胞株がHorizon Discoveryから得られ、IMDM媒体（Gibco#11995-）中で成長させた。065) + 10% Fetal Bovine Serum + Pen-Strepを加え、37℃、5% CO2の加湿インキュベーターで培養した。 固定する1日前に、35mmディッシュのPLLコート1.5号カバースリップ上に細胞を播種し、約80%コンフルエントになるまで培養した。 細胞をPBS中4％PFAで室温（RT）10分間固定し、PBSで1回洗浄し、染色手順までPBS中4℃で保存した。 固定された細胞は、1 mL PBS + 0.25% Triton-X 100で20分間、室温で穏やかに振盪しながら透過処理した。 溶液を除去し、細胞を1mLのBlocking Buffer (0.1% Triton-X 100 10% normal goat serum in PBS)で20分間ブロッキングした。 一次抗体をインキュベーションバッファーで希釈し（PBS中のブロッキングバッファーの1：5希釈）、穏やかに振とうしながら RT で一晩インキュベートした。 翌日、細胞をPBSで3回、15分間洗浄した。 蛍光標識二次抗体をIncubation Bufferで1:1000に希釈し、細胞に添加し、穏やかに振盪しながら、常温、暗所で一晩インキュベートした。 翌日、細胞をPBSで3回、20分間洗浄した。 核染色は、最後のPBS洗浄の直前に、PBS中2.5ug/mLのDAPI (Sigma D9542)で20分間行われた。 マウントの前に、細胞は脱イオン水中で簡単に洗浄した。 カバースリップは13 µL CitiFluor CFMR2 Antifadent Solutionでマウントし、Biotium CoverGrip Coverslip Sealantで密封した。 スライドはZeiss Elyra PS.1 710レーザー走査型共焦点顕微鏡でZenソフトウェアとともに画像化した。 0.5μmステップのZスタックを63倍ズームで取得し、核内で抗体シグナルが飽和しないように注意した。
使用した一次抗体は、抗Syn1、1：500希釈、マウスモノクローナル、BD Biosciences, cat. 610786; 抗ポリ（ADP-リボース）ポリマークローン10 H, 1:500希釈, 鶏ポリクローナル, Tulip BioLabs, cat. 1023; 抗ホスホヒストンH2A.X、1:500希釈、ウサギモノクローナル、Cell Signaling社、cat. 9718；抗ホスホS129-Syn EP1536Y、1：500希釈、ウサギモノクローナル、Abcam、ab51253；抗ホスホS129-Syn 81 A、1：667dilutionマウスモノクローナル、Covance、cat. 825701；抗Syn 4B12、1：500希釈、マウスモノクローナル、Biolegend、cat. 807804；および抗Syn EPR20535，1：100希釈，ウサギモノクローナル，Abcam，ab212184。 使用した二次抗体は以下の通り。 Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit, ThermoFisher cat.A-21245; Alexa Fluor 555 goat anti-mouse, Abcam ab150114; Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.
Bleomycin treatment ICC.ICCではBleomycinを使用した。 Bleomycin Sulfate (Selleckchem, cat. S1214) 粉末をH2Oで希釈して10 mg/mL stock solutionとし、アリコートして-80℃で保存した。 処理前日にHap1 WTおよびHap1 SNCA KO細胞を35mmディッシュのPLLコート#1.5カバースリップ上に播種し、翌日には〜80%コンフルエントになるようにした。 処理当日、通常培地を除去し、10ug/mL Bleomycinを含む2mLの新鮮な温培地を各ディッシュに添加した。 Sham細胞には、Bleomycinを含まない新鮮な温州培地を各ディッシュに加えた。 細胞は、37℃、5% CO2で1時間、加湿インキュベーターに入れられた。 処理後、培地を除去し、細胞をPBS中の4％PFAで10分間、常温で固定し、PBSで1回洗浄し、染色手順までPBS中で4℃で保存した。 処理前日にHap1 WTおよびHap1 SNCA KO細胞を、翌日に〜80%コンフルエントになるように、条件ごとに2×10cmプレートに播種した。 Bleomycin処理はICCと同様に行った。 処理後、培地を除去し、細胞を温PBSで1回洗浄した。 細胞はトリプシン処理で回収し、15 mLコニカルチューブに集め、200rcfで5分間ペレット化した。 液体を吸引し、ペレットを2 mL PBSに再懸濁し、2 × 2 mLマイクロチューブに移した。 NE-PER 抽出キット (Thermo-Fisher, cat. 78833) を用いて、最初の核再懸濁工程の後に短い超音波処理 (10秒、10 kHz) を加え、製造者の推奨に従ってタンパク質を細胞質および核分画に抽出した。 タンパク質プレップは、ウェスタンブロット分析まで-80℃で保存した。
