Toepassing van microsatelliet-loci voor moleculaire identificatie van elitegenotypes, analyse van klonaliteit en genetische diversiteit in esp Populus tremula L. (Salicaceae)

Abstract

Testsystemen voor moleculaire identificatie van microvermeerderde elitegenotypes van esp (Populus tremula L.) werden ontwikkeld op basis van microsatelliet-loci (SSR). Van de 33 geteste microsatelliet loci werden er 14 geselecteerd vanwege de duurzame PCR amplificatie en de aanzienlijke variabiliteit in elite klonen van espen bestemd voor de aanleg van snel roterende bosaanplantingen. Alle acht geteste klonen hadden verschillende multilocus genotypes. Onder 114 bomen van drie inheemse referentieopstanden in de buurt van de aangelegde plantages werden 80 haplotypes geïdentificeerd, terwijl sommige herhaalde genotypes werden toegeschreven aan natuurlijke klonen die als gevolg van uitlopen waren ontstaan. De geselecteerde set SSR-merkers gaf blijk van betrouwbare individuele identificatie met een lage waarschijnlijkheid van het voorkomen van identieke espengenotypes (minimaal en 1 × 10-4 voor onverwante en verwante individuen, resp.). Er worden casestudies beschreven die praktische toepassingen van het testsysteem aantonen, waaronder een analyse van de klonale structuur en het niveau van genetische diversiteit in drie natuurlijke espenopstanden die groeien in de regio’s waar plantages van elite-klonen werden aangelegd.

1. Inleiding

De voortdurende aantasting van inheemse bossen wereldwijd als gevolg van overexploitatie vereist de introductie van intensieve vormen van bosbouw die niet alleen het economisch effect maar ook het behoud van de genetische rijkdommen van houtachtige planten bevorderen. Deze taak verklaart het verkrijgen en instandhouden van elite genotypen van bosbomen gericht op snel-geroteerde bosplantages. Nieuwe cultivars en variëteiten met een hoge produktiviteit en die bestand zijn tegen abiotische factoren, plagen en ziekteverwekkers, verschijnen als resultaat van veredeling, selectie van mutaties, en/of genetische manipulatie. De klonale vermeerdering van dergelijke uitmuntende individuen garandeert de fixatie van hun nuttige eigenschappen zowel voor verdere veredelingsexperimenten als voor de aanleg van doelgerichte bosaanplantingen. Met name microklonale vermeerdering via in vitro cultuur maakt snel, grootschalig en kosteneffectief klonen van individuen met gewenste eigenschappen mogelijk, vooral wanneer traditioneel toppen of enten onmogelijk is of speciale inspanningen vereist.

Omdat morfologisch en anatomisch verschillende klonen van planten op elkaar kunnen lijken, is het van essentieel belang om deze op betrouwbare wijze te identificeren, inclusief onderscheid van elkaar en van soortgenoten of vertegenwoordigers van andere nauw verwante soorten. In de bosbouw is het probleem van de individuele identificatie bijzonder cruciaal aangezien het uiterlijk van bomen sterk afhankelijk is van milieuparameters. In bepaalde stadia van de natuurlijke ontogenese van bosbomen, bijvoorbeeld zaailingen en jonge boompjes, en vooral als eelt of explantaten in vitro celkweek, kunnen individuen niet alleen individueel, maar ook wat de soortendiagnose betreft, niet meer te onderscheiden zijn. De lange generatietijd en de ontogenetisch late rijping maken de taak van genetische paspoortering van eliteklonen bij houtachtige planten reëel. Het complexe meerfasenproces van het verkrijgen, vermeerderen en introduceren van elitecultivars door veredeling of genetische manipulatie verhoogt de kans op verschillende fouten.

