Er zijn talrijke alternatieve benaderingen voor PCR-klonen (1) ontwikkeld, waaronder TA-klonen (2), ligatie-onafhankelijk klonen (LIC) (3-4), recombinase-afhankelijk klonen (5-7) en PCR-gemedieerd klonen (8-10). Het praktische nut van elke kloneringsmethode wordt bepaald door de betrouwbaarheid ervan, en niet zozeer door het gemak, de prijs of de efficiëntie onder optimale omstandigheden. De methoden die het gemakkelijkst te controleren en te optimaliseren zijn, blijken uiteindelijk het betrouwbaarst te zijn. TA-klonering en LIC vereisen eindmodificaties die niet door gelelektroforese kunnen worden gecontroleerd. Recombinases worden over het algemeen verkocht als merkgebonden componenten van kloneringskits, zodat slechts weinig consumenten de in vitro-reacties voor recombinatie optimaliseren. Overlap extension PCR-klonering, die hier wordt beschreven, is niet de eerste vorm van PCR-gemedieerd kloneren (8-10). Het is echter relatief eenvoudig, efficiënt en betrouwbaar.
De eerste van twee PCR’s (figuur 1A) creëert een lineaire insert met plasmide-sequenties aan beide uiteinden (zie Supplementary Materials voor methoden en instructies voor primer ontwerp). Deze extensies vervolgens toestaan dat de strengen van het PCR-product (figuur 1A) om te fungeren als een paar oversized primers op de vector fragment (figuur 1B). Na denaturatie en annealing hybridiseren de insertstrengen aan de vector en breiden zich uit om een nieuw dubbelstrengs plasmide te vormen. Phusion DNA polymerase (Cat. no. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, USA), van cruciaal belang voor de uitvoering van de techniek, bezit geen strengverplaatsingsactiviteit. Het eindproduct van de reactie is dan ook een dubbelstrengs fusieplasmide met twee inkepingen (één op elke streng). Dit ontspannen dubbelstrengs plasmide wordt vervolgens getransformeerd in competente Escherichia coli cellen, die de inkepingen afdichten met DNA-reparatie-enzymen (figuur 1C). We gebruiken dezelfde thermostabiele polymerase voor beide PCR’s, zodat onervaren gebruikers efficiënt kunnen klonen zonder de eigenaardigheden van meerdere restrictie-enzymen, polymerasen, glycosylasen, recombinasen en ligasen onder de knie te krijgen.
(A) Eerst wordt de insert PCR-gemampeld met de chimere primers, zodat het uiteindelijke PCR-product overlappende gebieden met de vector heeft. (B) Vervolgens worden vector en insert gemengd, gedenatureerd en geannealed; het gehybridiseerde insert wordt vervolgens verlengd door Phusion DNA polymerase met vector als sjabloon totdat het polymerase het 5′-uiteinde van het insert bereikt. Na verscheidene PCR-cycli wordt het nieuwe plasmide met twee nicks (één op elke streng) als product geaccumuleerd. (C) Het nieuwe plasmide kan worden getransformeerd in E. coli nadat het ouderplasmide is vernietigd door DpnI digest.
We gebruikten eerst gfp voor proof-of-principe-experimenten. Het gfp-gen werd PCR-vermenigvuldigd (Figuur 1A) met de chimere primers (5′-uiteinden complementair aan het pQE30 plasmide; 3′-uiteinde complementair aan gfp). Overlap extension PCR (figuur 1B) werd uitgevoerd met vijf verschillende DNA-polymerasen (Supplementary Table S1). Hoge concentraties van het insert en relatief lage annealingtemperaturen in de reactie (5-10 ° C onder de berekende smelttemperatuur van de primer / plasmide complex) zijn belangrijk voor een efficiënte overlap extensie. Sommige van de PCR-producten komen overeen met de ontspannen vorm van de gewenste vector, zoals blijkt uit agarosegelanalyse (figuur 2A). De oorspronkelijke pQE30-vector werd vernietigd in reacties met restrictie-endonuclease DpnI (figuur 1C). Een klein aliquot van elke reactie werd gebruikt om E. coli cellen te transformeren.
(A) Producten van de overlap extensie PCR klonering reactie na 0, 5, 10, 15, 20, 25, en 30 cycli door agarose gelelektroforese. Drie nanogram pQE30 vector werden gemengd met 175 ng insert (250 molaire overmaat) in 10 pi totaal volume; een 4μL aliquot van de reactie werd gescheiden op een 0,8% agarose gel. M2, 1 kb DNA ladder; M1, geassembleerd plasmide in gesloten circulaire en ontspannen circulaire vormen. (B) Overlap-extensie PCR kloneringsefficiëntie van een gfp gen als functie van het aantal PCR cycli. Twintig microliter van bevoegde E. coli cellen werden getransformeerd met 1 pi pQE30/insert overlap extension PCR. Het aantal groene kolonies werd uitgezet tegen het aantal PCR-cycli voor elke plaat. (C) Overlappingsextensie PCR kloneringsefficiëntie als functie van de insertlengte. Phusion DNA polymerase werd gebruikt om producten van verschillende grootte te PCR-amplificeren: GFP-gen (gfp), β-D-glucuronidase-gen (gusA), β-galactosidase-gen (lacZ) en het luxABCDE-operon van het pIMBB-plasmide. Deze producten werden gel-purified en gebruikt in de overlap extension PCR reactie met pQE30 vector. Drie nanogram pQE30 vector werden gemengd met 175-500 ng insert in een totaal reactievolume van 10 pi en onderworpen aan 18 cycli van PCR. Na DpnI behandeling werden de overlap extensie PCR-producten gebruikt om bevoegde E. coli cellen te transformeren. Het aantal kolonies per plaat werd uitgezet tegen de grootte van de insert.