共焦点イメージングについては、Plan-Apochromat 63x/1.40 oil 対物レンズを備えた Zeiss Elyra PS.1 共焦点顕微鏡で画像を取得した。 すべての共焦点解析は、ImageJ（NIH）ソフトウェアを使用して、z方向の核の中央に位置する単一の画像から各核のROIを作成することによって行われました。
マウス脳
雄マウス（3～6ヶ月齢）の脳を死後すぐに解剖し、6mLのPBS中4％PFAに入れ、循環水浴中で150W、90分間Pelco Biowave Proで固定した。 脳は4℃に移し、一晩固定を継続した。
固定後、脳をVibratome Leica VT1000Sで50 µmの冠状または矢状浮遊切片にスライスした。 特定の抗体については、ブロッキングの前に熱によるエピトープ回収（HIER）が必要でした。 脳切片を HIER バッファー（1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0.05% Tween, pH = 8.0）を含むチューブに加えた。5）、20分間蒸した後、室温で20分間冷却した。 組織をBlocking buffer (0.1% Triton-X, 10% goat serum, in PBS)で1時間ブロッキングした。 一次抗体は、各抗体に最適な濃度でインキュベーションバッファー（ブロッキングバッファーの1：5希釈）で希釈し、暗所で、室温で振盪しながら一晩インキュベートした。 組織をPBSで5回、30分間洗浄した。 相補的な二次抗体をインキュベーションバッファーで希釈し、同様に室温で一晩インキュベートした。 翌日、組織をPBS5回交換で洗浄した。 DAPI染色は、最後の洗浄の直前に行った。 組織は、CitiFluor CFMR2 Antifadent Solutionでスライドにマウントした。 1.5号のカバースリップをBiotium CoverGrip Coverslip Sealantで組織の上に密封した。
使用した一次抗体は：抗α-Synuclein Phospho (Ser129) Antibody clone 81 A, mouse monoclonal, 1:667 dilution, Biolegend cat#825701; 抗α Synuclein (phospho S129) antibody , rabbit monoclonal, 1:500 dilution, Abcam cat#ab51253; 抗asyn (Syn1/mSyn), mouse monoclonal, 1.1, 1:5, 1:500倍希釈、BD Biosciences cat#610786; Anti-pan-ADP-ribose binding reagent, rabbit, 1:1000 dilution, Millipore cat#MABE1016; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, clone 10 H (PADPR), chicken, 1:100 dilution, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-pospho-Histone H2A.A.A. (PADPR); anti-pan-ADP-ribose binding reagent, rabbit, 1:100 dilution, Millipore Cat#1024; anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody clone JBW301, mouse, 1:500 dilution, Millipore cat#05-636; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody clone 20E3, rabbit monoclonal, 1:500 dilution, Cell Signaling cat#9718 二次抗体として、以下の抗体を使用した。 Alexa 647, ヤギ抗ウサギ, 1:1000 希釈, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, ヤギ抗マウス, 1:1000 希釈, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, ヤギ抗ラビット, 1.1000希釈, Invitrogen cat#MPA21237; Alexa 555, ヤギ抗ラビットの2次抗体を使用しました。1000倍希釈、Abcam cat#ab150078; Alexa 555, goat anti-mouse, 1:1000 dilution, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, goat anti-chicken 1:1000 dilution, Abcam cat# ab150169.