Moleculair genetische merkers (MGM) bleken zeer efficiënte hulpmiddelen te zijn voor individuele identificatie. Van de verschillende MGM-klassen voldoen microsatellieten of simple sequence repeats (SSR) het best aan de eisen van testsystemen voor identificatie vanwege hun specificiteit, codominantie, selectieve neutraliteit, voldoende allelrijkdom en heterozygositeit als gevolg van een hoog mutatiepercentage. Bovendien kunnen SSR-merkers en PCR-primers voor de amplificatie ervan van het ene taxon op het andere worden overgedragen, omdat het genoom binnen de plantengeslachten en -families relatief weinig behouden blijft.

In verschillende populierensoorten is de succesvolle DNA-fingerprinting en differentiatie van klonen, cultivars en variëteiten aangetoond met moleculaire merkers, waaronder SSR-loci.

In dit artikel wordt verslag gedaan van de ontwikkeling van een op SSR gebaseerd testsysteem voor moleculair-genetische identificatie van elite microvermeerderde genotypen van esp, Populus tremula L., gericht op de aanleg van snelgroeiende doelbosplantages in verschillende regio’s van de Russische Federatie en presenteren de resultaten van de toepassing ervan voor individuele genotypes discriminatie, studies van klonale structuur in natuurlijke aspenopstanden, en de schatting van genetische variabiliteit in populaties.

2. Materiaal en Methoden

De ontwikkeling van het testsysteem voor de identificatie van elite-genotypes omvatte de selectie van een specifieke merkerset die aan de vereisten van hoge-resolutie discriminatie van klonen voldeed en het testen van de betrouwbaarheid en het identificatievermogen ervan op een set elite-genotypes en een voldoende aantal vertegenwoordigers van een bestudeerde soort.

2.1. Plantaardig materiaal

Elite espen en hybride klonen gebruikt voor de ontwikkeling van testsystemen voor moleculaire identificatie werden verkregen uit microvermeerderde celculturen onderhouden in de Poesjtsjino tak van het Shemyakin en Ovchinnikov Instituut voor Bioorganische Chemie, Russische Academie van Wetenschappen (Poesjtsjino, Rusland). Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.

Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.

Figuur 1

Map van de ligging van plantages van elite-klonen en overeenkomstige inheemse aspenopstanden die als referentiepopulaties werden gebruikt. (1) Prisady, (2) Voronezh, en (3) Yoshkar-Ola.

Prisady. Proefveld gelegen 1 km ten westen van de nederzetting Prisady in Serpukhovsky Raion (district) van Moskou oblast’ (Rusland). De bladeren van 52 jonge of middeloude (ongeveer 10-25 jaar) espenbomen uit een natuurlijke meerjarige opstand die zich in de onmiddellijke nabijheid (1 km) van dit perceel bevindt, zijn gebruikt als referentiepopulatie.

Voronezh. Zeventien bomen zijn bemonsterd in een opstand die grenst aan het proefperceel in Voronezh Oblast. Nog eens 13 bomen zijn verzameld langs de oever van de rivier de Voronezh in de stad Voronezh, dicht bij de aanplanting.

Yoshkar-Ola. Jonge inheemse opstand van esp was de bron van bomen die werden gebruikt als referentiepopulatie voor een experimenteel perceel in de buurt van de stad Yoshkar-Ola, Republiek Mari-El. Er werden bladeren verzameld van 32 bomen.

Om te voorkomen dat af en toe individuen worden bemonsterd die vegetatief van oorsprong zijn (door uitlopen), verzamelden we bladeren van bomen op een afstand van niet minder dan 15-20 m van elkaar. Deze aanpak werd toegepast voor de opname in referentiemonsters van overwegend open bestoven zaailingen met maximale genetische diversiteit. Uitsluitend op basis van het uiterlijk van de bomen en de onderlinge afstand kon echter niet worden vermeden dat rameten werden bemonsterd die als gevolg van scheutvorming waren ontstaan, hetgeen door latere genetische analyse werd bevestigd.

Scheuten met bladeren werden afgesneden met behulp van een mechanische snijmachine met een aluminium telescopische mast. Verzamelde scheuten met bladeren werden in plastic zakken geplaatst gedurende niet meer dan 6 dagen bij 4°С tot verwerking. De monstervoorbereiding omvatte DNA-extractie en het plaatsen van reserve bladweefselfragmenten in geëtiketteerde zip-zakken met silicagel voor langdurige opslag. Buiten de periode van actieve vegetatie, kunnen slapende vegetatieve knoppen met succes worden gebruikt voor DNA-extractie.

