Gap Junctions in Cardiovascular Disease

Gap junctions, gespecialiseerde membraanstructuren bestaande uit arrays van intercellulaire kanalen, verbinden aangrenzende cellen in vele weefsels en organen, en zorgen daarbij voor chemische en elektrische communicatie. In het hart voorzien gap junctions de paden voor intercellulaire stroom, waardoor gecoördineerde actiepotentiaalvoortplanting mogelijk wordt. Recent werden talrijke rapporten gepubliceerd die suggereren dat veranderingen in de distributie, dichtheid en eigenschappen van gap juncties betrokken kunnen zijn bij de initiatie en persistentie van verschillende hartritmestoornissen. In deze review vatten we de gegevens uit deze rapporten samen en bespreken we de functionele implicaties.

Structuur en eigenschappen van gap junction kanalen

In het afgelopen decennium zijn de structuur en eigenschappen van gap junction kanalen uitgebreid gedocumenteerd, zoals besproken in verschillende recente reviews.1234

Mammalian gap junction kanalen zijn opgebouwd uit connexines die gecodeerd worden door een familie van nauw verwante genen. Alle connexines bestaan uit 4 sterk geconserveerde α-helicale membraan-overspannende segmenten, gescheiden door 2 extracellulaire en 1 intracellulaire lus. De amino- en carboxy-uiteinden bevinden zich intracellulair. Vijftien leden van de connexinefamilie van zoogdieren zijn geïdentificeerd. Zij verschillen voornamelijk in de volgorde van hun intracellulaire lussen en carboxy terminals. Tussen cardiomyocyten zijn 3 connexines op eiwitniveau gedetecteerd: connexin40 (Cx40), connexin43 (Cx43), en connexin45 (Cx45) (genoemd naar hun vermoedelijke moleculaire massa in kilodaltons).

Een gap junction kanaal wordt gevormd door head-to-head docking van 2 hemikanalen (connexons), elk samengesteld uit 6 connexinemoleculen die hexagonaal gerangschikt zijn rond een waterige porie. Omdat de koppeling wordt gemedieerd door relatief geconserveerde extracellulaire lussen, kunnen veel connexons die zijn samengesteld uit één soort connexine combineren met connexons die zijn gemaakt van andere connexines om heterotypische gap junction kanalen te vormen. Een connexon kan ook uit verschillende connexines bestaan5 (heteromerisch connexon). In het hart colokaliseren verschillende connexines in gap junction plaques, maar het is onbekend of heterotypische en/of heteromerische gap junction kanalen bestaan in het cardiovasculaire systeem.

Gap junction kanalen zijn permeabel voor stoffen met een molecuulgewicht van <≈1 kDa. De permeabiliteit is afhankelijk van het connexinetype en de lading van het permeërende molecuul. Gap junction kanalen gedragen zich als “gated” ionenkanalen. In cardiomyocyten varieert de geleiding van één kanaal van ≈20 pS voor homotypische Cx45 kanalen tot 75 pS voor Cx43 kanalen en tot ≈200 pS voor Cx40 kanalen. Gap junction geleiding wordt gemoduleerd door transjunctionele spanning, door i6 en i, door de fosforylatie toestand van de connexines, en door extracellulaire vetzuursamenstelling.

Connexine expressie wordt ook gemoduleerd. Hormonen kunnen de connexine-inhoud up- of downreguleren. In neonatale rattenhartcellen in vitro kan cAMP de expressie van Cx43 dramatisch doen toenemen met een gelijktijdige toename van de geleidingssnelheid van de actiepotentiaal. De turnover van connexines is opmerkelijk snel. In het volwassen rattenhart bijvoorbeeld bedraagt de halfwaardetijd 1,3 uur.7

Gap Junction Distribution in Normal Myocardium

In myocardium komen connexines regionaal tot expressie: Cx43 komt in het hele hart voor, mogelijk met uitzondering van de nodale weefsels en delen van het geleidingssysteem.4 Bij zoogdiersoorten komt Cx40 tot expressie in atriumweefsel (met uitzondering van het rattenhart) en in het proximale geleidingssysteem (met uitzondering van het caviahart).89 De expressie van Cx45 lijkt beperkt te zijn tot nodale weefsels en het geleidingssysteem,1011 maar sommige rapporten1213 beweren een veel wijder verspreide distributie, waarschijnlijk door het gebruik van een niet geheel specifiek anti-Cx45 antilichaam.14 Er zijn tot op heden geen andere connexines gedetecteerd tussen cardiomyocyten.