Phusion DNA-polymerase was beter geschikt voor overlap extensie PCR klonering dan de concurrenten die we hebben getest (Supplementary Table S1), misschien te wijten aan zijn superieure verwerkingssnelheid en trouw (11-12). Phusion DNA polymerase is 10 × meer processieve dan de natieve Pfu polymerase (Cat. nr. 600135; Stratagene, La Jolla, CA, USA), en produceerde 46 × meer kolonies (Supplementary Table S1). Het produceerde ook 35× meer kolonies dan Expand Long Template DNA polymerase mix (Cat. nr. 11681834001; Roche, Basel, Zwitserland), die voornamelijk Taq DNA polymerase. Zuo en Rabie ontwikkelden een soortgelijke methode met Taq DNA polymerase alleen, en meldden vergelijkbaar bescheiden klonering efficiëntie (8). Taq DNA polymerase is relatief procesief (60% van dat van Phusion), maar de totale getrouwheid van het mengsel is slechts 3,8% van dat van Phusion. Meer dan 98% van de kolonies getransformeerd met DNA geproduceerd door Phusion DNA polymerase waren zichtbaar groen, wat duidt op een minimale kloneringsfout of carry-over van de oorspronkelijke vector.
We hebben de efficiëntie van de overlap extensie PCR klonering gemeten als functie van de temperatuur cycli; het aantal recombinante klonen steeg geometrisch tijdens de eerste 15 cycli en bereikte een piek bij 17-18 cycli (figuur 2B). Verdere cycli resulteerde in een lichte (~ 30%) daling van de hoeveelheid klonen geproduceerd, geassocieerd met de accumulatie van de hoog-moleculaire gewicht DNA-producten waargenomen in agarose gels (figuur 2A). De insert/plasmide verhouding kan ook een uitgesproken effect hebben op het resultaat van de reactie. We vergeleken drie verschillende vector:insert verhoudingen (1:5; 1:50 en 1:250) in overlap extensie PCR klonering reactie met Phusion DNA polymerase. Alle drie de verhoudingen resulteerden in het verschijnen van de ingepikte vorm van het plasmide (zoals beoordeeld door agarose gelelektroforese, niet afgebeeld) en recombinante klonen (zoals beoordeeld door transformatie en groei van groene kolonies). De verhouding 1:250 leverde de meeste recombinante klonen op.
Wij pasten vervolgens overlap extension PCR-klonering toe om de genen voor GFP (gfp, 1 kb), β-D-glucuronidase (gusA, 1,9 kb), en β-galactosidase (lacZ, 3,2 kb) te kloneren, evenals het volledige luxABCDE-operon (6 kb). De correcte structuur van alle recombinante vectoren werd bevestigd door restrictieanalyse en de functie van reporterproteïnen. De schijnbare foutmarge in verband met onze methode, zoals beoordeeld door de fractie van kolonies die geen volledige reporteractiviteit vertoonden, was <3%, ongeacht de grootte van de insert (gegevens niet weergegeven). Tegelijkertijd nam het aantal kolonies dat we na transformatie op platen waarnamen aanzienlijk af met de toename van de insertlengte (figuur 2C). De grafiek is bijna lineair, wat suggereert dat 6,7 kb de bovengrens is voor inserts met deze techniek.
Het resultaat van elk kloneringsproject hangt grotendeels af van de inspanning en aandacht voor detail van de werker. De overlap extensie PCR klonering reactie hier beschreven is net zo gemakkelijk te controleren en te optimaliseren als elke andere lange PCR-protocol (13). In het algemeen is de PCR-opbrengst slecht wanneer de reactievoorwaarden te streng zijn (primers annealiseren niet) of te ontspannen (niet-specifieke priming). Beide worden gemanifesteerd door lege rijstroken in agarose gels, hoewel de laatste kan ook resulteren in uitstrijkjes of ongewenste bands (zie Supplementaire Materialen voor details over primer ontwerp en PCR-reactie optimalisatie). De strengheid van PCR kan worden gecontroleerd door wijziging van reactantconcentraties (primers, sjabloon), annealingtemperatuur, bufferingrediënten (magnesium, pH, DMSO) of het aantal temperatuurcycli. Over het algemeen bleek deze klonering aanpak ongevoelig te zijn voor de aanwezigheid van de interne herhaalde elementen (zie Aanvullende Materialen voor details). Phusion DNA polymerase kan worden gebruikt om zowel de PCR amplificatie van de insert en overlap extensie reacties katalyseren, zodat beoefenaars alleen nodig hebben om vertrouwd te raken met de eigenaardigheden van een enkel enzym.