2.2. DNA-extractie

Bladerfragmenten van ongeveer 350-500 mg, genomen van explantaten die in vitro groeien op een speciaal medium (REF) in petrischaaltjes, werden gebruikt voor DNA-extractie.

Voor bomen uit inheemse populaties hebben we DNA geëxtraheerd uit 350-500 mg fragmenten vers of 200-300 mg in silica gedroogd bladweefsel met een gemodificeerde cethyltrimethylammoniumbromide (CTAB) methode.

2.3. Microsatellietanalyse

Microsatellieten, of SSR, vormen een klasse van tandemlys herhaalde DNA-sequenties met korte (1-6 paren nucleotiden, bp) motieven waarvan het aantal kopieën tussen individuen verschilt als gevolg van een hoge mutatiesnelheid. Meervoudige allelen die gewoonlijk in codominante microsatelliet loci worden aangetroffen, creëren een grote verscheidenheid van unieke genotypische combinaties, waardoor een betrouwbare identificatie mogelijk is, vooral wanneer een voldoende aantal loci wordt gebruikt. Technisch gezien is voor de analyse van SSR-polymorfisme alleen een polymerasekettingreactie (PCR) nodig en vervolgens elektroforese (gel of capillair) voor fragmentanalyse. Voor de ontwikkeling van het testsysteem hebben wij gekozen voor de variant van de methode die slechts gebruik maakt van basisuitrusting en eenvoudige reagentia. Dit garandeert een grotere reproduceerbaarheid van de procedures in elk PCR laboratorium en maakt het mogelijk een hoge kosteneffectiviteit van de analyse te bereiken, wat cruciaal is voor grootschalige praktische kloonidentificatie.

Omdat er een aanzienlijk aantal nucleaire SSR loci voor populieren werd gevonden in de literatuur en primer databases, besloten we uit verschillende publicaties primers te selecteren en te testen die gebruikt kunnen worden voor routinematige genotype-identificatie op basis van zeer eenvoudige apparatuur zonder gebruik van DNA-analysers. Een eerste reeks SSR-primers voor hun potentieel gebruik als elementen van het testsysteem voor moleculaire identificatie in esp was het resultaat van opzoekingen in bibliografische databanken (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) en in Molecular Ecology Resources Primer Database (http://tomato.bio.trinity.edu/).

DNA-amplificatie werd uitgevoerd met PCRCore kits (Isogen Laboratories, Ltd., Moskou, Rusland) in BioRad Inc. (USA) Dyad Thermo cycler. Microsatelliet loci (opgesomd in tabel 2) van series ORPM en WPMS werden geamplificeerd met specifieke primers bij een concentratie van 1 mmol/mL en 5-10 ng doel-DNA met gebruikmaking van het volgende temperatuurprofiel: (1) initiële denaturatie bij 94°С gedurende 3 min; (2) 30 cycli bestaande uit 30 sec. denaturatie bij 94°С, annealing van de primer bij variabele temperatuur en tijd (zie tabel 3 voor de aanbevolen eindtemperatuur voor annealing na aanpassing van de procedure), en elongatie bij 72°С gedurende 1,5 min. gevolgd door (3) eindelongatie bij 72°С gedurende 10 min. en (4) afkoeling van het PCR-mengsel tot 4°С.

PCR-producten werden onderworpen aan elektroforese in 6% polyacrylamide gelblokken met gebruikmaking van Tris-EDTA-boraat buffersysteem. Nadat de elektroforese gels waren gekleurd in ethidiumbromide oplossing en gevisualiseerd in UV-licht, werden grafische beelden vastgelegd en opgeslagen met behulp van Doc-Print II Vilber Lourmat gel documentatie systeem en verwerkt in grafische editors. De fragmentgrootte werd geschat met behulp van gespecialiseerde software (Photo-Capt). DNA van E. coli plasmide pBR322, beperkt door endonuclease HpaII werd gebruikt als een moleculaire gewicht marker.