In volwassen ventrikels bevatten gap junctions uitsluitend Cx438 en bevinden zich overwegend in de intercalated disk (ID) regio tussen cellen. De anisotrope geleidende eigenschappen van ventriculaire myocard zijn afhankelijk van de geometrie van de onderling verbonden cellen en het aantal, de grootte en de locatie van de gap junction plaques tussen hen.15 Veel (immuno)-histochemische en (elektronen)microscopische studies hebben deze kwesties aangepakt. Gap junction plaques bestaan uit arrays van min of meer dicht opeen gepakte 9- tot 10-nm deeltjes, die individuele kanalen vertegenwoordigen. Onder normale omstandigheden blijken gap junction plaques van ratten ≈15% deeltjesvrije ruimte te bevatten,16 terwijl gap junction plaques van konijnen deeltjes aaneengesloten zijn.17 In termen van junctionele geleiding is er weinig verschil, omdat het lagere aantal kanalen per vierkante micrometer grotendeels gecompenseerd wordt door de afname in toegangsweerstand18 (zie hieronder). De gemiddelde gap junction plaque oppervlakte varieert van 0,21 μm2 in de menselijke ventrikel19 tot ≈0,45 μm2 in de rat ventrikel2021 en tot ≈4 μm2 in de canine ventrikel.22 In het laatste geval, dit gebied was ≈1,5 μm2 voor ongeveer de helft van de plaques en ≈6,6 μm2 voor de andere helft. Uit (elektronen)microscopische212223 en (immuno)histochemische beoordeling,1921242526 blijkt dat grotere gap junction plaques zich bevinden in interplicate gebieden van de ID (d.w.z. in gebieden die min of meer parallel lopen met de lange as van de cellen) en dat kleinere zich in plicate gebieden bevinden. Hoyt et al22 schatten dat 80% van het totale gap junction gebied per cel zich in interplicate gebieden bevindt, waar de gap junctions zowel longitudinale als transversale geleiding kunnen dienen.

Ventriculaire myocyten zijn door ID’s verbonden met ≈10 naburige cellen.2226 De geleidingssnelheid wordt bepaald door het gap junction plaque gebied in elk van deze ID’s. De totale gap junction plaque oppervlakte per ID is 47 tot 94 um2 bij ratten,27 42 of 13,6 um2 bij honden,2223 en ≈10 um2 bij de mens.26

In het atrium, gap junction plaques bevatten zowel Cx43 en Cx40.913 Meestal Cx43 en Cx40 zijn gelokaliseerd in dezelfde plaques zonder preferentiële locatie van een van beide connexine in laterale celranden of ID plaques.9 Er zijn geen gegevens beschikbaar om de oppervlakte van gap junction plaques per ID in het atrium te berekenen.

In ventriculair myocardium is expressie van Cx40 beperkt tot het geleidingssysteem.8 In de meeste zoogdiersoorten is geen Cx43 aanwezig in het proximale deel (bundel His, bundeltakken), terwijl in de meer distale regio’s van de bundeltakken en de Purkinjevezels, Cx40 en Cx43 coexpresief zijn.28 In Xenopus oöcyten kunnen Cx43 en Cx40 geen functionele heterotypische gap junction kanalen vormen,29 en er werd gesuggereerd dat de connexine distributie in het proximale geleidingssysteem zou dienen om de actiepotentiaal snel naar distale delen te propageren zonder stroomverlies via gap junctions naar de omliggende septale myocyten. In zoogdiercellen lijkt de onverenigbaarheid van Cx40 en Cx43 connexons echter minder duidelijk.30 In muizenharten komt Cx45 tot expressie in de gehele atrioventriculaire knoop, de His-bundel en de bundeltakken.10 De expressie van Cx40 is beperkt tot de kern van de His-bundel en de bundeltakken.10