共焦点イメージングでは、画像はZeiss Elyra PS.1にて取得しました。 共焦点顕微鏡で、Plan-Apochromat 63x/1.40 oil objectiveを使用して画像を取得しました。 レーザー出力1～5％を用いて、組織切片ごとに大脳皮質の2～4領域を通してzスタックを取得した。 IHCデータの解析には、Imaris（Bitplane、Oxford Instruments）イメージングソフトウェアを使用した。 細胞質から核をセグメント化するために、DAPIチャンネルを使用して表面を作成した。 神経細胞全体の核のみが分析された。 各チャンネルの統計情報（平均強度、合計強度、表面の総数）をエクスポートし、さらにPrism 6（GraphPad）で分析した。 核内の病巣を解析するために、DAPIチャンネルから作成した核面を使用して、選択したチャンネルの核信号をマスクした。
ヒト脳
ヒトのレビー小体型認知症剖検例の扁桃体からの切片は、剖検時（死後間隔12～48時間）に直ちに回収し、6mLのPBS中の新鮮な4％PFAに入れ、循環水浴中で150Wで90分間Pelco Biowave Proで固定した。 切片は4℃に移し、一晩固定を続けた。 翌日、PFAを0.05%アジ化ナトリウムに交換し、さらに処理するまで4℃で保存した。
固定後、扁桃体の切片をVibratome Leica VT1000Sで50μmの浮遊切片にスライスした。 組織はBlocking buffer (0.1% Triton-X, 10% goat serum, in PBS)で1時間ブロッキングした。 一次抗体は、各抗体に最適な濃度（下記参照）でインキュベーションバッファー（ブロッキングバッファーの1：5希釈）で希釈し、暗所で、室温で振盪しながら一晩インキュベートした。 組織をPBSで5回、60分間洗浄した。 相補的な二次抗体をインキュベーションバッファーで希釈し、同様に一晩室温でインキュベートした。 翌日、組織をPBS5回交換で洗浄した。 DAPI染色は、最後の洗浄の直前に行った。 組織は、CitiFluor CFMR2 Antifadent Solutionでスライドにマウントした。
使用した一次抗体は：抗α-Synuclein Phospho (Ser129) Antibody clone 81 A, mouse monoclonal, 1:667 dilution, Biolegend cat#825701; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody clone 20E3, rabbit monoclonal, 1:500 dilution, Cell Signaling cat#9718であった。 使用した二次抗体は Alexa 647, goat anti-mouse, 1:1000 dilution, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, goat anti-rabbit, 1:1000 dilution, Abcam cat#ab150077.
画像はZeiss LSM 880 with Airyscan microscopeで撮影されました。 ヒト組織サンプル内の増加した自家蛍光バックグラウンド染色から特異的な抗体シグナルを決定するために、線形アンミキシングプロトコルが使用されました。 マルチカラーサンプルの画像化に必要な対物レンズ、レーザー、ダイクロイックのパラメータ設定には、ラムダモードが使用されました。 同じパラメータを使用して、単色の染色サンプルから個々の参照スペクトルが作成されました。 さらに、バックグラウンドの参照スペクトルを決定するために、染色されていないサンプルを使用しました。 リファレンススペクトルを作成する際、すべての残差は最小化された。
IHCデータの解析には、Imaris（ビットプレーン、オックスフォード・インストゥルメンツ）イメージング・ソフトウェアを使用しました。 細胞質から核をセグメント化するために、DAPIチャンネルを使用して表面を作成しました。 神経細胞全体の核のみが分析された。 各チャンネルの統計情報（平均強度、合計強度、表面の総数）をエクスポートし、さらにPrism 6（GraphPad）で分析した。 核内の病巣を解析するために、DAPIチャンネルから作成した核面を使用して、選択したチャンネルの核信号をマスクした。
HAP1 cell comet assay
HAP1細胞中性コメットアッセイは、Trevigenの推奨に従って実施した（Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K）． Comet LMAgarose（Trevigen）と1：2の割合で混合した無血清IMDM（Sigma）中の細胞懸濁液（2×104 cells/ml）をCometSlidesTM（Trevigen）上にピペッティングし、4℃で10〜15分間置いてキャストした。 スライドをLysis Solution (Trevigen)中、4℃、暗所で一晩インキュベートした後、中性電気泳動バッファ（300 mM 酢酸ナトリウム、100 mM Tris-HCl, pH 9）中、4℃、暗所で1時間、インキュベートした。 スライドを新しいバッファー中で、20V（1V/cm）、4℃で40分間電気泳動した。 電気泳動後、スライドをまずDNA沈殿バッファー（1M酢酸アンモニウム、86.6% EtOH）、次に70% EtOHで、それぞれ室温、暗所で30分間インキュベートし、37℃で乾燥した。スライドを1X PBS（Gibco）中の1X SYBRTMgreen (Invirogen) で室温、30分間暗所で染色、dH2Oに10回浸して過剰な染色を洗浄し、37℃で乾燥させた。 コメットは、Zeiss Apotomeで10倍レンズを用いて可視化し、CometScoreTMを用いてスコア化した。