2.4.

2.4. Statistische analyse

De identiteit van de kloon werd bepaald met behulp van multilocus-match-analyse voor codominante gegevens. De genotypekans (GP), d.w.z. de waarschijnlijkheid dat een bepaalde multilocuscombinatie in de populatie voorkomt, en de identiteitskans, d.w.z. de waarschijnlijkheid dat twee niet-verwante (PI) of verwante (PIsib) individuen door een bepaalde set loci willekeurig overeenkomen, werden berekend op basis van de verdeling van de allelfrequenties in de populatiemonsters.

De overeenstemming van de waargenomen genotypeverdelingen voor elke SSR-locus met de verwachte volgens het Hardy-Weinberg-evenwicht werd getest met behulp van het chi-kwadraatcriterium. Allele aantal en waargenomen en verwachte heterozygositeiten werden berekend voor elk inheems monster. De F-statistiek van Wright werd gebruikt om de genetische onderverdeling van de bestudeerde populatiemonsters te beoordelen. Alle bovengenoemde berekeningen werden uitgevoerd in de invoegtoepassing voor MS Excel, GenAlEx 6.5.

3. Resultaten en discussie

3.1. Ontwikkeling van SSR-gebaseerde testsystemen voor genotype-identificatie in Aspen

Voor de eerste testen selecteerden we 33 heterologische tri-, tetra-, penta-, en hexanucleotide microsatelliet loci uit twee sets; serie ORPM werd eerst ontworpen voor Populus trichocarpa en serie WPMS werd ontworpen voor Populus nigra . De kenmerken van deze loci zijn vermeld in tabel 2. Initiële testen werden uitgevoerd op DNA stalen van drie klonen (47-1, PtV22 и С-control) uit een in vitro collectie opgeslagen en vermeerderd in de Poesjtsjino tak van het Shemyakin en Ovchinnikov Instituut voor Bioorganische Chemie, Russische Academie van Wetenschappen (Poesjtsjino, Moskou Oblast, Rusland). In dit stadium werd hun variabiliteit ook getest op 20-24 specimens van wilde espen uit Novosibirsk Oblast (West-Siberië, Rusland) en Krasnoyarsk Krai (Midden-Siberië, Rusland).

Als resultaat van de eerste testfase werden 24 loci met succes geamplificeerd en leverden negen andere loci geen PCR-producten op. Van de 24 loci die PCR-fragmenten produceerden, bleken 20 loci variabel te zijn met een aantal allelen van twee tot negen, terwijl vier loci die met succes werden geamplificeerd monomorf waren (tabel 3). Na aanvullende tests met variabele PCR-regimes selecteerden wij uiteindelijk 14 loci met betrouwbare amplificatie en een aanzienlijk polymorfismeniveau voor opname in het testsysteem voor moleculair-genetische identificatie. Voorbeelden van de variabiliteit van de geselecteerde microsatelliet loci in espen worden getoond in Figuren 2(a) en 2(b).

(a)

(a)

(b)

(b)

(a)
(b)