Distribution of Gap Junctions in Diseased Myocardium

In virtually all cardiac diseases predisposing to arrhythmias, changes in the distribution and number of gap junctions (gap junction remodeling) have been reported. In gevorderde ischemische ziekte, werd een smalle zone bestaande uit ≈5 lagen van cellen grenzend aan genezen myocardiale infarcten gedetecteerd.24 In deze zone, de normale verdeling van gap junctions in end-to-end-located IDs werd verstoord met een verschuiving van Cx43-bevattende vlekken aan de laterale cel grenzen zonder veranderingen in de grootte van de vlek. Normaal, ischemische en hypertrofische menselijke linker ventrikels toonde even grote plaques van anti-Cx43 kleuring, maar de totale hoeveelheid Cx43 was verminderd met 40% in de zieke harten.26 Het aantal ID’s per cel was niet verschillend in normale en zieke harten, wat impliceert dat cellulaire geometrie was niet drastisch veranderd. Aan de andere kant, in reversibel ischemische en winterslaap menselijke hartkamer, een vermindering van Cx43 plaque grootte van 23% en 33%, respectievelijk, werd waargenomen in de getroffen gebieden,19 met geen veranderingen in normale myocard. In deze experimenten werd een verschuiving van Cx43 vlekken van een end-to-end locatie naar een laterale locatie waargenomen; deze verschuiving werd ook gemeld in hypertrofische cardiomyopathie.25

In een cavia model van congestief hartfalen, werd een algehele vermindering van Cx43 van 37% waargenomen in het congestieve hartfalen stadium na 6 maanden van aorta banding, terwijl in de gecompenseerde hypertrofie stadium, geen veranderingen werden gezien.31 Recent werd een afname van 35% in gap junction area per ID gerapporteerd32 na 4 weken rechterventrikelhypertrofie veroorzaakt door monocrotaline-geïnduceerde pulmonale hypertensie bij de rat, samengaand met een afname van 30% in longitudinale geleidingssnelheid (ΘL). Tegelijkertijd verschenen talrijke Cx43-positieve vlekken langs de laterale grenzen van de cellen. De geleidingssnelheid in transversale richting (ΘT) en het totale Cx43-gehalte, zoals bepaald door immunoblotting, werden niet beïnvloed. De auteurs concluderen dat de herverdeling van gap junction plaques de verminderde anisotropie ratio (ΘL/ΘT) kan verklaren. De waargenomen toename van 55% in celdiameter kan echter ook een rol spelen. Peters et al33 toonden een nauwe correlatie aan tussen de induceerbaarheid van figure-of-8 reentrerende aritmieën in epicardiaal weefsel grenzend aan 4-dagen oude infarcten in ventrikels van canines en de verstoring van de gap junction distributie. Vooral levensvatbare cellen in de buurt van en soms interdigiteren met necrotische cellen van de geïnfarcteerde regio toonde uitgebreide Cx43 labeling van laterale celgrenzen.

Het blijkt dat lateralisatie van gap junctions is een prominent kenmerk van zieke myocard. Het is niet helemaal duidelijk, echter, in welke mate deze lateralisatie kan bijdragen tot veranderde geleiding eigenschappen, omdat het onlangs werd aangetoond34 dat in rat ventriculaire cellen grenzend aan genezen infarcten, veel van de laterale gap junction plaques bevinden zich in invaginaties van het sarcolemma in de cel interieur, waardoor niet bijdragen aan cel-tot-cel communicatie. Een vergelijkbare observatie is gedaan bij rechterventrikelhypertrofie.32

Hoewel kwantitatieve gegevens schaars zijn, is een andere veel voorkomende bevinding in ziek myocard een 30% tot 40% vermindering van het gap junction gebied per ID. In (post)ischemische ventrikels, deze vermindering beperkt tot een paar cellagen rond het getroffen gebied, terwijl in hypertrofische ventrikels, de vermindering is meer wijdverspreid. Uit deze waarneming alleen of samen met een verhoogde dichtheid van laterale gap junction plaques, zou men een verminderde anisotropie ratio voorspellen. In één studie,23 werd gesuggereerd dat een verhoogde anisotropie ratio optrad in infarct grenszones. Deze toename was deels te wijten aan een vermindering van de laterale (interplicate) gap junction dichtheid en deels aan een afname van het aantal cellen met side-to-side verbindingen met naburige cellen.