ブレオマイシン処理コメットアッセイ。 処理前日にHap1 WTおよびHap1 SNCA KO細胞を、翌日に80％コンフルエントになるように、条件ごとに2×35mmプレート上に播種した。 BleomycinおよびSham処理プロトコルは、ICCと同様に行った。 処理後、培地を除去し、細胞を温PBSで1回洗浄した。 回復期が続く場合は、新しい温めた培地を加え、細胞をインキュベーターに戻した。 0.05% Tripsin-EDTA (Gibco cat. 15400-54) を用いたトリプシン処理により、細胞を回収した。 2×35mmプレートからトリプシン処理した細胞を15mLコニカルチューブに集め、200rcfで5分間ペレット化した。 液体を吸引し、ペレットをFBSやPenn-Strepを含まない250uLの新しい培地に再懸濁し、2mLマイクロチューブに移し、上記のコメットアッセイに使用するまで氷上に保存しておいた。
マウス脳組織コメットアッセイ
雄マウス（1、3、6-9ヶ月齢）の新鮮な抽出脳組織を剃刀で細かく刻み、氷冷PBS（Ca2+とMg2+なし）に懸濁し、手持ち式のホモジナイザーで30秒間均質化させました。 組織を1分間微量遠心し、上清をPBSで1：10に希釈した。 血球計数装置を用いて細胞を数え、1×105/mlに希釈した。 希釈した細胞を低融点（LM）アガロースと1：2（v/v）の割合で合わせ、ガラス製コメットスライドのウェル上に広げた（Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K）. スライドは4℃の暗所で15分間乾燥させ、4℃のキット溶解液に一晩置いた。 余分なバッファーは、50 mL TBE, pH 7.4, 4 °C で30分間浸漬する前にスライドから排出された。 TBE, pH 7.4, 20 V, 40分, 4 ℃で電気泳動した。 余分なTBEを排出し、スライドをdH2Oに2回、5分間置いた。 100 µlの1X SYBR-Greenを乾燥アガロースの各円にピペッティングし、サンプルは室温、暗所で30分間染色された。 余分なSYBR-Green溶液を除去し、スライドをdH2Oで数回リンスした。 スライドは37℃で完全に乾燥させ、4℃で保存した。
Electrophoretic mobility shift assay
DNA preparation
300bp断片は、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) を用いて175V、2時間、RTで1％アガロースゲル上で分離した100bpラダー（NEB）から抽出された。 DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research)を用いてDNAを洗浄し、1X TEで溶出した。
電気泳動移動度測定法
DNA断片（20 ng）を組換えhu_ser129_phospho-syn（250 ng、1 μg、4 μg、8 μg、16 μg；Proteos，Inc．)、リコンビナントhu_α-synuclein (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg and 16 µg; Proteos, Inc.) またはリコンビナントグルタチオンS転移酵素 (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg and 16 µg; GenScript) 94 mM Tris-Cl, pH 8.0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTAおよび5%フィコールを含む20μL反応液中で20分間氷上に、そして30分間部屋温度で反応させた。 2 μL 10X Orange Loading Buffer (Licor)を加えた後、全反応の8μLを10%または6%ポリアクリルアミドTBEゲル (Novex)にロードし、100 Vで2時間、RTで運転した。 ゲルは1X TBE中の10X SYBRTM Safe DNA Stain (Invitrogen)で30分間染色された。 画像はFluorchem Mイメージングシステムを使用して取得し、ImageJ Gel Analyzingツールを使用して定量化した。
ウェスタンブロット
10%ポリアクリルアミドTBEゲルをBiodyne™B Nylon Membrane (Thermofisher Scientific) に転写し、30V、1時間、16分間氷上、Novex XCell II Blotting System (Invitrogen) で0.5X TBEに浸した。 膜をOdyssey PBS Blocking Buffer (Li-Cor) で一晩ブロックし、Syn1 (1:1,000; Biolegend) で1時間、IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10,000; Li-Cor) で4℃にて一晩染色をした。 画像はLi-Cor Odyssey CLx Imaging Systemで取得した。