Figuur 2

(a) Elektroforetische patronen van PCR-geamplificeerde SSR-loci ORPM202, ORPM206, ORPM220, ORPM296, en ORPM312 in espen. Loci: lanen 1-4: ORPM202; lanen 6-9: ORPM206; lanen 10-13: ORPM220; monsters: 1, 6, 10, 15, en 19, espen van inheemse populatie; 2, 7, 11, 16, en 20, kloon С-control; 3, 8, 12, 18, en 21, kloon 47-1; 4, 9, 13, 18, en 22, kloon PtV22. Lijnen 5, 14 en 23: DNA-molecuulgewichtmerker (DNA van E. coli-plasmide pBR322, verteerd met restrictie-endonuclease HpaII). (b) Elektroforetische patronen van de met PCR vermeerderde SSR-loci WPMS15, WPMS17, WPMS18, WPMS19, WPMS21 en WPMS22 in espen. Loci: lanen 1-4: WPMS15, lanen 6-9: WPMS17, lanen 10-13: WPMS18, lanen 15-18: WPMS19, lanen 19-22: WPMS21, en lanen 24-27: WPMS22. Monsters: 1, 6, 10, 15, 19, en 24, espen van natuurlijke populatie; 2, 7, 11, 16, 20, en 25, kloon С-control; 3, 8, 12, 16, 21, en 26, kloon 47-1; 4, 9, 13, 18, 22, en 27, kloon PtV22. Lijnen 5, 14 en 23, DNA-moleculaire gewichtsmarker (DNA van E. coli-plasmide pBR322, gedigestreerd met restrictie-endonuclease HpaII).

De verkregen multilocus genotypes van acht elite-klonen en referentie-genotypes van wilde bomen uit inheemse opstanden staan vermeld in tabel S1 in het aanvullend materiaal dat online beschikbaar is op http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. We analyseerden maximaal 8 ramets die in verschillende fasen van de microklonale vermeerdering werden bemonsterd. Binnen de klonen waren de genotypen stabiel en ondubbelzinnig gereproduceerd onder de ramets, onafhankelijk van het stadium van vermeerdering. Na uitsluiting van ramets van hetzelfde genetische materiaal waren zowel elite-klonen als aspengenotypes van inheemse populaties die deel uitmaakten van de referentiemonsters 100% verschillend. De waarschijnlijkheid van het voorkomen van genotypes (GP: genotype probability) bij elite klonen varieerde van 2,4 – 10-21 tot 1,7 – 10-11, bij bomen in een referentiemonster van 4,0 – 10-24 tot 5,8 – 10-9. De waarschijnlijkheid dat twee niet-verwante genotypen (PI: probability of identity) toevallig samenvallen, varieerde van 4,8 – 10-10 in Yoshkar-Ola tot 4,3 – 10-13 in Prisady. Aangepast aan de theoretische waarschijnlijkheid van afstamming van de vergeleken individuen van dezelfde voorouders lag de meer conservatieve schatting (PIsibs) binnen het bereik van 1,0 – 10-4 in Yoshkar-Ola tot 9,3 – 10-6 in Voronezh. Alle waarden zijn vrij laag, zodat de theoretische frequentie van het voorkomen van herhaalbare genotypes ten gevolge van recombinatie van verschillende gameten in de loop van de zaadreproductie niet hoger was dan ongeveer 1 toevallig gevonden identieke allelcombinatie op 10000 vergelijkingen. Het verband tussen PI en PIsibs met het aantal gebruikte loci wordt getoond in figuur 3 en toont aan dat de waarschijnlijkheid van het voorkomen van identieke genotypen praktisch verwaarloosbaar is bij gebruik van de eerste 7 tot 8 loci die voor opname in het testsysteem geselecteerd zijn. Het gebruik van alle 14 loci zorgt voor extra betrouwbaarheid en robuustheid van de procedure.

Figuur 3

Relatie van PI en PIsibs van het aantal gebruikte loci. 1 staat voor locus 1, 2 voor locus 1 + 2, enzovoort.

De ontwikkeling van microsatelliet loci voor soorten van het geslacht Populus begon aan het eind van de 20e eeuw, samen met technologieën voor moleculair-genetische markers. In 1998 werd een van de eerste sets primers voor de amplificatie van dinucleotide SSR loci ontworpen voor de Amerikaanse trembling populier, Populus tremuloides. In dit artikel werd een succesvolle kruisamplificatie van dezelfde merkers voor verschillende andere populierensoorten, P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis, en P. maximowiczii, aangetoond. De auteurs stelden ook het brede spectrum van toepassingen van SSR loci voor verschillende doeleinden, waaronder kloonidentificatie, analyse van gecontroleerde paringen, genoomkartering, merker-geassisteerde selectie, genetische diversiteitstests, en ondersteuning van de programma’s voor behoud en duurzaam beheer van genetische bosrijkdommen. Latere studies leverden acht andere dinucleotide SSR loci op voor Populus tremuloides. Sindsdien werden microsatelliet loci ontwikkeld voor andere soorten waaronder P. nigra . Sommige van deze loci werden ook geamplificeerd in P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans, en P. lasiocarpa. Specifieke SSR loci primers werden ontworpen voor Populus euphratica . Later werd deze set gebruikt voor de ontwikkeling van multiplex panels die gebruikt worden voor de schatting van de genetische diversiteit in deze soort.