Verschuivingen in gap junction dichtheid en distributie in zieke atriale weefsel zijn minder goed gedocumenteerd. In snel paced hond atria, een toename van Cx43-positieve plekken werd gemeld,35 vooral aan de laterale cel grenzen. In geitenatrium, geen duidelijke veranderingen in Cx43 dichtheid en distributie na 16 weken van aanhoudende atriale fibrillatie (AF) werden gevonden,3637 hoewel enige defosforylering had plaatsgevonden. Cx40 eiwit was afwezig in 0,15- tot 0,6-mm patches van atriumweefsel na 16 weken van AF zonder een vermindering van Cx40 mRNA. De fragmentarische vermindering van Cx40 eiwit was duidelijk na 2 weken AF, rond dezelfde tijd dat AF werd volgehouden. Of deze vermindering van Cx40 in verband staat met het aanhouden van AF moet nog blijken.

Data over de betrokkenheid van gap junction remodeling bij ritmestoornissen die hun oorsprong vinden in het geleidingssysteem of in nodaal weefsel worden nog maar net gerapporteerd.383940

Gap Junctions and Conduction Velocity

Effective gj

We voerden enkele eenvoudige computersimulaties uit om de effecten van veranderingen in dichtheid en distributie van gap junctions op de geleidingssnelheid van de actiepotentiaal te testen. Eerst bepaalden we de effectieve gap junctional geleiding (gj, gecorrigeerd voor elektrische veld effecten veroorzaakt door cytoplasmatische toegangsweerstand) met behulp van onze eerder gepubliceerde model 18 en door aan te nemen dat de Cx43 eenkanaals conductantie te zijn 75 pS bij 37 ° C 41 en alle kanalen te zijn in hun geleidende toestand (maar zie referentie 42 ). Figuur 1A toont aan dat de effecten van cytoplasmatische toegang weerstand zijn al duidelijk voor relatief kleine spleetjuncties en prominenter met toenemende spleetjunctie grootte. Voor gap junctions >0.5 μm2, is de effectieve geleiding <50% van de waarde die wordt verkregen door eenvoudig de individuele geleidingen van alle kanalen in een bepaald gebied op te tellen (ongecorrigeerde geleiding), en voor spleetjuncties >4 μm2, is de effectieve geleiding zelfs <20%. Bijgevolg, gj per oppervlakte-eenheid is niet constant, maar neemt af met toenemende spleet junctie grootte (figuur 1B). Effectieve geleiding is 0,3 tot 0,5 μS / μm2 voor kleine tot matig grote gap junctions (0,3 tot 1,5 um2) en <0,2 μS / μm2 voor grote gap junctions (>5 um2). Zoals hierboven besproken, varieert de oppervlakte van spleetjuncties gewoonlijk tussen 10 en 40 μm2 per ID. Als een gemiddelde effectieve geleiding van 0,3 μS /μm2 wordt gebruikt, effectieve gj per ID tussen naburige cellen is 3 tot 12 μS.

geleidingssnelheid

Volgende hebben we beoordeeld het belang van gj voor geleidingssnelheid. We stimuleerden de meest linkse cel in een lineaire streng van 50 cellen met een frequentie van 1 Hz en berekende de geleidingssnelheid over het middelste derde deel van de streng. Cellen werden ofwel gerangschikt end to end of naast elkaar, en naburige cellen werden verbonden door een constante (effectieve) gj (figuur 2A). We gebruikten de menselijke ventrikel cel model van Priebe en Beuckelmann43 in een numerieke weergave van de kabel vergelijking vergelijkbaar met die onderzocht door Shaw en Rudy,44 met een waarde van 150 Ω cm voor cytoplasmatische resistiviteit.45