Hap1 Nuclear protein prepsのウエスタンブロット。 Hap1 NE-PER細胞質および核タンパク質プレップの濃度は、Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce, cat. 23225) を用いて定量し、550nmの読み出しでMultiskan FC Microplate Photometer (Fisher, cat. 51119000) で読み取りました。 5 µg & 10 µgの核タンパク質をSDSサンプルバッファー (Novex, cat. LC2676) + BME (Gibco, cat. 21985-023) で希釈して10-20% Tris-Glycine gel (Novex, cat. XP10202BOX) 上にロードした。 参照用に3 µLのカラー染色済みタンパク質ラダー (NEB, cat. P7719) をロードした。 ゲルを分解し、Immobilon-FL PVDF membrane (Millipore, cat. IPF00010) に転写するためにセットアップした。 ゲルは、Tris-Glycine transfer buffer (Novex, cat. LC3675) 中、氷上、25Vで2時間かけて転写した。 転写後、メンブレンを取り出し、直ちに4% PFA + 0.01% Glutaraldehydeで10分間、穏やかに振盪しながら固定した（RT）。 メンブレンをmilliQ H2Oで1回洗浄し、REVERT total protein stain kit (LI-COR, cat. 926-11010) で製造者のプロトコルにしたがって染色した。 LI-COR Odyssey CLx Imager を用いて、染色された総タンパク質を取得した。 REVERT 染色の反転後、膜を milliQ H2O で 1 回洗浄し、Odyssey Blocking Buffer (LI-COR, cat. 927-40000) で穏やかに振盪しながら 4 C で一晩ブロッキングを行った。 一次抗体をBlocking Bufferで1:1000に希釈し、穏やかに振りながら2時間RTでインキュベートした。 メンブレンをPBS中の0.1% Tween20で3回、10分間洗浄した。 二次抗体（LI-COR IR680LT donkey anti-rabbit cat. 926-68023; IR800CW donkey anti-mouse cat. 926-32212) をブロッキングバッファーで1:10000に希釈し、穏やかに振盪しながら1時間インキュベートした。 膜は、PBS中の0.1% Tween20で10分間、PBSで10分間、3回洗浄した。 LI-COR Odyssey CLx Imagerを使用して画像を取得した。 解析はFIJIでゲルアナライザーを用いて行った。 抗体シグナルは、REVERT総タンパク質に対して正規化した。
T4リガーゼ媒介DNA末端接合アッセイ
各末端接合反応は、凝集端制限酵素XhoI (NEB RO146S) で5′ と 3′ 末端で消化された150 ngの1.2 kb DNA PCR産物を含む。 反応は、150 ngの消化DNA、2.8 µLのタンパク質バッファー (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7.6), 5.3 µL 20% グリセロール in PBS + Mg + Ca、2 µL T4 ligase buffer, 200 ng または 40.5 ng protein, 25U of T4 ligase (NEB M0202) および容量分の無菌H2Oを含む20 µL反応容量で実施された。 T4リガーゼ以外の全成分を合わせ、氷上で15分間インキュベートした。25UのT4リガーゼを反応液に加え、RTで90分間インキュベートした。 インキュベーション後、直ちにZymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 column (Zymo Research) で反応物を洗浄し、15μLの滅菌H2Oで溶出させた。 SybrGreenとローディングバッファーをDNAに加え、サンプルを1%アガロースTAEゲルで135V、1時間電気泳動し、Syngene G:BOX化学発光・蛍光イメージャーで画像化した。 ゲル画像の解析には ImageJ を使用し、データは Prism 6 (GraphPad) を使用してグラフ化した。
実験デザイン & 統計解析
すべての定量値は平均 ± SEM として報告される。 各実験に関連するサンプルの種類と数（N）、および有意性を評価するために使用した統計検定が、各データセットとともに提示されています。 各実験で使用したサンプルサイズは、予備データから予想される効果量（～10～50％）および標準偏差の推定値に基づいており、0.05有意水準（α）および0.9検出力（1-β）で差を検出する検出力がありました
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