Next generation sequencing was de meest efficiënte manier om tandem herhalingen in het populierengenoom op te sporen en op hun basis overdraagbare SSR primers te ontwerpen, zoals werd aangetoond in het geval van de balsamico populier, Populus trichocarpa . Dergelijke universele gekruiste-amplificeerde loci worden gebruikt voor soort en hybride identificatie en voor de schatting van genetische differentiatie tussen soortgenoten

Microsatellieten zijn ook nuttig voor het controleren van somaclonale diversiteit binnen een pool van ramets verkregen door microklonale vermeerdering van een enkele donorboom , voor de identificatie van individuele klonen in een aspect van hun tolerantie voor omgevingsfactoren . We hebben geen variatie waargenomen in SSR patronen tussen ramets van dezelfde elite klonale lijn. Nucleaire microsatellieten worden samen met andere klassen moleculaire merkers ook gebruikt voor het bepalen van de ploïdie in populieren, en wij hebben bij verschillende genotypen aanwijzingen gevonden voor triploïdie. Triploïde aspenhybriden vertonen vaak een verhoogde groeikracht en resistentie tegen ziekteverwekkers, zodat deze kwestie verder moet worden bestudeerd door middel van karyologische en drijvende cytometrieanalyse.

3.2.

3.2. Analyse van de klonale structuur in inheemse espenopstanden

Vanaf het moment van de veldbemonstering van materiaal in wilde opstanden hebben we getracht te vermijden dat klonale ramets die als scheuten zijn ontstaan, zouden worden meegenomen, wat gebruikelijk is bij espen. In alle bestudeerde opstanden is hetzelfde bemonsteringsschema toegepast met een afstand van ten minste 15-20 m tussen de bomen. Niettemin werden in alle bestudeerde natuurlijke populaties ramets van dezelfde kloon aangetroffen, wat wijst op een gemeenschappelijk voorkomen van vegetatieve vermeerdering (tabel S1).

Prisicovorming. Onder de 52 bestudeerde bomen vonden we 41 verschillende haplotypes; één multilocus genotype werd negen keer gevonden en één werd drie keer gevonden. We concludeerden dat deze herhaalde multilocus-combinaties het gevolg waren van het feit dat de bemonsterde scheuten ramets van dezelfde kloon waren.

Voronezh. Bij 17 bomen die dicht bij de plaats van de experimentele aanplanting werden verzameld, werden geen klonale individuen gevonden. Dertien bomen die aan de oever van de Voronezh-rivier werden verzameld, werden vertegenwoordigd door acht genotypen: vier daarvan bevonden zich in één replicaat, drie bleken twee ramets van dezelfde kloon te zijn, en één genotype werd aangetroffen in drie exemplaren die duidelijk afkomstig waren van het uitlopen van ooit bestaande stamouders. In totaal identificeerden we 25 verschillende haplotypen in dit monster van de referentiepopulatie.

Yoshkar-Ola. Tweeëndertig geanalyseerde bomen werden gecombineerd tot 13 verschillende haplotypen, geïdentificeerd door multilocus matches analyse; één genotype kwam twee keer voor, één genotype vijf keer, één genotype zeven keer, en één genotype negen keer. Herhaalde genotypen kwamen duidelijk overeen met ramets die het resultaat waren van scheutvorming.