Om ΘL waarden van ≈70 cm / s zoals gerapporteerd voor de menselijke hartkamers te verkrijgen,46 een geleiding van 7,0 uS nodig is (figuur 2B). Dit komt goed overeen met de bovenstaande waarde van 3 tot 12 uS geschat uit morfometrische gegevens. Dezelfde geleiding van 7,0 μS resulteert in ΘT van 30 cm/s. Onder normale omstandigheden is ΘL vrij ongevoelig voor veranderingen in gj: het daalt met slechts 9 cm/s (13%) bij halvering van de geleiding. ΘT is gevoeliger voor veranderingen in gj: het daalt met 36% bij halvering van de geleiding. De relatieve ongevoeligheid van ΘL voor veranderingen in gj kan worden verklaard in termen van gap junctional weerstand, die we berekend uit gj en cel afmetingen (figuur 2C). Voor longitudinale geleiding (ononderbroken lijn met gevulde cirkels in figuur 2C), gap junctional weerstand daalt onder de cytoplasmatische weerstand van 150 Ω cm (horizontale stippellijn) bij gj waarden zo klein als 2,5 uS, terwijl voor transversale geleiding, gap junctional weerstand is veel groter dan cytoplasmatische weerstand bij alle waarden van gj (stippellijn met open vierkantjes). Wij concluderen derhalve dat de geleidingssnelheid, met name ΘL, slechts matig gevoelig is voor veranderingen in effectieve gj. Bovendien kunnen celafmetingen (verhouding tussen cellengte en celbreedte) een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de (anisotropie van de) geleidingssnelheid. Dit is consistent met de conclusie van Spach et al47 dat celgrootte belangrijker kan zijn dan gap junction distributie.

Functionele implicaties

De simulatieresultaten vormen belangrijke voorbehouden voor de interpretatie van kwantitatieve gegevens uit (immuno)histochemische of (elektronen)microscopische studies. Een vermindering van de totale gap junction inhoud met maar liefst 40% zonder veranderingen in de grootte van de gap junction plaques, zoals waargenomen in zieke menselijke harten,26 kan op zichzelf slechts matige effecten hebben op de geleidingssnelheid. Als de normale gj tussen cellen 5 μS is, resulteert een 40% reductie tot 3 μS in een 11% afname van ΘL van 65 tot 58 cm/s en een 27% afname van ΘT van 24 tot 18 cm/s (figuur 2B). De bijbehorende anisotropieverhouding neemt met 22% toe van 2,7 tot 3,3. In andere gevallen bleef het totale gehalte aan gap junctions ongewijzigd, maar trad een verschuiving op naar laterale celgrenzen.2532 Een verschuiving van 40% zou ΘL met 11% verminderen en ΘT met 25% doen toenemen, wat resulteert in een afname van de anisotropieverhouding met 29%. Als de nieuwe laterale gap junctions intracellulair gelokaliseerd zijn,3234 verandert ΘT mogelijk helemaal niet.

Conclusie

In veel studies die de remodellering van gap junctions in ziek ventriculair weefsel betreffen, hebben de auteurs geconcludeerd dat een afname in geleidingssnelheid de neiging tot reentrerende aritmieën kan vergroten. De huidige analyse van de beperkte beschikbare gegevens geeft echter aan dat de vermindering van de geleidingssnelheid of de veranderingen in de anisotropie ratio in feite gematigd kunnen zijn. Zeker, de waargenomen veranderingen zouden het substraat niet in de sfeer van trage geleiding brengen zoals behandeld in verscheidene recente experimentele484950 en theoretische4451 studies. Onze analyse geeft aan dat cytoplasmatische weerstand en cellulaire geometrie veel belangrijker zijn dan algemeen wordt aangenomen, een conclusie die ook wordt bepleit door Spach en collega’s.15475253

Wij hebben in onze analyse geen rekening gehouden met door ziekte veroorzaakte veranderingen in membraanionische en gap junction kanaaleigenschappen. Ongetwijfeld bemoeilijken dergelijke pathofysiologische veranderingen het begrip van aritmogenese bij acute ischemie, chronisch myocardinfarct, hypertrofie en hartfalen.

Footnotes