Wij concludeerden dat scheutvorming en een hoge mate van klonaliteit een wijdverbreid fenomeen zijn in inheemse espenopstanden. In esp, evenals in veel andere populieren, zijn vegetatieve klonen in staat om grote gebieden in te nemen. Daarom moeten voor het verzamelen van een monster zonder herhaalde klonale genotypen de afstanden tussen de bomen worden vergroot tot ten minste 40-50 m. Een nauwkeuriger schatting van de maximale verspreiding van een enkele kloon over het gebied van de opstand vereist echter ook speciaal onderzoek.

Nucleaire SSR-loci waren, naast andere toepassingen, nuttig voor het onderzoek naar de klonale structuur en de genetische relaties tussen kloongenotypen in inheemse opstanden of tussen inheemse en kunstmatige opstanden. Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.

3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability

All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).

The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.

Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . De niveaus van genetische diversiteit binnen populaties die door ons werden waargenomen in inheemse espenopstanden lagen binnen het bereik van de waarden die gewoonlijk worden waargenomen bij populieren en die werden geschat door SSR loci analyse (en referenties daarin).

Een aanzienlijk aantal studies waarbij gebruik werd gemaakt van microsatellietentechniek was gericht op de detectie van hybridisatie in natuurlijke of kunstmatige opstanden van populieren. SSR loci helpen om mechanismen van interspecifieke kruising en voortplantingsisolatie te onthullen. In deze studie hebben wij ons meer geconcentreerd op de variatie tussen individuen en tussen populaties dan op interspecifieke verschillen, maar voor sommige van de bestudeerde elite-klonen zou hun hybride oorsprong genetisch moeten worden getest met behulp van een complexe reeks merkers, maar met een nucleaire en cytoplasmatische lokalisatie. De identificatie van interspecifieke hybriden en industriële klonen met hoge getrouwheid werd gerapporteerd in een aanzienlijk aantal publicaties. Een opmerkelijke publicatie rapporteert over de genetische identiteit van enkele industriële klonen van populieren die voorheen als verschillend werden behandeld.

De praktische taak van identiteitscontrole van commerciële klonen in in vitro collecties was vergelijkbaar met die in het huidige onderzoek. In alle toepassingen waar betrouwbare individuele identificatie vereist was, toonden SSR’s een hoge effectiviteit.

4. Conclusie

Toepassing van nucleaire microsatelliet loci voor genetische identificatie en beoordeling van genetische variabiliteit in aspen elite klonen en inheemse opstanden toonde een hoge effectiviteit van het ontwikkelde low-cost SSR-gebaseerde testsysteem. Betrouwbare authenticatie van klonen verzekert genetische controle van microklonale vermeerdering en maakt het mogelijk om klonaliteit in inheemse opstanden te onthullen. We toonden aan dat dezelfde set microsatelliet loci met succes kan worden gebruikt voor het schatten van de genetische variabiliteit binnen en tussen populaties in espen. Reconstructie van verwantschap tussen individuele elite klonen of genetische relaties van natuurlijk parende populaties zijn taken die in de toekomst met behulp van dezelfde merkers gerealiseerd kunnen worden.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Acknowledgments

Dit onderzoek wordt ondersteund door het Ministerie van Onderwijs en Wetenschap van de Russische Federatie (Project nr. 14.607.21.0044 van 22.08.2014; unieke identificatiecode RFMEFI60714X0044). De auteurs danken ook E. M. Romanov, A. I. Shurgin, R. V. Sergeev (Volga State University of Technology, Yoshkar-Ola, Republic of Mari El, Rusland), M. V. Drapaluk, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikov, E. O. Kolesnikova (Voronezh State Forestry Engineering University, Voronezh, Rusland), en G. B. Kolganikhina (Institute of Forest Science RAS, Uspenskoe, regio Moskou, Rusland), voor hun hulp bij het verzamelen van monsters in inheemse opstanden. De auteurs zijn ook M. Zeps, D. Auzenbaha, en A. Gailis (Latvian State Forest Research Institute “Silava,” Salaspils, Letland) dankbaar voor het delen van biologisch materiaal en informatie over aspen elite klonen.

Aanvullend materiaal